氨氮脅迫對大口黑鱸幼魚組織結構、酶活及腸道微生物的影響

魏孟申鄭 濤, 路思琪強 俊, 陶易凡李 巖徐 跑,

(1.南京農業大學無錫漁業學院,無錫 214128;2.中國水產科學研究院淡水漁業研究中心,農業農村部淡水漁業和種質資源利用重點實驗室,無錫 214081)

氨氮是水產動物養殖水環境中的重要污染物之一,以離子氨和非離子氨的形式存在,非離子氨為主要毒性形式,能引起養殖動物攝食降低、生長緩慢、免疫力差等現象[1]。養殖用水多來自養殖地周邊河道,生活污水和工業廢水的排放會導致河水氨氮濃度嚴重超標。有研究顯示,受污染的河水氨氮濃度可達25 mg/L,嚴重的會超過40 mg/L[2,3]。

長期暴露在高氨氮環境會引起水生動物機體抗氧化系統失衡,引發免疫和代謝功能紊亂,最終造成肝、腸組織損傷[4]。氨氮脅迫能使魚體產生過量的活性氧自由基(ROS),導致機體產生氧化應激[5]。Yu等[6]對拉氏鱥(Rhynchocypris lagowskii)的研究顯示,氨暴露會顯著提高魚體MDA含量,增加SOD和CAT的活性,引起氧化應激。此外,相關研究表明,氨氮還能夠導致魚體GPT、GOT、LZM和補體C3等免疫相關指標變化[7,8],影響非特異性免疫能力。環境中高濃度氨氮能夠導致草魚(Ctenopharyngodon idell)、淇河鯽(Carassius auratus)和黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)等魚類臟器細胞出現核溶解和空泡化等現象,造成組織損傷[9—11]。

腸道是機體消化吸收的主要場所,腸道菌群對宿主的免疫應答和內環境的穩定具有重要意義[12]。水體環境的改變會使動物產生應激反應,影響體內腸道微生物的結構[13]。在雜交黃顙魚(P.fulvidraco♀×P.vachellii♂)的研究中[14],運輸過程中氨氮濃度上升會破壞腸道微生物的穩態,引發氧化應激、代謝和免疫失調。16S rDNA高通量測序技術能快速地對不同屬種的細菌進行分類鑒定[15],廣泛應用于環境因子對腸道菌群結構影響的研究中[16]。在大鱗副泥鰍(Paramisgurnus dabryanus)和瓦氏黃顙(P.vachelli)的研究中,溫度和低氧應激會破壞腸道菌群的穩定,影響機體健康[17,18]。氨氮對魚類腸道的影響不容忽視,然而,目前氨氮對大口黑鱸腸道微生物的影響尚不可知。

大口黑鱸Micropterus salmoides,是從北美洲引進的一種優良淡水養殖品種,具有養殖周期短、市場需求大和售賣價格高等優點。大口黑鱸的養殖多采用高密度集約化養殖模式,該模式存在殘餌溶解、魚集中排泄等問題,極易導致水體中氨氮濃度的急劇升高,從而對魚體產生脅迫,影響魚體的生長發育[19]。氨氮脅迫干擾大口黑鱸氨的排泄,減少分解代謝[20];同時氨暴露會損害其鰓和肝等組織結構,增加血清轉氨酶活性與抗氧化酶活力,抑制魚體免疫和抗氧化能力[21,22]。然而,目前對大口黑鱸腸道結構及腸道微生物的影響鮮有報道。本實驗通過對大口黑鱸進行氨氮脅迫,研究氨氮對其肝和腸組織結構的影響,分析脅迫對魚體抗氧化和免疫能力及腸道菌群的影響,為全面評估和解析氨氮對魚類的危害提供依據和參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大口黑鱸幼魚由蘇州金澄福生物科技有限公司(中國蘇州)提供。挑選同一批次、生長健康狀況良好的鱸幼魚[(15.32±0.65 g)]180尾進行實驗。實驗開始前,于100 L養殖缸內暫養7d。在暫養期間,水溫25—26℃,溶氧＞7 mg/L,pH為7.5±0.2。用NH4Cl(分析純)配制成10 g/L的母液,實驗時根據養殖缸中水的體積加入母液,達到所需實驗濃度。

