低蛋白飼料補充必需氨基酸對異育銀鯽生長、氨基酸轉運和mTOR信號通路相關基因的影響

何林岳 劉昊昆韓 冬朱曉鳴金俊琰楊云霞解綬啟

(1.中國科學院水生生物研究所淡水生態與生物技術國家重點實驗室,武漢 430072;2.中國科學院大學,北京 100049)

蛋白質是對于魚類生長最為關鍵的營養因子[1],魚類的蛋白質需求量普遍高于畜禽動物[2],飼料蛋白水平過高帶來高昂成本的同時,還容易加劇養殖水體水質惡化[3]。蛋白質進入魚體,在消化酶的作用下被水解為氨基酸進行消化吸收,故魚類實際上沒有特定的蛋白質需求,而是對組成蛋白質的氨基酸的需求[4],水產飼料中氨基酸的平衡及含量,尤其是必需氨基酸的平衡及含量直接影響到魚類生長、肌肉蛋白質沉積、蛋白質利用效率及養殖水環境氮排放[5]。隨著晶體氨基酸生產技術的成熟,在飼料中添加適量晶體氨基酸,不僅能夠減少蛋白原料的用量,降低飼料成本,還能促進生長、改善魚體健康狀況等[6],最近有研究指出,斑點叉尾鮰(Ietalurus Punetaus)飼料蛋白水平由32%降至26%并額外補充賴氨酸和組氨酸至平衡,能夠維持魚體正常生長水平[7];在布氏鯧鲹(Trachinotus blochii)飼料中補充賴氨酸和蛋氨酸可以降低其蛋白需求,提高魚體生長性能[8]。

必需氨基酸除了構成蛋白質以外,還作為信號分子參與機體蛋白質代謝等多種生物學過程[9]。雷帕霉素靶蛋白(Mechanistic Target of Rapamycin,mTOR)被認為是調節哺乳動物和魚類細胞生長及蛋白質翻譯起始的關鍵控制元件[10,11],必需氨基酸可以激活mTOR復合物1,然后上調下游核糖體蛋白S6激酶1(Ribosomal protein S6 kinase 1,S6K1),并抑制真核翻譯因子4E結合蛋白2(4E-binding protein 2,4EBP2)和真核翻譯起始因子4E(Eukaryotic translation initiation factor 4E,eIF4E)的表達水平[12—15]。有研究指出,極低蛋白飲食會抑制小鼠下丘腦mTOR信號通路從而導致體重下降[16];在團頭魴(Megalobrama amblycephala)的飼料中添加適量精氨酸可以刺激mTOR的表達從而促進魚體生長[17];對鱖(Siniperca chuatsi)進行腦室注射亮氨酸也能夠刺激mTOR信號傳導[18]。

異育銀鯽(Carassius gibelio)是我國重要的經濟性淡水養殖魚類,2021年全國總產量高達278萬噸[19]。異育銀鯽“中科5號”(Carassius gibeliovar.CAS V)是利用銀鯽特有的異精雌核生殖培育出的子代,較“中科3號”生長更快且更耐受低營養飼料(低蛋白和低魚粉)[20],具有重要的經濟價值和社會效益。目前對異育銀鯽必需氨基酸需求量已有所研究,本實驗基于必需氨基酸需求量以異育銀鯽“中科5號”幼魚為研究對象,探究低蛋白飼料中補充必需氨基酸對異育銀鯽生長、消化及蛋白合成的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗飼料

本實驗制備了3種等能(18% kJ/g)半純化飼料,分別為對照組(粗蛋白含量35%)、低蛋白組(粗蛋白含量28%)和補充必需氨基酸組(粗蛋白含量28%)。飼料以酪蛋白和谷朊粉為主要蛋白源,玉米淀粉為碳水化合物源,魚油和豆油等比例混合為脂肪源,參照異育銀鯽的必需氨基酸需求量添加晶體氨基酸。對所有原料進行研磨粉碎,混合均勻后過100目篩網加水調配,用制粒機(SLP-45,漁業機械設備研究所,中國上海)制備成2 mm粒徑的顆粒飼料,于65℃烘箱烘干后放置4℃冷庫中保存備用。飼料配方如表1所示,其中,飼料的必需氨基酸組成見表2。

表1 實驗飼料配方和化學組成(%干物質)Tab.1 Formulation and chemical composition of experimental diets (% dry matter)

表2 飼料必需氨基酸組成(%干重)Tab.2 Essential amino acid composition of diets (% dry matter)

