飼料中添加酵母培養(yǎng)物對大口黑鱸生長、腸道健康和免疫力的影響

陳 潯 韓 冬駱作勇張月星張志敏劉昊昆金俊琰楊云霞朱曉鳴解綬啟

(1.浙江海洋大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,國家海洋設(shè)施養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心,舟山 316022;2.中國科學(xué)院水生生物研究所淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點實驗室,武漢 430072;3.達農(nóng)威生物發(fā)酵工程技術(shù)(深圳)有限公司,深圳 518000)

大口黑鱸(Micropterus salmoides)是一種溫水肉食性魚類,具有適應(yīng)能力強、生長速度快、對溫度的適應(yīng)范圍較廣和肉質(zhì)鮮美等優(yōu)點,是我國淡水魚養(yǎng)殖的主要品種之一。2021年,我國淡水養(yǎng)殖鱸魚產(chǎn)量已經(jīng)達到70.2萬噸[1]。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴大,其飼料需求量也在不斷攀升。大口黑鱸飼料蛋白需求高,多以魚粉蛋白為主。在魚粉供不應(yīng)求,價格居高不下的情況下,植物蛋白替代魚粉擁有非常好的前景,豆粕、發(fā)酵豆粕和棉籽濃縮蛋白等植物蛋白源替代魚粉已有較多研究[2,3]。但植物蛋白替代魚粉可能會帶來對大口黑鱸健康與免疫方面的壓力[4]。此外,隨著養(yǎng)殖規(guī)模和養(yǎng)殖密度的逐步提高,大口黑鱸在抗病及環(huán)境脅迫方面面臨的挑戰(zhàn)越發(fā)嚴重。

酵母培養(yǎng)物“水產(chǎn)益康”是在特定工藝條件下由酵母菌在特定的培養(yǎng)基上經(jīng)過厭氧發(fā)酵后形成的微生態(tài)制品,它主要由酵母細胞外代謝產(chǎn)物、酵母細胞和經(jīng)過發(fā)酵后的培養(yǎng)基構(gòu)成,富含核苷酸、植物甾醇、甘露寡糖和有機酸等活性物質(zhì)。在異育銀鯽(Carassius auratus gibelio)[5]、草魚(Ctenopharyngodon idellus)[6]、黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)[7]和凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)[8]等水產(chǎn)動物中的研究表明,飼料中添加酵母培養(yǎng)物可改善腸道健康,增強機體抗氧化和免疫力。在大口黑鱸飼料中添加1%和3%的酵母培養(yǎng)物能提高大口黑鱸的生長性能,改善高淀粉和高植物蛋白飼料對肝臟和腸道的損傷[9,10]。但是在水產(chǎn)動物中酵母培養(yǎng)物添加帶來的作用效果和劑量效應(yīng)相差較大,深層次的水產(chǎn)動物生理學(xué)反應(yīng)和原因也有明顯差別。

本實驗以大口黑鱸為養(yǎng)殖對象,在飼料中添加不同濃度的酵母培養(yǎng)物進行養(yǎng)殖實驗,探究酵母培養(yǎng)物對大口黑鱸生長性能、腸道結(jié)構(gòu)、腸道微生物、免疫力和嗜水氣單胞菌攻擊后累計存活率等方面的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗飼料

本實驗選用魚粉和雞肉粉為主要蛋白源,以大豆油為主要脂肪源,配制粗蛋白含量為52%,粗脂肪含量為8.5%的實驗飼料(表1)。實驗飼料分為3組,第1組為對照組(Con組),并在對照組基礎(chǔ)上分別添加0.1%和0.3%的酵母培養(yǎng)物“水產(chǎn)益康”作為0.1%添加組(S1)和0.3%添加組(S2)兩個實驗組。飼料配制前,原料粉碎后過80目篩,將酵母培養(yǎng)物“水產(chǎn)益康”對照組(0添加,Con)、1 g/kg (S1)和3 g/kg(S2)的添加量用面粉逐級稀釋,并將其他的添加劑混勻后于大料逐級充分混勻,用適量水混膨化機制成粒徑為4 mm的顆粒飼料,并于70℃烘干,放置于冷庫保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 飼料配方及化學(xué)組成(%干物質(zhì))Tab.1 Formulation and chemical composition of the experimental diets (% dry matter)