1.2 氨氮暴露實驗設計

實驗在體積100 L養殖缸內進行,依據養殖水源可能達到的氨氮濃度[2,3]和大口黑鱸48h半致死氨氮濃度(LC50)[23],設置0、25和50 mg/L三個濃度組(非離子氨濃度0、0.55和1.11 mg/L),實測值分別為(0.37±0.08)、(25.19±0.51)和(50.47±0.46) mg/L[非離子氨濃度(0.008±0.002)、(0.59±0.011)和(1.12±0.01) mg/L],每組設3個平行,每個平行放養實驗大口黑鱸20尾。在實驗過程中,每隔4h用納氏試劑分光光度法[24]對實驗水體進行氨氮濃度測定,根據具體結果用母液及時調節。實驗期間,水溫保持25—26℃,pH為7.5±0.15,溶氧(7.57±0.46) mg/L。

氨氮脅迫48h取樣,每個平行取4尾使用MS-222麻醉后解剖,迅速取出肝臟和前腸,液氮冷凍后置于-80℃冰箱保存,用于酶活測量。同時,每個濃度組另取肝臟、前腸樣品3份,用4%多聚甲醛固定,用于組織切片觀察。0和50 mg/L濃度組各取6尾,取出前腸放入凍存管(記為NAN和AN50),液氮冷凍后放入-80℃冰箱保存,用于腸道微生物測定。

1.3 HE染色切片

4%多聚甲醛浸泡固定的組織,進行石蠟包埋處理并切片,通過二甲苯脫蠟,再使用蘇木素-伊紅染色,待切片風干后封片,使用光學顯微鏡(OLYMPUS CX22LED)進行觀察[25]。使用Image J軟件計算空泡細胞面積占據切片面積的比例,得出空泡率;使用Image-Pro Plus 6.0軟件測量腸道絨毛高度、絨毛寬度和肌層厚度。

1.4 Elisa檢測

待測樣品吸干表面水分,稱取0.1 g左右,按照1∶9比例加入已預冷磷酸緩沖鹽溶液(Phosphate buffer saline,PBS),制成組織勻漿,在4℃,9000 r/min條件下離心15min。取上清,用于生化指標檢測。根據上海朗頓生物科技有限公司ELISA試劑盒的說明,檢測肝組織中谷丙轉氨酶(Glutamic pyruvic transaminase,GPT)、谷草轉氨酶(Glutamic oxalacetic transaminase,GOT)、溶菌酶(Lysozyme,LZM)和補體C3(Complement3,C3),腸組織中超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD),過氧化氫酶(Catalase,CAT)和丙二醛(Malondialdehyde,MDA)的活性,使用全波段酶標儀(Bio-Tek EonTM)對所有指標進行檢測。

1.5 腸道微生物總 DNA 提取和測序

使用E.Z.N.A.糞便DNA試劑盒(D4015)提取腸道樣本總DNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量。PCR擴增使用V3—V4區域通用引物341F:5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′及805R: 5′-GAC TACHVGGGTATCTAATCC-3′。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。PCR擴增程序: 98℃預變性30s,32次循環(在98℃下變性10s,在54℃下退火30s,在72℃下延伸45s);最后在72℃下延長10min。使用Ampure XT beads對PCR產物進行純化,并通過Qubit定量。使用Illumina (Kapa Biosciences,Woburn,MA,USA)文庫定量試劑盒和Agilent 2100生物分析儀(Agilent,USA)評估擴增子文庫的大小及數量。

在Illumina NovaSeq平臺上對樣本進行測序,通過FLASH合并匹配端讀取。在特定的過濾條件下,使用Fqtrim(v0.94)對原始讀數據進行質量過濾,以獲得高質量的clean標簽。使用Vsearch軟件(v2.3.4)過濾嵌合序列。特征表和特征序列由DADA2進行解調獲得。Alpha多樣性和Beta多樣性由QIIME2計算出來,利用Bugbase 數據庫進行細菌表型預測。

1.6 數據處理及統計分析

非離子氨濃度[26]計算公式:

式中,C1為非離子氨濃度(mg/L),f為氨的水溶液中非離子氨的摩爾百分比(%),C2為氨氮濃度(mg/L),T為絕對溫度(K),t為攝氏溫度(℃)。

實驗所得數據用SPSS26.0軟件進行分析處理。使用Shapiro-Wilk和Levene檢驗分析酶活數據的正態性和方差同質性,使用單因素方差分析(oneway ANOVA)和 Duncan 檢驗法統計分析各組間數據差異顯著性。用Wilcoxon秩和檢驗確定了樣品間Alpha多樣性和相對豐度差異的顯著性,通過QIIME2分析Beta多樣性并用R(v3.5.2) 包繪制圖片。顯著差異腸道菌群的篩選使用LefSe分析,設定P＜0.05,LDA＞3。結果均以平均值±標準差(SD)表示,當P＜0.05時認為差異顯著。