1.2 實驗魚及飼養管理

實驗魚來自中國科學院水生生物研究所官橋漁場,實驗地點為湖北省荊州市石首市老河長江四大家魚原種場,養殖系統為室外池塘網箱(2 m×2 m×2 m)。正式養殖實驗前將魚在網箱中馴養2周以確保實驗魚對養殖系統的適應。實驗開始前對實驗魚進行饑餓24h處理。實驗包括3個處理組,每組3個重復,隨機選取540尾魚規格均勻、體質健康的魚[初重(12.71±0.11) g]稱總重后放入網箱,每個網箱60尾魚,共9個網箱。每日7:00、12:00和18:00進行飽食投喂。在實驗期間,每晚20:00至次日清晨7:00使用沉水式充氣管道進行連續充氣增氧,特殊情況如陰雨天氣時,額外在其他時間開啟充氧。每天進行水質監測管理,在整個實驗期間,水溫為(33±2)℃,水體溶氧＞6 mg/L,氨氮＜0.1 mg/L,養殖實驗周期為50d。

1.3 樣品采集

用麻醉劑MS-222(60 mg/L,Sigma,USA)將實驗魚麻醉后進行計數并稱總重,然后取樣。實驗開始前,隨機選取3組魚,每組4尾,作為初樣,在實驗結束時,每個網箱隨機選取2尾魚抹干稱重后作為末樣,共同儲存于-20℃冰箱中,用于測定全魚體成分。每個網箱取3尾魚進行體長和體重的測量,并解剖肝臟和內臟團稱重用于計算肝體比、臟體比和肥滿度。再在每個網箱隨機取2尾魚用肝素鈉(濃度0.2%)抗凝劑浸潤過的注射器進行尾靜脈采血,然后于4℃下3000 r/min離心10min后,取出上清液血漿分裝于200 μL的PCR管中,儲存于-80℃冰箱用于血漿生化指標分析。同時,將抽完血的2尾魚在冰浴條件下進行解剖,取出肝臟、腸道和肌肉組織,置于液氮中速凍然后放于-80℃冰箱保存備用。

1.4 樣品分析

首先對用于體成分分析的實驗魚樣品進行預處理: 將稱重后的實驗魚放于高壓蒸汽滅菌鍋(ES-315,Tomy Kogyo Co.,Japan)中120℃下蒸煮20min,冷卻后搗碎,在70℃烘箱中烘干,稱重,最后用粉碎機將其粉碎用于后續體成分分析。

飼料、全魚、肝臟和背肌樣品的水分、蛋白質、脂肪和灰分的測定均根據(AOAC,2003)標準方法進行。干物質通過失重法在烘箱(電熱恒溫干燥箱,精宏,中國上海)中105℃烘干至恒重進行測定;灰分通過失重法在馬弗爐(中國湖北英山縣建立電爐制造廠)中550℃下煅燒后進行測定;粗蛋白采用凱式定氮儀(2300,Kjeltec Analyzer Unit,FOSS Tecator,Sweden)進行測定;全魚粗脂肪采用索氏抽提儀(Soxtec System HT6,Tecator,Hoganas,Sweden)進行抽提測定,肝臟和背肌脂肪采用氯仿甲醇抽提法進行測定;飼料氨基酸含量采用茚三酮柱后衍生法,樣品用約10 mL 6 mol/L的濃鹽酸在110℃下水解24h后,濾紙過濾并定容至50 mL,取1 mL濾液于氮吹儀60℃下氮吹干脫酸,再加入12 mL去離子水,經氨基酸全自動分析儀(A300,membraPure,Germany)上機檢測(色氨酸水解過程被破壞,未檢測)。

血漿葡萄糖和總蛋白含量采用南京建成生物工程研究所的試劑盒(A154-1-1和A045-2-2)進行檢測;血漿和肝臟谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶活性也采用南京建成生物工程研究所試劑盒(C010-2-1和C009-2-1)進行測定;腸道消化酶糜蛋白酶、胰蛋白酶、淀粉酶及脂肪酶等活性采用南京建成生物工程研究所的試劑盒(A080-3-1、A080-2-2、C016-1-1和A054-1-1)進行檢測。