1.2 實驗魚和飼養(yǎng)方法

大口黑鱸進行為期2周的暫養(yǎng),正式實驗之前24h停止投喂。養(yǎng)殖實驗在池塘網(wǎng)箱(湖北石首市老河長江四大家魚原種場,網(wǎng)箱規(guī)格為2 m×2 m×2 m)中進行,共設(shè)3個處理,每個處理設(shè)3個重復(fù),每個網(wǎng)箱放置40尾魚,生長實驗持續(xù)11周,每天飽食投喂2次(6:30—7:30,17:00—18:00)。整個實驗均在自然光照周期及溫度條件下進行,水溫(28.76±1.56)℃,溶解氧大于6 mg/L,氨氮含量為0.20—0.80 mg/L,pH為6.5—7.0。

1.3 樣品采集

實驗開始前選取規(guī)格相近的3組實驗魚作為初樣,貼好標(biāo)簽放于-20℃冰箱備用。養(yǎng)殖實驗結(jié)束前7h停止投喂,取樣當(dāng)天將實驗魚全部撈出,用MS-222麻醉后稱重計數(shù),主要測定增重率、特定生長率等。每個網(wǎng)箱取3尾魚進行體長、體重測量,用肝素鈉抗凝劑潤過的無菌注射器進行尾部靜脈采血,并解剖肝臟稱重以計算肝體比。血液4℃,3500×g離心10min后得到血漿,保存于-80℃。同時,在冰上取頭腎、肝臟的酶活樣品及腸道微生物,置于液氮中速凍并于-80℃保存;腸道組織用4%的多聚甲醛固定液固定做腸道HE切片。

1.4 攻毒實驗

取嗜水氣單胞菌接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基進行菌苗的復(fù)壯,挑取少量菌落于培養(yǎng)基中,30℃培養(yǎng)后,用滅菌生理鹽水清洗,4000 r/min離心5min,收集菌體稀釋不同濃度,進行攻毒預(yù)實驗,確定半致死的嗜水氣單胞菌液濃度。

養(yǎng)殖實驗終末取樣同時,每個網(wǎng)箱取10尾實驗魚注射半致死濃度的嗜水氣單胞菌液。用無菌注射器從肛門前5 mm向腹腔內(nèi)注射,注射量根據(jù)體重來確定,記錄84—276h的各網(wǎng)箱死亡魚的數(shù)量,每隔12h記錄一次并計算存活率。

累計存活率計算公式: 累計存活率(%)=(累計存活魚總數(shù)/起始魚總數(shù))×100。

1.5 腸道微生物

腸道微生物由深圳華大基因科技服務(wù)有限公司檢測。

腸道菌群總DNA的提取準(zhǔn)備5塊96孔深孔板,分別加入600 μL Buffer磁珠結(jié)合液+20 μL蛋白酶K+5 μL RNase A、700 μL Wash 1、700 μL Wash 2、700 μL Wash 3、100 μL Elution Buffer;取100—200 mg樣品至裝有研磨珠的離心管中,加入1 mL Buffer ATL/PVP-10,于高速研磨儀上研磨樣品后至于65℃孵育裂解20min;14000×g離心5min;將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中,加入0.6 mL Buffer PCI,旋渦混勻15s;12000 r/min離心10min,將上清轉(zhuǎn)移至加有磁珠結(jié)合液的深孔板中;啟動Kingfisher選擇對應(yīng)程序,將各個深孔板放于儀器對應(yīng)位置,運行程序;在程序結(jié)束后,將Elution Buffer深孔板中DNA溶液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中保存。

DNA文庫擴增取一定量的基因組DNA,配制相應(yīng)的融合引物反應(yīng)體系,并設(shè)置反應(yīng)程序進行PCR擴增。將PCR產(chǎn)物變性為單鏈后,配制環(huán)化反應(yīng)體系,并設(shè)置反應(yīng)程序,得到單鏈環(huán)形產(chǎn)物,消化掉未被環(huán)化的線性DNA分子。單鏈環(huán)狀DNA分子通過滾環(huán)復(fù)制,形成一個包含多個拷貝的DNA納米球(DNB)。將得到的DNBs采用高密度DNA 納米芯片技術(shù),加到芯片上的網(wǎng)狀小孔內(nèi),通過聯(lián)合探針錨定聚合技術(shù)(cPAS)進行測序。