2 結果

2.1 氨氮脅迫48h后大口黑鱸組織的顯微觀察

通過顯微觀察發現,在氨氮脅迫48h后,0組肝組織中央靜脈周圍肝細胞排列整齊,肝細胞結構清晰完整,細胞間界限明顯(圖1A和1D)。25 mg/L組肝細胞排列出現紊亂,部分細胞出現空泡化(圖1B和1E)。50 mg/L組肝細胞腫脹,排列紊亂,大量肝細胞空泡化(圖1C和1F)。0、25和50 mg/L組肝細胞空泡率分別為(23.61±1.39)%、(47.72±0.55)%和(69.8±1.38)%,差異顯著(P＜0.05)。

圖1 氨氮脅迫48h對大口黑鱸肝組織顯微結構的影響Fig.1 Effects on liver microstructure ofMacropterus salmoidesunder 48h ammonia-N stress

通過對腸組織顯微結構的測量與分析(圖2)可知,在氨氮脅迫48h后,25和50 mg/L組腸組織杯狀細胞的數量增加,杯狀細胞體積逐漸變大。對照組和各實驗組的絨毛高度無顯著性差異(P＞0.05;表2)。0和25 mg/L組的絨毛寬度無顯著性差異(P＞0.05),50 mg/L組的絨毛寬度顯著高于0和25 mg/L組(P＜0.05);50 mg/L組的肌層厚度顯著高于0組(P＜0.05),與25 mg/L組差異不顯著(P＞0.05;表1)。

表1 氨氮脅迫48h對大口黑鱸腸道組織的影響Tab.1 Effects on intestinal tissue ofMacropterus salmoidesunder 48h ammonia-N stress (μm)

2.2 氨氮脅迫48h后大口黑鱸組織抗氧化及免疫參數的變化

氨氮脅迫對大口黑鱸組織抗氧化酶及非特異性免疫酶活性產生顯著影響(圖3和圖4)。脅迫48h后腸組織中SOD活性和CAT活性顯著升高(P＜0.05);50 mg/L組SOD活性顯著低于25 mg/L組,CAT活性顯著高于25 mg/L組(P＜0.05),25和50 mg/L組MDA含量顯著大于0組(P＜0.05)。肝組織中25和50 mg/L組GPT及GOT活性較0組顯著下降(P＜0.05),25和50 mg/L組LZM活性顯著高于對照組(P＜0.05),25和50 mg/L組無明顯差異;50 mg/L組補體C3活性顯著高于0組(P＜0.05),25 mg/L組高于0組但差異不顯著(P＞0.05)。

圖3 氨氮脅迫48h對大口黑鱸組織抗氧化酶的影響Fig.3 Effects of antioxidant enzymes on tissue ofMacropterus salmoidesunder 48h ammonia-N stress

圖4 氨氮脅迫48h對大口黑鱸非特異性免疫酶的影響Fig.4 Effects on non-specific immunoenzymes ofMacropterus salmoidesunder 48h ammonia-N stress

2.3 氨氮脅迫48h后大口黑鱸腸道菌群的變化

本實驗收集了12個樣本進行測序,總共獲得了合格的16S rDNA序列546249條,通過雙端拼接、質量控制和嵌合體過濾等方式修正錯誤,共得到1166個OUT。測序所得數據可以覆蓋樣本絕大多數物種,可以進行后續分析。

Alpha多樣性主要用來反映物種豐富度和均勻度(圖5)。通過測定觀察到NAN組的chao1指數(圖5A)、observed_outs指數(圖5B)、shannon指數(圖5C)和simpson指數(圖5D),均顯著低于AN50組(P＜0.05),腸道菌群的豐富度降低。

圖5 氨氮脅迫48h腸道微生物Alpha多樣性指數Fig.5 Alpha diversity under 48h ammonia-N stress

對12個樣本的主坐標分析(Principal coordinates analysis,PCoA)如圖6所示。不同顏色代表不同分組,不同樣本間的距離代表其物種組成的差異情況。AN50組和NAN組樣本間區分明顯,具有顯著差異(P＜0.05),氨氮脅迫48h后大口黑鱸腸道微生物結構發生明顯改變。

圖6 氨氮脅迫48h腸道微生物PCoA分析Fig.6 Principal coordinates analysis of intestinal microbiome under 48h ammonia-N stress

