晚期糖基化終末產物受體在特發性肺纖維化中的研究進展

陳鳳 李龍 王潔 劉勝菲

由于病因不明,特發性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)缺乏有效的干預措施。晚期糖基化終末產物受體(receptor for advanced glycation end products,RAGE)是免疫球蛋白受體超家族的成員,在肺臟中表達最多,有助于維持肺組織的動態穩定。其參與糖尿病腎纖維化和肝纖維化已有證明,多項研究也表明,RAGE與IPF有關。本文就RAGE與IPF的研究進展做一綜述,以期為IPF的治療提供一思路。

一、RAGE的簡介

RAGE最早于1992年從牛肺中分離出來,首次被發現是因為其結合晚期糖基化終末產物(AGEs)的能力,促進糖尿病的炎癥和血管并發癥。編碼人類RAGE的基因位于Ⅲ類主要組織相容性復合體(MHC)的6p21染色體區域。RAGE是一種由404個氨基酸組成的35kD多配體跨膜蛋白,由胞質區、細胞外區及跨膜區三個主要區域組成[1]。RAGE的細胞外段是配體結合位點,由三個免疫球蛋白結構域組成,包括一個可變(V)免疫球蛋白(Ig)結構域和兩個恒定的C(C1和C2)組成,V-C1結構域的分子表面被疏水腔覆蓋,并含有許多帶高正電荷的Arg和Lys殘基,多個RAGE的配體含有帶高負電荷的區域,可以與帶正電荷的V-C1結構域結合,以發揮其特異性作用[2, 3]。胞質結構域可與各種下游信號效應分子,如Toll-白細胞介素1受體結構域銜接蛋白(TIRAP)、透明相關福爾馬因-1(DIAPH1)和細胞外信號調節激酶1和2(ERK1/2)進行關鍵相互作用,最終導致絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activate protein kinase,MAPK)途徑的激活[2, 3]。RAGE在體內以兩種主要形式存在:膜結合RAGE (mRAGE)和可溶性RAGE (sRAGE)。mRAGE有三個結構域:識別和結合RAGE配體的細胞外結構域、疏水跨膜結構域和在細胞內信號傳遞中起作用的帶電細胞質結構域[2, 3]。sRAGE是選擇性剪接事件或ADAM10或基質金屬蛋白酶對mRAGE蛋白水解的產物,其包括內源性分泌性RAGE(esRAGE)和外域脫落形式的RAGE。因缺乏跨膜和細胞內C末端結構域,只包含細胞外結構域,雖能與RAGE競爭同一配體的結合,但卻不能在細胞內轉導信號,是一種誘騙受體,通過隔離RAGE配體,從而阻斷RAGE信號向細胞內轉導。

二、RAGE在肺中的表達

RAGE在肺組織中高度表達,是多種肺病理的重要媒介,如IPF、肺癌、哮喘、肺炎、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、支氣管肺發育不良和囊性纖維化(cysticfibrosis,CF)[2, 4]。RAGE在肺中的多種細胞類型中都有不同水平的表達,包括肺泡巨噬細胞、肺內皮細胞、成纖維細胞、氣道上皮細胞和氣道平滑肌細胞[5]。而在Ⅰ型肺泡上皮細胞(type 1 alveolar epithelial cells,AT1)中表達最為豐富[6]。通過細胞外基質跨膜區直接分泌到細胞外基質(extracellular matrix,ECM),參與維持肺泡結構、AT1的生存發育和分化[7]。

三、RAGE與間質性肺疾病

間質性肺疾病(interstitial lung disease,ILD)是一類廣泛的彌漫性肺實質疾病,其特征是不同程度的肺纖維化和炎癥,IPF是一種常見且原因不明的進行性ILD。RAGE被認為在肺中起穩態作用,因為RAGE敲除小鼠隨著年齡的增長而發展為肺纖維化。據報道,IPF患者肺組織中的RAGE分布降低[8]。在多個肺纖維化試驗模型中(包括博來霉素、石棉和二氧化硅所致),小鼠肺內RAGE表達顯著下降。但在這些模型中,對RAGE的意義仍存在著分歧。RAGE缺失對石棉引起的纖維化作用最強,對博來霉素引起的纖維化也有一定防護功能,但對二氧化硅引起的纖維化則沒有作用。在不同肺纖維化模型中,RAGE作用不同的原因仍未可知。RAGE對細胞是具有保護作用還是有害作用可能取決于細胞暴露的損傷類型[9]。RAGE在AT1中高度表達,但RAGE后信號的增加導致上皮損傷和EMT導致RAGE表達減少[10]。總之,在小鼠動物模型及肺纖維化患者中,RAGE的表達水平都有所降低。