腸道微生物擴增子分析將能匹配到引物的reads,用軟件cutadapt v2.6截取掉引物和接頭污染,得到目標(biāo)區(qū)域的片段;采取按窗口去低質(zhì)量的方法: 設(shè)置30 bp為窗口長度,如果窗口平均質(zhì)量值低于20,從窗口開始截除read末端序列,移除最終read長度低于原始read長度75%的reads;去除含N的reads;去除低復(fù)雜度的 reads(連續(xù)10個ATCG),得到最終Cleandata。利用軟件USEARCH(v7.0.1090)將拼接好的Tags聚類為OTU。其主要過程如下: 利用UPARSE在97%相似度下進行聚類,得到OTU的代表序列;利用UCHIME(v4.2.40)將PCR 擴增產(chǎn)生的嵌合體從OTU代表序列中去除;使用usearch_global方法將所有Tags比對回OTU代表序列,得到每個樣品OTU豐度統(tǒng)計表。使用mothur(v.1.31.2)對單個樣品進行Alpha物種多樣性的分析,包括chao1指數(shù)、ace指數(shù)、shannon指數(shù)和simpson指數(shù)等。

1.6 樣品分析

頭腎組織采用考馬斯亮藍試劑盒測定組織勻漿液蛋白含量。血漿和頭腎組織勻漿液溶菌酶(LZM)活性、堿性磷酸酶(AKP)活性、超氧歧化物酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量和過氧化氫酶(CAT)活性均按照試劑盒說明書測定,所需試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

多聚甲醛保存的腸道組織固定24h后,用70%酒精沖洗,各級乙醇脫水,按常規(guī)進行石蠟包埋,HE染色,中性膠封藏后制成腸道組織切片。將組織切片置于光學(xué)顯微鏡觀察并拍照,利用Image pro plus 6.0軟件統(tǒng)計分析腸肌層厚度、絨毛長度及隱窩深度。

生長指標(biāo)計算公式如下:

增重率(Weight gain rate,WGR,%)=(末重-初重)/初重×100

特定生長率(Specific growth rate,SGR,%/d)=(ln末重-ln初重)/養(yǎng)殖天數(shù)×100

形體指標(biāo)計算公式如下:

肥滿度(Condition factor,CF,g/cm3)=(體重/體長3)×100

肝體比(Hepatosomatic index,HSI)=肝臟重/體重×100

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)的形式呈現(xiàn),實驗結(jié)果用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析(One-way ANOVA),之后使用Duncan’s法比較以上結(jié)果的差異顯著性,以P＜0.05為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 酵母培養(yǎng)物對大口黑鱸生長性能的影響

如表2所示,3個處理組大口黑鱸的增重率在146.33%—154.67%,特定生長率在1.15—1.19。與對照組相比,S1和S2兩組大口黑鱸的增重率和特定生長率均無顯著性差異(P＞0.05)。

表2 飼料添加酵母培養(yǎng)物“水產(chǎn)益康”對大口黑鱸生長性能的影響Tab.2 Effects of dietary yeast culture on growth performance of largemouth bass

2.2 形態(tài)學(xué)指標(biāo)

如圖1所示,對照組、S1添加組和S2添加組大口黑鱸的肥滿度平均值分別為2.37、2.34和2.39;肝體比平均值分別為2.29、2.13和2.03,隨酵母培養(yǎng)物“水產(chǎn)益康”的添加量上升有降低趨勢。肥滿度和肝體比在各組間均無顯著性差異(P＞0.05)。

圖1 飼料添加酵母培養(yǎng)物“水產(chǎn)益康”對大口黑鱸形體指標(biāo)的影響Fig.1 Effects of dietary yeast culture on physical indices of largemouth bass