韋恩圖能反映不同組共有和特有的特征值數目,對AN50組和NAN組所測feature進行分析發現(圖7),AN50組和NAN組共有的feature有196個,占總feature的16.8%,而AN50組和NAN組特有的feature數量相差較大,分別為709(60.8%)和261(22.4%)。同時,用曼哈頓圖來展示差異feature分析(圖8)。結果顯示,差異feature主要集中在擬桿菌門(Bacteroidetes)、藍藻門(Cyanobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、梭桿菌門(Fusobacteria)和螺旋體門(Spirochaetes),變形菌門(Proteobacteria)同時存在上升和下降的feature。

圖7 氨氮脅迫48h feature 韋恩圖Fig.7 Venn diagram showing feature under 48h ammonia-N stress

圖8 氨氮脅迫48h feature曼哈頓圖Fig.8 Manhattan plots showing enriched and depleted feature under 48h ammonia-N stress

對樣本中平均相對豐度大于1%的feature進行相對豐度和差異分析(圖9)。在門水平上(圖9A),主要的優勢菌群是變形菌門(Proteobacteria)、梭桿菌門(Fusobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、螺旋體門(Spirochaetes)和厚壁菌門(Firmicutes)。由圖9B可知,在氨氮脅迫48h后,AN50組和NAN組在擬桿菌門和螺旋體門的相對豐度上存在顯著差異(P＜0.05),AN50組顯著高于NAN組;梭桿菌門和厚壁菌門存在一定差異(P＞0.05)。在屬水平上(圖9C),相對豐度大于1%的屬有8個,分別為不動桿菌屬(Acinetobacter)、金黃桿菌屬(Chryseobacterium)、鄰單胞菌屬(Plesiomonas)、螺旋體屬(Brevinema)、鯨桿菌屬(Cetobacterium)、愛德華氏菌屬(Edwardsiella)、氣單胞菌屬(Aeromonas)和假單胞菌屬(Pseudomonas)。經差異分析(圖9D)和LEfSe分析(圖9E)可以發現,在8個優勢菌屬中4個存在顯著差異(P＜0.05)。AN50組不動桿菌屬、金黃桿菌屬和螺旋體屬的豐度顯著高于NAN組,鄰單胞菌屬的豐度顯著低于NAN組(P＜0.05)。

圖9 氨氮脅迫48h腸道微生物的優勢菌相對豐度和差異分析Fig.9 Relative abundance and difference analysis of intestinal microbiome under 48h ammonia-N stress

通過相關性熱圖來分析相對豐度前20的屬與腸道生理指標的關系(圖10)。結果發現,不動桿菌屬與腸道MDA含量、CAT活性、絨毛寬度和肌層厚度呈正相關,金黃桿菌屬與腸道肌層厚度、絨毛寬度及SOD活性呈正相關,黃桿菌屬與腸道肌層厚度、絨毛寬度呈正相關。假黃單胞菌屬、短波單胞菌屬、寡養單胞菌屬與腸道MDA含量呈正相關。鄰單胞菌屬與腸道MDA含量、CAT活性、絨毛寬度和肌層厚度呈負相關。

圖10 腸道微生物屬水平與腸道生理指標的相關性Fig.10 Relationships between intestinal microbiome at genus level and intestinal physiological indexes

為了進一步了解氨氮脅迫對大口黑鱸腸道微生物的菌群的影響,對腸道菌群表型進行分析,使用BugBase對細菌表型進行預測,深入探究氨氮脅迫對腸道微生物菌群的表型和功能的影響(圖11)。AN50組和NAN組在革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌方面沒有顯著差異,革蘭氏陰性菌在腸道菌群中占絕對優勢。同時,AN50組具有更低的生物膜形成能力和耐應激性。

圖11 BugBase預測得到的氨氮脅迫48h腸道菌群表型分析Fig.11 Phenotype analysis of intestinal microbiome under 48h ammonia-N stress predicted by BugBase

3 討論

3.1 氨氮脅迫影響大口黑鱸肝臟、腸道組織的正常結構和功能

肝臟是新陳代謝和解毒的主要器官,水體氨氮濃度的升高,會造成肝組織的損傷[27]。在本實驗中,氨氮對大口黑鱸肝臟最主要的組織結構影響表現為肝細胞排列紊亂和肝細胞空泡化,并且隨著氨氮濃度增加,肝細胞空泡化更加嚴重。在團頭魴(Megalobrama amblycephala)和圓斑星鰈(Verasper variegatus)的氨氮脅迫實驗中,同樣出現肝細胞空泡化的現象[28,29]。細胞空泡化是細胞壞死的前兆[30]。同時,肝臟中存在多種酶,對魚體的生長代謝有重要作用[31],而肝細胞空泡可能會對酶活性產生影響,從而導致肝臟的正常功能損傷。

