TasHSP16.9參與茉莉酸信號傳導介導的小麥白粉病抗性

摘要：小分子熱激蛋白（sHSP）是一類結構保守且受逆境脅迫誘導合成的應激蛋白。筆者所在課題組前期發現TasHSP16.9受非生物脅迫誘導表達，為明確該基因對病原物的應答反應。本研究利用熒光定量RT-PCR分析小麥TasHSP16.9基因對茉莉酸甲酯（MeJA）和白粉菌的應答響應，利用病毒誘導的基因沉默（VIGS）技術分析白粉菌侵染后TasHSP16.9基因沉默對小麥白粉病抗性的影響。結果發現，MeJA和白粉菌均可誘導TasHSP16.9基因表達；TasHSP16.9基因沉默促進了白粉菌菌絲生長，表明TasHSP16.9基因可能參與了JA信號傳導途徑介導的小麥白粉病抗性防御。

關鍵詞：小麥；sHSP16.9；茉莉酸；病毒誘導的基因沉默（VIGS）；白粉病抗性

中圖分類號：S435.121.4+6" 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）24-0030-04

收稿日期：2023-12-19

基金項目：國家自然科學基金（編號：32360484）；河南省高等學校重點科研項目（編號：22B210008）；蘭州交通大學大學生創新創業訓練計劃項目（編號：CXXL20220035）。

作者簡介：李靜婷（1983—），女，內蒙古包頭人，博士，副教授，主要從事小麥遺傳育種學研究。E-mail：jingting_lee@163.com。

小麥是我國主要糧食作物，小麥產量和品質的提升關乎國民經濟發展和人們生活質量。環境脅迫（高溫及干熱風、低溫冷害及霜凍、干旱）和生物脅迫（赤霉病、條銹病、白粉病等病害）嚴重影響小麥的產量和品質。2023年全國小麥白粉病預計發生面積高達600萬hm2（https：//www.natesc.org.cn）。雖然，已在小麥及其近緣種屬中近66個位點定位了100多個抗白粉病基因，但是大多數未進行深入的功能研究^［1］。因此，解析小麥白粉病抗性遺傳機制對于抗病育種具有重要意義。

病毒誘導基因沉默（VIGS）已經被廣泛應用于各種模式植物和農作物基因功能研究中，這項技術在小麥抗條銹病、白粉病、紋枯病等抗病相關基因功能研究方面取得重要研究成果^［2］。利用BSMV-VIGS技術沉默蛋白激酶基因TaPiPK1、TaPK3A來研究其功能，發現沉默TaPiPK1、TaPK3A基因降低了小麥對條銹菌、禾谷絲核菌的抗性，推測其參與小麥條銹病、紋枯病抗性防御^［3-4］。隨著測序技術的發展和基因克隆新技術新方法的不斷涌現，抗病相關的候選基因挖掘會越來越多，候選基因功能驗證將是未來研究重點，VIGS技術將會在禾本科植物的基因功能研究中發揮更大的作用。

小分子熱激蛋白（sHSP）在正常條件下不表達或表達量很低，高溫、鹽脅迫、干旱等非生物脅迫均會誘導sHSP表達^［5-7］。此外，sHSP也可被茉莉酸甲酯（MeJA）和水楊酸（SA）誘導表達，參與植物的抗病防御反應，如草莓HSP17.4介導水楊酸與茉莉酸互作調控草莓炭疽病抗性^［8］。研究發現，茉莉酸（JA）可誘導小麥、水稻提高對赤霉病、白粉病、紋枯病的抗性，JA 是病原物誘導小麥防御基因表達的信號分子^［9-11］。本研究發現，TasHSP16.9啟動子含有MeJA響應元件（CGTCA-motif、TGACG-motif）和真菌誘導響應元件（Box-W1），推測TasHSP16.9參與了小麥抗病防御響應。本研究利用熒光定量RT-PCR分析小麥TasHSP16.9基因對MeJA和白粉菌的應答響應，利用VIGS技術分析白粉菌侵染后TasHSP16.9基因沉默對小麥白粉病抗性的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

小麥品種復壯30（攜帶抗白粉病基因Pm5e）^［12］由中國科學院遺傳與發育生物學研究所劉志勇研究員惠贈。煙草采用本生煙品種。經過修飾的大麥條紋花葉病毒（BSMV）的VIGS系統、農桿菌菌株EHA105由中國農業大學生物學院李大偉教授惠贈。小麥白粉菌E09菌株由中國農業科學院作物科學研究所李洪杰研究員惠贈。試驗中所需引物由北京賽百盛生物工程有限責任公司合成，Trizol試劑、TIANScript Ⅱ RT Kit等試劑盒從天根生化科技（北京）有限公司購得，MeJA購自Sigma公司。所有試驗于2023年3—9月在蘭州交通大學生物與制藥工程學院實驗室進行。