2.3 腸道切片

HE染色結(jié)果(圖2)可見對照組黏膜層與固有層間出現(xiàn)空隙;與對照組相比,S2組腸絨毛表面紋狀緣光滑;腸絨毛形態(tài)規(guī)則,結(jié)構(gòu)清晰,更高且更密。與對照組相比,S2組隱窩深度為36.95 μm,降低了4.24%(P＜0.05);S2組絨毛長度為759.69 μm,較對照組增加但無顯著差異;S1組的肌層厚度均較對照組顯著下降(P＜0.05;圖3)。

圖2 酵母培養(yǎng)物“水產(chǎn)益康”對大口黑鱸腸道組織學(xué)的影響(HE染色)Fig.2 Effects of dietary yeast culture on intestinal histology of largemouth bass

圖3 酵母培養(yǎng)物“水產(chǎn)益康”對大口黑鱸腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響Fig.3 Effects of dietary yeast culture on intestinal morphology and structure of largemouth bass

2.4 腸道微生物

由圖4可知,在腸道微生物門水平上,與S1和S2兩組相比,對照組的腸道變形菌門(Proteobacteria)的菌群含量較低;而對照組腸道中藍藻門(Cyanobacteria)的含量最高,S1組和S2組依次降低。S1組的厚壁菌門(Firmicutes)含量較對照組下降,而在S2組較對照組上升。結(jié)合圖5可以看出,腸道內(nèi)厚壁菌門主要由梭菌綱(Clostridia)和芽孢桿菌綱(Bacilli)組成。其中,S2組的腸道梭菌綱最高,S1組次之,而對照組最低。芽孢桿菌綱的分布與之相反,其在腸道內(nèi)含量為由對照組、S1組到S2組依次降低。對照組腸道中梭桿菌門(Fusobacteria)含量最高,S1組的含量最低;結(jié)合圖6—8可以看出腸道內(nèi)梭桿菌門主要是索氏鯨桿菌屬(Cetobacterium)。索氏鯨桿菌可通過代謝產(chǎn)物乙酸激活副交感神經(jīng)系統(tǒng),從而促進魚類胰島素表達和糖利用能力。S1組和S2組的腸道擬桿菌門(Bacteroidetes)含量較對照組升高。疣微菌門(Verrucomicrobia)在對照組含量最高,在S1組和S2組依次降低。圖9是腸道微生物多樣性圖,S1組較對照組多樣性有所提高但沒有顯著性差異。

圖4 門水平腸道微生物組成柱狀圖Fig.4 Histogram of intestinal microbial composition-Phylum

圖5 綱水平腸道微生物組成柱狀圖Fig.5 Histogram of intestinal microbial composition-Class

圖6 目水平腸道微生物組成柱狀圖Fig.6 Histogram of intestinal microbial composition-Order

圖7 科水平腸道微生物組成柱狀圖Fig.7 Histogram of intestinal microbial composition-Family

圖8 屬水平腸道微生物組成柱狀圖Fig.8 Histogram of intestinal microbial composition-Genus

圖9 腸道微生物多樣性Fig.9 Intestinal microbial diversity

2.5 頭腎生化指標(biāo)

如圖10所示,S1組和S2組的頭腎超氧化物歧化酶活性相較對照組分別提高13.72%和23.70%,顯著高于對照組(P＜0.05);S2組的頭腎過氧化氫酶活性顯著高于對照組(P＜0.05),S1組和S2組的頭腎過氧化氫酶活性相較對照組分別提高8.21%和17.15%。S1組和S2組的頭腎堿性磷酸酶活性相較對照組分別提高33.67%和44.80%,顯著高于對照組(P＜0.05)。S1組和S2組的頭腎溶菌酶含量相較對照組分別提高32.29%和54.12%,S2組的溶菌酶含量顯著高于對照組(P＜0.05)。另外,頭腎中丙二醛含量在各組間均無顯著性差異(P＞0.05)。

圖10 酵母培養(yǎng)物“水產(chǎn)益康”對大口黑鱸頭腎生化指標(biāo)的影響Fig.10 Effects of dietary yeast culture on biochemical parameters of head kidney of largemouth bass

2.6 血漿生化指標(biāo)