魚類的腸道具有屏障功能[32]。在本實驗中,杯狀細胞數量在脅迫后顯著增加;50 mg/L組的腸道絨毛腫脹,絨毛寬度顯著大于對照組和25 mg/L組,且腸道肌層厚度顯著大于對照組。在急性氨脅迫對草魚腸道影響的研究中[33],腸道出現同樣的變化。腸道內的杯狀細胞數量增多,會促使腸道黏液分泌增多,以達到保護腸道減少損傷的目的[34]。絨毛寬度和肌層厚度增加可能是腸道產生炎癥的預兆,氨暴露可誘導氧化應激和炎癥,改變魚體酶活性,進而損傷腸道[33,35]。因此,高濃度的氨氮可能會引起腸道的炎癥反應,腸道通過促進杯狀細胞分裂應對氨氮脅迫帶來的影響,從而影響腸道的結構與功能。

3.2 氨氮脅迫造成大口黑鱸氧化應激

在水體中氨氮濃度升高時,魚體內發生一系列應激反應而產生大量ROS;MDA 是ROS脂質過氧化反應的產物[36],氨氮脅迫后腸組織中的MDA含量顯著增加,導致細胞的正常功能受損。SOD和CAT是機體抗氧化系統的重要組成部分,能有效清除ROS[37]。脅迫后SOD和CAT活性也明顯高于對照組,去清除過多的ROS,以減輕過氧化損傷。這與翹嘴鱖(Siniperca chuatsi)的研究結果一致[38]。而50 mg/L組SOD活性較25 mg/L組低,可能是因為脅迫產生的有害物質超過了魚體的耐受上限。孫麗穎等[39]對黃顙魚的研究發現,過高的氨氮濃度會抑制抗氧化酶活性。氨氮脅迫抑制魚體的調節能力,抗氧化功能被削弱,從而可能影響腸道的結構和功能,這與腸道組織切片的結果一致。

3.3 氨氮脅迫影響大口黑鱸非特異性免疫相關酶活性及免疫能力

LZM是魚類先天免疫的重要防御因子,是反映魚類免疫毒性的常規指標[40]。LZM能激活機體的補體系統[41];C3是補體系統的主要成分,在抵抗病原感染和炎癥反應方面起著重要作用[42]。在本實驗中,氨氮脅迫刺激大口黑鱸合成或分泌LZM,增強LZM活性,進而激活補體系統促進補體C3活性上升,加強非特異性免疫,以應對氨氮帶來的毒性作用。鯉(Cyprinus carpio)[43]和異育銀鯽(Carassius auratus gibelio)[44]的研究也出現相同現象。

GPT和GOT是動物體內廣泛存在的重要的轉氨酶,通常用這兩種酶的活性檢測氨基酸的代謝情況并反映肝臟的功能狀況。在正常情況下,GPT和GOT存在于細胞內,只有極少數釋放入血液中[45]。在本研究中,氨氮脅迫后,兩實驗組的GPT和GOT活性均顯著低于對照組。在尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)的研究[46]也發現,氨氮脅迫會降低組織中GPT和GOT的濃度。其原因可能是氨氮脅迫使肝細胞受到損傷,細胞膜通透性增加,轉氨酶釋放到血液里所致,氨基酸代謝因此受到抑制。

3.4 氨氮脅迫改變大口黑鱸腸道微生物的組成及功能

在外界環境脅迫條件下,魚類腸道菌群結構會發生一定程度的改變[47,48]。氨氮脅迫后Alpha多樣性和Beta多樣性顯著變化,微生物菌群有明顯的聚類特征,菌群差異顯著。在戚曉舟[49]對鯽的氨氮脅迫研究中,也出現脅迫組物種豐度提高,腸道菌群結構改變的現象。Khan等[50]對中華花龜(Mauremys sinensis)的研究也發現,在氨脅迫下腸道微生物Beta多樣性差異顯著,影響了腸道菌群的組成。這說明氨氮脅迫使腸道微生物群豐度產生差異,腸道菌群結構發生變化,而腸道菌群結構變化易造成宿主生理功能的異常[51]。