基因實時熒光定量PCR相關引物序列見表3。腸道、肝臟和背肌組織樣品中總RNA提取采用TRIzol試劑(Invitrogen,USA)依據說明書推薦的方法進行,然后使用1.0%瓊脂糖電泳檢測總RNA的完整性,NanoDrop?ND-2000(NanoDrop Technologies,USA)測定樣品RNA純度和濃度。接著用M-MLV First-Strand Synthesis Kit(Invitrogen,USA)推薦方法進行反轉錄,總反應體系為20 μL。用Light Cycle480Ⅱ系統(Roche Diagnostics,Switzerland)及SYBR?Green I Master Mix(Roche Diagnostics,USA)熒光染色試劑進行RT-PCR實時熒光定量檢測。反應體系為: 3 μL SYBR?Green PCR Master Mix,2 μL cDNA,0.24 μL Primer F,0.24 μL Primer R和0.52 μL PCR water,共計6 μL。選用β-actin和ef1α作為內參基因,預實驗確定擴增效率,用內參和目的基因做標準曲線。計算公式如下:

表3 實時熒光定量PCR引物序列Tab.3 Primers sequence of quantitative RT-PCR (qPCR)

式中,E目標基因為目標基因的擴增效率,E內參基因為內參基因β-actin和ef1α的擴增效率,Ct為Threshold cycle,臨界循環數,即熒光閾值與擴增曲線相交,交點所對應的循環數。

1.5 數據處理與分析

本實驗所有數據均使用SPSS 21.0進行統計分析,采用均值±標準誤的形式(mean±SE,n=6)。實驗結果首先進行方差齊性檢驗,然后進行單因素方差分析(One-way ANOVA),并進行Duncan’s多重比較分析,統計顯著性設置為P＜0.05。

2 結果

2.1 生長性能和形體指標

如表4所示,低蛋白飼料中補充必需氨基酸對異育銀鯽“中科5號”的終末體重、攝食率、特定生長率、飼料效率、蛋白質效率和氮沉積率均有顯著影響(P＜0.05),其中LP+EAA組攝食率顯著低于LP組,且蛋白質效率和氮沉積率最高,相較于LP組特定生長率和飼料效率顯著提高(P＜0.05);肥滿度和肝體比各組間無顯著差異(P＞0.05),臟體比在LP+EAA組達到最高,且與CON組和LP組差異顯著(P＜0.05)。

表4 低蛋白飼料補充必需氨基酸對異育銀鯽生長性能和形體指標的影響Tab.4 Effects of low protein diets supplement with essential amino acids on the growth performance and morphological indexes of gibel carp

2.2 全魚體成分及背肌肝臟組分

如表5所示,低蛋白飼料補充必需氨基酸對異育銀鯽幼魚全魚體組成、背肌組分和肝臟脂肪含量均無顯著影響(P＞0.05),肝臟蛋白含量在LP組達到最低,且與CON組和LP+EAA組差異顯著(P＜0.05)。

表5 低蛋白飼料補充必需氨基酸對異育銀鯽全魚、背肌和肝臟組分的影響Tab.5 Effects of low protein diets supplement with essential amino acids on composition of whole body,dorsal muscle and liver in gibel carp

2.3 血漿和肝臟生化指標

如表6所示,低蛋白飼料補充必需氨基酸對異育銀鯽幼魚血漿的血糖、谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶活性無顯著影響(P＞0.05),LP+EAA組的總蛋白含量顯著高于LP組(P＜0.05);肝臟中的谷草轉氨酶在LP+EAA組達到最高。且與LP組和CON組差異顯著(P＜0.05),而谷丙轉氨酶活性各組間無顯著差異(P＞0.05)。

表6 低蛋白飼料補充必需氨基酸對異育銀鯽血漿、肝臟和腸道生化組成的影響Tab.6 Effects of low protein diets supplement with essential amino acids on plasma,liver and intestine biochemical composition of gibel carp

2.4 腸道消化酶活性

如表6所示,LP+EAA組的胰蛋白酶活性與CON組無顯著差異(P＞0.05)且均顯著高于LP組(P＜0.05);LP組和LP+EAA組的淀粉酶活性顯著高于CON組(P＜0.05);糜蛋白酶和脂肪酶活性在各組間無顯著差異(P＞0.05)。

2.5 氨基酸轉運體相關基因相對表達量

如圖1所示,低蛋白飼料中補充必需氨基酸對pept1無顯著影響(P＞0.05),cat2和b0at1在LP組達到最低,且與CON組和LP+EAA組差異顯著(P＜0.05),asct2和b0,+at在LP+EAA組的表達與CON組無顯著差異(P＞0.05)。