1.2 試驗方法

1.2.1 白粉菌侵染生物脅迫

選取籽粒飽滿的復壯30種子種植于盛有營養土的小缽中，置于光照培養箱中生長，光照16 h，溫度22 ℃，黑暗8 h，溫度18 ℃，相對濕度60%。待小麥長至2葉期時，利用白粉菌E09菌株接種2葉期小麥，并于接種后1、3、6、12、24 h時取樣。同時，接種14 d后，按照0～4級標準調查植株的抗病性，以感白粉病小麥品種農大015為感病對照^［13］。

1.2.2 茉莉酸甲酯處理

利用1.0 mmol/L的MeJA溶液（用含0.2%Tween的蒸餾水配成濃度10 mmol/L的溶液）噴灑于2葉期小麥復壯30第1張葉，并在MeJA處理后0、1、3、6、12、24 h時取第1張葉。

1.2.3 TasHSP16.9基因表達譜分析

利用Trizol試劑法提取小麥葉片的總RNA并反轉錄合成cDNA第一鏈作為模版，利用熒光定量RT-PCR檢測TasHSP16.9基因表達，并進行3次生物學重復。反應程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，56 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s，38個循環。參見李靜婷等的方法^［14］進行數據處理和分析。

1.2.4 VIGS侵染煙草和小麥

利用PCR擴增克隆TasHSP16.9基因的3′UTR區域特異性片段插入到大麥條紋花葉病毒（BSMV）的γ亞基γb序列后構建重組病毒沉默載體BMSV：TasHSP。用BSMV：α、BSMV：β、BMSV：rblzc（空載體為對照）、BMSV：PDS、BMSV：TasHSP分別接種含有Kan、Rif 的LB液體培養基（50 mmol/L MES、0.1 mmol/L 乙酰丁香酮），28 ℃培養至吸光度D600 nm為0.5～1.0。將BSMV：α、BSMV：β分別與BMSV：rblzc、BMSV：PDS（沉默小麥內源八氫番茄紅素脫氫酶基因Pds，作為VIGS體系的指示基因）、BMSV： TasHSP等體積混合，離心后將沉淀重懸于50 mL侵染緩沖液（10 mmol/L MgCl2、10 mmol/L MES、10 mmol/L 乙酰丁香酮）。然后分別接種6株長勢一致的煙草，用注射器將侵染液注射于幼嫩葉片繁殖病毒，7 d后取有病毒表型的煙草葉片，研磨成汁液，涂擦于生長8 d的2葉期小麥復壯30的葉片表面，10 d后觀察第3張葉的病毒感染表型，以轉染BMSV：PDS病毒的小麥第3張葉葉基部白化作為病毒沉默系統轉染效率的指示。

1.2.5 內源基因沉默檢測

取轉染空病毒BMSV：rblzc和BMSV： TasHSP的小麥復壯30且出現黃化病狀的葉片，進而提取RNA并反轉錄合成cDNA第一鏈。利用半定量RT-PCR法檢測內源TasHSP16.9基因表達（表1），檢測內源基因是否沉默。

1.2.6 離體觀察

取轉染空病毒BMSV：rblzc和BMSV： TasHSP的小麥復壯30出現黃化病狀的葉片葉尖和葉中部，置于0.8%瓊脂培養基（加保綠劑苯胼咪唑0.6%），接白粉菌后3 d開始顯微鏡（40×）觀察離體葉片白粉菌菌絲生長情況。利用脫色劑（75%乙醇、25%三氯甲烷和0.3%三氯乙酸）65 ℃處理過夜，再利用染色液（0.6%考馬斯亮藍與015%三氯乙酸等體積混合）染色5～10 min，置于保存液（75%水、20%甘油和5%乙酸）中備用。

2 結果與分析

2.1 MeJA與白粉菌侵染后復壯30中TasHSP16.9基因的表達模式

本研究前期已克隆了TasHSP16.9基因，對其啟動子進行順式作用調控元件分析發現，TasHSP16.9啟動子含有MeJA響應元件（CGTCA-motif、TGACG-motif）和真菌誘導響應元件（Box-W1）（表2），推測TasHSP16.9參與了植物抗病防御響應。為明確TasHSP16.9對白粉菌誘導的應答反應，采用熒光定量 RT-PCR方法分析MeJA處理及白粉菌E09侵染后復壯30幼苗中TasHSP16.9的表達。