如圖11所示,S1組和S2組的血漿超氧化物歧化酶活性相較對照組分別增加了19.61%和9.1%,S1組的血漿超氧化物歧化酶活性顯著高于對照組(P＜0.05)。S1組和S2組的血漿過氧化氫酶較對照組顯著升高(P＜0.05)。S1組和S2組的血漿溶菌酶含量相較對照組顯著提高(P＜0.05),分別提高了10.70%和7.28%。S2組血漿中堿性磷酸酶含量較對照組增加2.65%,丙二醛含量較對照組降低了19.56%,但均無顯著性差異(P＞0.05)。

圖11 酵母培養(yǎng)物“水產(chǎn)益康”對大口黑鱸血漿免疫指標(biāo)的影響Fig.11 Effects of dietary yeast culture on plasma biochemical parameters of largemouth bass

2.7 攻毒累計存活率

如圖12所示,在嗜水氣單胞菌攻擊后,兩實驗組的累計存活率較對照組升高,在252h以后有顯著差異(P＜0.05)。與對照組相比,S1組、S2組的276h累計存活率分別提高了23.81%和19.05%,顯著提高了大口黑鱸嗜水氣單胞菌攻擊后的存活率。

圖12 酵母培養(yǎng)物“水產(chǎn)益康”對大口黑鱸嗜水氣單胞菌攻擊276h后累計存活率的影響Fig.12 Cumulative survival rate of largemouth bass during 276h challenged withAeromonas hydrophila

3 討論

3.1 對大口黑鱸生長性能的影響

本實驗結(jié)果顯示,飼料中添加酵母培養(yǎng)物并未對大口黑鱸的生長有顯著影響。Zhou等[11]在大口黑鱸飼料中分別添加0.1%和0.2%的酵母水解物,對大口黑鱸的生長無顯著影響。易婉婷等[12]在大口黑鱸飼料添加1%酵母水解物后對其生長同樣無影響。也有研究表明因為含有β-葡聚糖和甘露寡糖等活性成分,酵母培養(yǎng)物在較大濃度添加時對魚類生長有促進作用[13—15]。高淀粉大口黑鱸飼料中添加3%的酵母培養(yǎng)物顯著提高其特定生長率[10]。在斑點叉尾鮰(Ictalurus punctatus)飼料中分別添加0.5%、1%和2%的酵母培養(yǎng)物能顯著提高生長性能[16]。在珍珠龍膽石斑魚(Epinephelus fuscoguttatus♀×Epinephelus lanceolatu♂)飼料中分別添加2%和4%的酵母培養(yǎng)物,結(jié)果表明添加4%時,兩種酵母培養(yǎng)物均提高了珍珠龍膽石斑魚的生長性能,但添加2%含非蛋白氮的酵母培養(yǎng)物時并沒有顯著影響[17]。而在草魚中,8%—16%的酵母培養(yǎng)物替代均能顯著提高草魚的生長性能,當(dāng)替代達到12%時,對草魚的生長性能提升效果最佳[18]。飼料中添加0.1%的活酵母提高了尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)的生長性能,但添加同計量的滅活酵母并沒有顯著影響[19]。本實驗中酵母培養(yǎng)物“水產(chǎn)益康”的添加量為0.1%和0.3%,對大口黑鱸生長沒有顯著影響,可能是因為實驗魚種類不同和酵母培養(yǎng)物添加量較小及酵母培養(yǎng)物生產(chǎn)工藝不同導(dǎo)致的。