圖1 低蛋白飼料補充必需氨基酸對異育銀鯽腸道氨基酸轉運載體pept1、cat2、asct2、b0at1和b0,+at相對表達量的影響Fig.1 Effects of low protein diets supplement with essential amino acids on the relative expression of the intestinal amino acid transporterspept1,cat2,asct2,b0at1andb0,+atin gibel carp

2.6 肝臟和背肌mTOR信號通路相關基因相對表達量

如圖2和圖3所示,在肝臟中,LP組的tor相對表達量顯著低于CON組(P＜0.05),而LP+EAA組與CON組該基因的表達量無顯著差異(P＞0.05),LP+EAA組s6k1的表達量顯著高于LP組(P＜0.05),且與CON組無顯著差異(P＞0.05),而4ebp2和eif4e的表達呈相反的趨勢,但在各組間無顯著差異(P＞0.05);在背肌中,LP+EAA組tor的相對表達量顯著高于LP組(P＜0.05),eif4e的基因表達量在CON組和LP+EAA組間無顯著差異,而LP組顯著低于CON組(P＜0.05),補充必需氨基酸對異育銀鯽背肌的s6k1和4ebp2的相對表達量無顯著影響(P＞0.05)。

圖2 低蛋白飼料補充必需氨基酸對異育銀鯽肝臟tor、s6k1、4ebp2和eif4e相對表達量的影響Fig.2 Effects of low protein diets supplement with essential amino acid on the relative expression oftor,s6k1,4ebp2andeif4ein the liver of gibel carp

圖3 低蛋白飼料補充必需氨基酸對異育銀鯽背肌中tor、s6k1、4ebp2和eif4e相對表達量的影響Fig.3 Effects of low protein diets supplement with essential amino acid on the relative expression oftor,s6k1,4ebp2andeif4ein the dorsal muscle of gibel carp

3 討論

3.1 低蛋白飼料補充必需氨基酸對異育銀鯽生長性能的影響

蛋白質之所以成為水產動物飼料中最關鍵的營養成分,與其在魚類生長性能和生理反應中的重要作用是分不開的[25,26]。已有許多研究證明,單純地降低水產飼料的蛋白水平而不補充氨基酸會導致養殖魚類正常生長發育受阻、飼料利用降低、魚體蛋白沉積和免疫力下降等一系列負面效應[27—29]。本研究結果表明,降低異育銀鯽“中科5號”幼魚飼料7個百分點的蛋白水平(從35%到28%),向其補充平衡但不足量的必需氨基酸仍然無法滿足魚體生長需要,而補充至需求量的必需氨基酸則在一定程度上彌補了降低飼料蛋白可能造成的生長性能下降,這與大口黑鱸(Micropterus salmoides)[6]、布氏鯧鲹(Trachinotus blochii)[8]和虹鱒(Oncorhynchus mykiss)[30]中結果較為相似。對于形體指標來說,本研究結果顯示添加必需氨基酸提高了異育銀鯽臟體比,但肝體比無顯著變化,這與Salem等[7]在斑點叉尾鮰(Ietalurus Punetaus)上的研究結果相似,但與陳乃松等[31]在大口黑鱸和譚芳芳等[32]在草魚(Ctenopharyngodon idellus)中的大部分研究結果不一致,以往的研究大都表明在低氨基酸含量的飼料中補充晶體必需氨基酸能夠降低肝體比和臟體比以改善魚類形體指標。這可能是由于實驗魚食性的不同所導致的,斑點叉尾鮰和異育銀鯽同屬雜食性魚類,對低蛋白飼料相較于肉食性和草食性魚類可能更為耐受,從而肝臟未受到損傷。

3.2 低蛋白飼料補充必需氨基酸對異育銀鯽血漿和肝臟生化指標的影響

魚類血漿生化指標能夠在一定程度上反映魚體健康、生理和代謝狀況[33]。在本研究中,補充必需氨基酸組的血漿總蛋白含量最高,這與布氏鯧鲹[8]中的結果相似,補充蛋氨酸和賴氨酸能夠顯著提高血漿中總蛋白的含量。血漿中的總蛋白是魚類身體健康的標志,血漿蛋白越高在一定程度上表明魚體免疫力越好[34]。谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶是動物體肝臟中重要的氨基轉移酶,它們可以促進谷氨酸與丙酮酸和谷氨酸與草酰乙酸之間的轉氨作用,肝臟中轉氨酶的活性可以在一定程度上反映蛋白質的代謝狀況。但是當機體處于低營養狀態時,肝臟會出現損傷這兩種酶會大量釋放到血漿中,血漿轉氨酶水平可作為評價肝臟健康狀況的指標[35,36]。在本研究中,肝臟中的谷草轉氨酶活性在必需氨基酸添加組達到最高,表明必需氨基酸的添加能夠在一定程度上提高轉氨酶活性來促進氨基酸轉氨作用,與劉夢梅等[37]對草魚低蛋白飼料補充賴氨酸的結果相似;而血漿中的谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶的活性各組間無顯著差異,表明本實驗的低蛋白飼料可能未對異育銀鯽肝臟造成損傷,這與楊賀舒等[38]在雜交黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco♀×Pelteobagrus vachelli♂)中的實驗結果相一致,說明異育銀鯽“中科5號”有著較好的低蛋白飼料耐受能力。