利用白粉菌E09菌株苗期接種復壯30、農大015鑒定其白粉病抗性水平，發現復壯30表現為高抗或免疫，葉尖表現為過敏性壞死（IT＝0），農大015表現高感（IT＝4）（圖1）。

由圖2可知，MeJA處理后1～6 h TasHSP16.9表達量逐漸升高，6 h時表達量達到最高，隨著時間的延長，外源MeJA在葉片內的濃度逐漸下降，該基因表達水平也逐漸下降。白粉菌接種后1～6 h TasHSP16.9表達量很低，沒有明顯變化，12 h時表達量達到最高。表明MeJA和白粉菌均可以誘導TasHSP16.9的表達。推測TasHSP16.9是茉莉酸（JA）信號途徑下游的防御基因，外源噴施MeJA激活其表達。而JA是小麥抗白粉病的信號分子，白粉菌侵染小麥后誘導內源JA水平升高，激活下游TasHSP16.9表達。所以該基因對白粉菌的響應較外源MeJA緩慢。進而推測TasHSP16.9參與了JA信號傳導途徑介導的小麥白粉病抗性防御。

2.2 內源基因沉默效果

由于小麥復壯30對白粉菌E09表現高抗或免疫，所以選取小麥復壯30為試驗材料進行病毒侵染。克隆TasHSP16.9基因的3′UTR區域特異性片段插入到大麥條紋花葉病毒（BSMV）的γ亞基γb序列后構建重組病毒沉默載體BMSV：TasHSP（圖 3-A）。病毒接種10 d后，取有病毒表型的小麥葉片對內源基因相對表達量進行半定量分析。與空載體BMSV：rblzc相比，BMSV：TasHSP轉染的小麥葉片TasHSP16.9基因表達量下調，表明接種病毒后，復壯30葉片中TasHSP16.9基因被瞬時沉默（圖3-B）。

2.3 接種病毒后復壯30對白粉病菌的抗性

小麥復壯30接種病毒10 d后，取有病毒表型的小麥葉片接種白粉菌E09進行離體觀察。結果顯示，在白粉菌E09侵染后7 d，轉染病毒BMSV：TasHSP較空病毒BMSV：rblzc葉片中菌絲形成更大更密集的網狀，表明沉默TasHSP16.9基因促進了白粉菌菌絲生長（圖4）。TasHSP16.9可能參與了小麥白粉病抗性防御。

3 討論與結論

橡樹HbHSP90.8-1基因受白粉菌、外源MeJA和SA的誘導表達，表明其參與了橡樹白粉病抗病防御及抗病相關激素信號轉導途徑^［15］。Hsp90是一類受腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）調節的同源二聚體熱激蛋白。熱激蛋白是一類可被環境脅迫誘導并參與植物生長發育和逆境響應過程的蛋白家族，其中含量最豐富的是小分子熱激蛋白sHSP。

很多研究表明，非生物脅迫可誘導sHSP的產生，本研究前期結果表明，TasHSP16.9受高溫、低溫、干旱和高鹽等非生物脅迫誘導表達，表明TasHSP16.9基因可能在小麥抵抗非生物脅迫方面發揮重要作用^{［5-7，14］}。而且TasHSP16.9啟動子含有MeJA響應元件（CGTCA-motif、TGACG-motif）和真菌誘導響應元件（Box-W1），所以TasHSP16.9也可能參與了植物抗病防御反應。本研究發現外源MeJA和白粉菌E09均可誘導TasHSP16.9基因表達。已有研究表明，MeJA可誘導提高小麥對白粉病的抗性，JA是誘導小麥抗白粉病的信號分子，所以推測TasHSP16.9參與了JA信號傳導途徑介導的小麥白粉病抗性防御^［11］。

VIGS是一種轉錄后基因沉默技術，具有快速、簡單和高效的特點，而小麥品種復壯30對我國流行的白粉病生理小種表現為高抗或免疫，所以本研究以復壯30為材料利用VIGS技術分析白粉菌侵染后TasHSP16.9基因沉默對小麥白粉病抗性的影響^［12］。利用VIGS技術介導TasHSP16.9沉默促進了白粉菌菌絲生長，表明TasHSP16.9可能參與了小麥抗白粉病防御。后續將通過轉錄組分析及利用酵母雙雜交篩選TasHSP16.9的互作蛋白，以明確該基因在小麥抗病信號通路中的調控功能，為小麥抗病育種提供理論參考。

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