3.2 對大口黑鱸腸道組織結(jié)構(gòu)方面的影響

腸道是水產(chǎn)動物進行消化吸收的主要場所,它的形態(tài)結(jié)構(gòu)在一定程度上反映了動物的健康狀態(tài)。腸壁由內(nèi)向外分為黏膜層、肌層和漿膜層,黏膜層由黏膜上皮和固有層組成[20]。魚體腸道的蠕動主要依靠環(huán)肌的收縮,故其肌層厚度在一定程度上反映了魚體的消化能力。本研究結(jié)果顯示添加0.1%酵母培養(yǎng)物后大口黑鱸腸道肌層厚度較對照組顯著下降,這與 Chen等[21]在大口黑鱸中的研究結(jié)果相似。與對照組相比,在大口黑鱸飼料中添加0.2%核苷酸后降低其腸道肌層厚度,但是0.4%添加組升高。本研究中肌層厚度的降低可能對大口黑鱸的消化吸收方面產(chǎn)生一定影響。對照組鱸的腸道黏膜層出現(xiàn)黏膜上皮和固有層之間的脫落,在徐志強等[22]的研究中,植物蛋白替代飼料魚粉飼喂絲尾鳠(Hemibagrus wyckioides)后出現(xiàn)了固有層和肌層之間空隙,考慮是飼料配方植物蛋白含量較高的原因。腸道通過黏膜層向內(nèi)折疊形成腸絨毛,增大腸腔內(nèi)消化吸收的面積,因此腸絨毛高度反映了腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力。本研究結(jié)果表明添加0.3%的酵母培養(yǎng)物“水產(chǎn)益康”有提高大口黑鱸腸道絨毛高度的趨勢,在凡納濱對蝦[23]和珍珠龍膽石斑魚[17]中也有同樣的結(jié)果。在飼料中添加0.5%的酵母培養(yǎng)物顯著提高了凡納濱對蝦腸絨毛高度;在珍珠龍膽石斑魚中,添加2%和4%的酵母培養(yǎng)物均能提高其腸絨毛的高度。酵母培養(yǎng)物“水產(chǎn)益康”中含有核苷酸和甘露寡糖等活性成分,研究表明核苷酸能促進雛雞腸絨毛的生長[24],飼料添加0.03%核苷酸也明顯增加大西洋鮭(Salmo salar)腸道的褶皺高度[23]。而甘露寡糖能促進黏液分泌、保護腸絨毛,從而提高腸絨毛的整齊度和完整性[25]。隱窩深度反應(yīng)了絨毛細胞的生成率;隱窩變淺表明細胞成熟率上升,營養(yǎng)消化功能增強[26,27]。添加酵母培養(yǎng)物“水產(chǎn)益康”后,大口黑鱸腸道絨毛高度增加,隱窩深度減小,表明改善了大口黑鱸的腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)。

3.3 對大口黑鱸腸道微生物的影響

本研究表明各處理組大口黑鱸腸道中變形菌門、藍藻門、厚壁菌門、梭桿菌門和擬桿菌門為主要菌門。擬桿菌門和厚壁菌門存在一定關(guān)系,能共同促進宿主對能量的吸收的和儲藏[11]。Ley等[28]的報道表明擬桿菌門和厚壁菌門的比值變化與小鼠肥胖有關(guān),肥胖小鼠腸道內(nèi)的擬桿菌門增多而厚壁菌門減少。但本研究中可能由于擬桿菌門和厚壁菌門含量較低,所以沒有明顯影響。藍藻廣泛分布于各種水域,在攝食時隨水體進入魚體，其合成的毒素會損傷魚類肝臟、腸道和神經(jīng)系統(tǒng)。相較于對照組,兩實驗組腸道內(nèi)的藍藻門含量下降。Zhou等[11]在大口黑鱸飼料中添加0.1%和0.2%的酵母水解物,同樣發(fā)現(xiàn)大口黑鱸腸道內(nèi)藍藻含量下降,但對于酵母培養(yǎng)物降低大口黑鱸腸道內(nèi)藍藻含量的原因尚不清晰。TAMO(三甲胺-N-氧化物)是厚壁菌門梭菌綱下梭菌目(Clostridiales)的相關(guān)代謝產(chǎn)物,小鼠腸道中梭菌目的含量與血漿中TAMO含量高度正相關(guān)[29],它具有抗腫瘤和協(xié)助免疫治療的功能[30];而同為厚壁菌門的芽孢桿菌綱下葡萄球菌科(Staphylococcaceae)是常見的化膿性球菌,在增殖過程中可產(chǎn)生腸毒素。相比對照組,添加酵母培養(yǎng)物“水產(chǎn)益康”的S1組和S2組腸道微生物提高了梭桿菌含量并降低了葡萄球菌含量。本實驗結(jié)果表明酵母培養(yǎng)物添加改變了大口黑鱸腸道內(nèi)菌群結(jié)構(gòu),有利于大口黑鱸的腸道健康。