3.3 低蛋白飼料補充必需氨基酸對異育銀鯽腸道消化吸收的影響

對于異育銀鯽這種無胃魚來說,腸道在消化吸收過程中是十分重要的器官,而消化吸收能力又與魚體生長、發育和增重關系十分密切。魚類消化吸收能力與消化酶活性相關,蛋白質利用效率也會受到消化酶活性影響。在本研究中,胰蛋白酶的活性在補充必需氨基酸組達到最高,這可能是由于晶體必需氨基酸100%的真實消化率[39],使得飼料中的結合蛋白也能夠更有效地作為胰蛋白酶的底物,從而刺激胰蛋白酶活性的提高[40];脂肪酶活性在各處理組間無顯著差異,這可能是由于飼料中恒定的脂肪含量[41];淀粉酶活性在低蛋白組和補充必需氨基酸組顯著升高,這可能是由于低蛋白飼料中含有大量碳水化合物[40]。

蛋白質被消化酶水解后的產物是小肽和氨基酸,它們必須通過腸道上皮被轉運到靶器官,這一過程則需要氨基酸轉運體的參與[42,43]。pept1是一種關鍵的腸道轉運蛋白,可以轉運400多種二肽和8000多種三肽[44];cat2是一種陽離子氨基酸轉運蛋白,b0,+at是一種堿性氨基酸轉運蛋白,主要轉運堿性必需氨基酸(賴氨酸、精氨酸和組氨酸)[45];asct2是一種中性氨基酸轉運系統,能夠轉運大部分中性必需氨基酸(蛋氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸和色氨酸)[46];b0at1是一種中性堿性氨基酸轉運系統,賴氨酸主要就由其轉運[47],它的作用是作為反轉運體將亮氨酸交換為賴氨酸,因此賴氨酸的吸收與亮氨酸的外排耦合。在本研究中,必需氨基酸的添加上調了cat2、asct2和b0at1的表達量,一定程度上促進了氨基酸的吸收轉運。

3.4 低蛋白飼料補充必需氨基酸對異育銀鯽mTOR信號通路的影響

蛋白質在魚體中沉積主要是通過刺激mTOR信號通路來實現的[48],mTOR信號通路在營養感知和能量調控方面起著重要作用[10,11],是魚類[49]和哺乳動物[50]體內蛋白合成的關鍵代謝通路。在mTOR信號通路中,mTOR復合體1的下游有兩個位點,分別為s6k1和4ebp2。在通常情況下,魚類處于低營養狀況(如: 低蛋白飼料)時,mTOR信號通路會被抑制[51],導致魚體蛋白合成受阻。本研究發現,低蛋白飼料中添加必需氨基酸上調了肝臟tor和s6k1的mRNA水平,肝臟蛋白含量同樣也顯著上升,說明添加必需氨基酸可以通過刺激mTOR/S6K1信號通路從而促進肝臟蛋白合成;在異育銀鯽背肌中,添加必需氨基酸顯著上調了tor和eif4e的表達,但4ebp2和s6k1無顯著變化,這可能是背肌中蛋白含量未顯著上升的原因,與Zou等[10]在異育銀鯽中的研究結果相似,飼料中添加亮氨酸提高了肝臟蛋白而非肌肉蛋白。

4 結論

在異育銀鯽“中科5號”低蛋白飼料(蛋白水平由35%降至28%)中,只補充晶體必需氨基酸至必需氨基酸比例的平衡會造成魚體生長性能下降,但向其補充晶體必需氨基酸至需求量后,能夠通過促進魚體消化、氨基酸轉運及mTOR信號通路相關基因表達顯著提高魚體生長性能。因此,向低蛋白飼料中補充必需氨基酸至需求量被認為是可行的,可為優化異育銀鯽飼料配方作理論參考。