在氨氮脅迫后,大口黑鱸腸道內變形菌門、梭桿菌門、擬桿菌門、螺旋體門和厚壁菌門占據優勢,AN50組的螺旋體門和擬桿菌門相對豐度顯著高于NAN組。有研究指出,變形菌門、梭桿菌門、擬桿菌門和厚壁菌門是淡水魚類腸道微生物群的重要組成部分[52]。螺旋體廣泛分布在自然界和動物體內,多通過寄生引起疾病。在暗紋東方鲀(Takifugu obscurus)和大西洋鮭(Salmo salar)的相關研究中,螺旋體門是其腸道微生物菌群的優勢菌群之一[53,54],但是關于螺旋體如何對淡水魚產生影響的研究尚少,其對魚體結構、功能的作用有待進一步探究。

擬桿菌門的菌群多生活在動物的腸道中,為條件致病菌,參與腸道中糖類、蛋白質的代謝[55],與腸道炎癥密切相關[53]。厚壁菌門和擬桿菌門的比例可用來表示動物的肥胖程度,厚壁菌門和擬桿菌門的相互作用對魚類腸道的能量代謝起著重要的作用[56]。在本研究中,厚壁菌門和擬桿菌門的比例降低,可能削弱魚體能量代謝。金黃桿菌屬在本實驗中是優勢菌屬,是一類革蘭氏陰性菌,屬于擬桿菌門,會引起水產動物的疾病[57]。王鑫毅等[58]對烏鱧(Channa argus)的研究發現,金黃桿菌屬有比較強的毒性,魚類感染金黃桿菌屬會出現鱗片脫落、肝腫大和腸組織黏連等癥狀。氨氮脅迫后擬桿菌門和金黃桿菌屬豐度的增加,可能引起大口黑鱸腸道損傷,破壞能量平衡,影響魚體生長代謝。

變形菌門是細菌中最大的一個門,同時也包含了大量的病原菌。在氨氮脅迫后,變形菌門相對豐度總體沒有顯著變化,其門下的不動桿菌屬和鄰單胞菌屬豐度差異顯著,不動桿菌屬顯著增多,鄰單胞菌屬則顯著減少。不動桿菌感染多出現在犬科動物和人上,近年來常出現在魚類中,其致病性被廣泛研究[59,60]。不動桿菌屬感染可能會導致團頭魴出現鱗片脫落、肝臟發白和肝細胞腫脹空泡等癥狀[61],氨氮脅迫后不動桿菌屬的增多可能導致大口黑鱸組織損傷。鄰單胞菌屬常見于魚類、水生動物和各種哺乳動物消化道內,發病時對魚類等水產動物造成極大危害[62]。然而氨氮脅迫降低了鄰單胞菌屬豐度,使大口黑鱸因鄰單胞菌屬產生疾病的可能降低。

氨氮脅迫會引起大口黑鱸腸道菌群功能的差異。AN50組和NAN組的優勢菌群均是革蘭氏陰性菌,占到相對豐度的90%以上。革蘭氏陰性菌是魚類腸道微生物的優勢菌群,也存在一部分革蘭氏陽性菌[63]。同時,AN50組有較低的生物膜形成能力和耐應激性。微生物生物膜是由微生物群體及其包被的細胞外多聚物和基質網組成,生物膜形成后細菌對宿主免疫防御機制的抵抗力也會增強[64,65]。氨氮脅迫會使大口黑鱸腸道微生物的生物膜形成能力降低,不利于菌群在腸道中的生存,減少了因腸道菌群致病的可能。腸道菌群的耐應激性更低,說明氨氮濃度高時,大口黑鱸腸道容易受到影響,菌群平衡破壞,進而影響魚體健康。

4 結論

本實驗結果表明,氨氮脅迫使大口黑鱸的肝臟、腸道組織結構發生變化,同時氨氮脅迫后腸道微生物結構被破壞,引起大口黑鱸肝臟、腸道損傷,破壞能量平衡,影響魚體生長代謝。隨水體氨氮濃度的升高,MDA含量增多,SOD、CAT、LZM和補體C3活性升高,GOT和GPT活性降低,使大口黑鱸產生氧化應激,并降低其非特異性免疫能力。在氨氮脅迫后,腸道菌群生物膜形成能力和菌群耐應激性降低,大口黑鱸腸道更容易受到損傷。在進行大口黑鱸養殖時,應密切注意養殖水體氨氮濃度的監測和管理,防止氨氮對大口黑鱸幼魚的毒性效應。