3.4 對大口黑鱸免疫及抗病力的影響

魚類的血漿生化指標(biāo)能反映魚體的生理和健康狀態(tài)[31];頭腎也是魚類非常重要的免疫器官,參與早期免疫反應(yīng)和早期免疫細胞的產(chǎn)生,在廣泛的免疫功能中發(fā)揮關(guān)鍵作用。溶菌酶是血液中一種重要的酶,它能通過攻擊細菌細胞壁中的肽聚糖而裂解細菌,具有抗菌活性[32]。相較對照組,S2組頭腎溶菌酶含量和AKP活性顯著增加,說明酵母培養(yǎng)物的添加可以提高魚體的免疫力。在對凡納濱對蝦的研究中也表明,飼料中添加0.3%—1%的酵母培養(yǎng)物均能顯著提高其血漿AKP活性和溶菌酶含量[8]。SOD和CAT是魚體內(nèi)重要的抗氧化酶,SOD可以催化氧自由基分解成過氧化氫,而CAT將過氧化氫還原為水和分子氧,從而清除體內(nèi)多余的氧自由基,維持機體的正常生理活動[33]。MDA是脂類物質(zhì)氧化應(yīng)激的終產(chǎn)物,反映了魚體氧化應(yīng)激受損的程度[34]。在本研究中,S2組降低了血漿MDA含量,提高了血漿SOD、頭腎SOD和CAT活性;已有報道表明,飼料中添加酵母培養(yǎng)物降低了異育銀鯽[5]血漿MDA含量,提高了黃顙魚[7]血漿SOD活性,增強了凡納濱對蝦[8]的抗氧化能力。添加酵母培養(yǎng)物后對于魚體抗氧化和免疫力的提高應(yīng)該是與酵母培養(yǎng)物中含有β-葡聚糖和甘露寡糖有關(guān)。已有報道表明酵母葡聚糖能提高大西洋鮭體內(nèi)溶菌酶含量[35],提高吉富羅非魚魚體SOD和CAT活性[36]。此外,酵母培養(yǎng)物含有的核苷酸,也已被報道能提高異育銀鯽魚體溶菌酶含量和AKP活性[37]。

嗜水氣單胞菌的攻毒實驗結(jié)果也印證了酵母培養(yǎng)物的添加提高了大口黑鱸的免疫力。本實驗結(jié)果顯示,飼料中添加0.1%和0.3%的酵母培養(yǎng)物均能提高大口黑鱸對嗜水氣單胞菌的抵抗力。已有研究報道,飼料中添加酵母培養(yǎng)物能提高凡納濱對蝦[38]和珍珠龍膽石斑魚[17]對弧菌的抗病力,在異育銀鯽飼料中添加酵母培養(yǎng)物也能提高異育銀鯽對CyHV-2病毒的抗病力[39]。酵母培養(yǎng)物含有活性成分核苷酸和β-葡聚糖,已有研究報道,飼料添加0.2%核苷酸提高了虹鱒(Oncorhynchus mykiss)對鰻弧菌攻毒后的存活率及大西洋鮭對傳染性貧血病毒ISA的抵抗力[40],在露斯塔野鯪(Labeo rohita)飼料中添加核苷酸也能提高其對嗜水氣單胞菌攻毒后的累計存活率[41]。飼料中添加β-葡聚糖可以增強對革蘭氏陰性魚類致病菌的識別,從而提高巨噬細胞對這些病原體的殺滅效率[42]。在飼料中添加β-葡聚糖提高了露斯塔野鯪幼魚在嗜水氣單胞菌攻毒后的存活率[43]。因此,實驗結(jié)果表明飼料中添加酵母培養(yǎng)物提高了大口黑鱸抗氧化能力和非特異性免疫力,增強其對嗜水氣單胞菌攻毒的抗病力。

4 結(jié)論

本研究探究了添加酵母培養(yǎng)物對大口黑鱸腸道菌群結(jié)構(gòu)和抗病力的影響。結(jié)果表明,飼料中添加0.1%—0.3%的酵母培養(yǎng)物有利于大口黑鱸的腸道健康,提高了其抗氧化能力和非特異性免疫力,提升了大口黑鱸嗜水氣單胞菌攻毒后的累計存活率。而酵母培養(yǎng)物對大口黑鱸免疫力和腸道健康的調(diào)控機制需要進一步研究。