1. RAGE與DNA損傷修復

肺大量暴露在高氧張力和活性氧(ROS)中,氧化應激易導致DNA損傷,進而發展為IPF,因此需要一個有效的DNA修復系統來對抗活性氧增加的后果。有缺陷的DNA修復潛力導致細胞衰老,促炎性衰老相關分泌表型(SASP),促進促炎因子(如IL-6)和成纖維介質(如TGF-β)的分泌,并最終導致纖維化及推動纖維化的進展[6]。RAGE的缺失可導致細胞衰老的增加,這是由于缺乏足夠的DNA損傷修復,促進了老年RAGE-null小鼠的SASP和隨后的肺纖維化[11]。

Kumar等人[12]通過WT和RAGE-/-小鼠模型發現,RAGE的缺失與小鼠肺纖維化組織的堆積和衰老病變有關。在RAGE-/-小鼠的其他組織中也觀察到衰老病變的積累。RAGE-/-小鼠的肺顯示出更為扭曲、松散的肺泡和肺泡周圍區域。并發現衰老相關細胞特性的標記物IL-6、H2AX、53BP1和pATM均增加,表明存在持續的DNA損傷信號。而缺乏充分和及時的DNA修復可能會導致突變的積累,最終導致癌癥。還證實了RAGE的重建有效地恢復了DNA損傷并逆轉了病理異常,RAGE可以被轉運到細胞核,在細胞核中它被共濟失調-毛細血管擴張-突變激酶的Ser376和Ser389磷酸化,磷酸化將RAGE招募到DNA雙鏈斷裂區域,在那里它增強內切酶活性,促進DNA損傷修復[12]。因此可知,RAGE與DNA修復之間的聯系對纖維化的進展,甚至癌癥的發生具有一定作用。

2. RAGE與2型免疫反應

2型免疫是對抗寄生蟲感染的關鍵性防御機制,當調節失調時,它會導致不良的免疫反應,不僅導致過敏性哮喘和特應性皮炎(AD),還會導致組織纖維化[6]。在這種反應中,IL-4和IL-13由Th2細胞、肥大細胞和ILC產生[6]。促炎和促纖維化細胞因子,如IL-4和IL-13在IPF患者中升高。IL-13是一種多效性2型細胞因子,可促進炎癥,細胞增殖和纖維化[6]。有研究發現[5],RAGE在2型炎癥驅動哮喘的實驗模型中起著核心作用,在哮喘進展的多個步驟中需要RAGE,包括響應過敏原釋放IL-33,以及rIL-33誘導ILC2在肺部的積累。持續IL-13誘導的Stat6激活和隨后的Stat6誘導基因(例如Clca1和Ccl11)的上調需要RAGE,這些基因驅動粘液產生和炎癥[5]。有文獻報道,ILC2s參與肺纖維化[13]。RAGE還促進ILC2的活化和積累以響應外源性IL-33[5]。RAGE在哮喘模型中直接或通過ILC2調節IL-13信號傳導的關鍵作用表明RAGE也可能在調節IL-13介導的肺纖維化。

3. RAGE與巨噬細胞極化

M1巨噬細胞(platelet derived growth factor)具有抗肺纖維化或是致肺纖維化作用還有待考究。極化巨噬細胞表現出可塑性,因為它們可以去極化為M0巨噬細胞或通過復極化表現出相反的表型,這取決于特定的微環境[14]。說明M1巨噬細胞可轉向M2巨噬細胞的極化。M2巨噬細胞產生血小板源性生長因子(platelet derived growth factor,PDGF)、精氨酸酶1(argininase,Arg1)以促進纖維化過程,還可產生轉化生長因子(transforming growth factor-β1,TGF-β1),誘導成纖維細胞分化為肌成纖維細胞,源自M2巨噬細胞的IL-4和IL-10的過表達也有助于肺纖維化[15, 16]。肺部間充質干細胞(LR-MSC)對肺纖維化中成纖維細胞的活化具有積極作用,M2型巨噬細胞可促進LR-MSC的成纖維細胞分化及α-SMA的表達[17]。Li Zhuang等人[18]研究發現,HMGB1(high mobility group protein B1,HMGB1)有助于腫瘤相關巨噬細胞(TAM)的M1樣極化,RAGE在TAM中充當HMGB1的受體,并通過RAGE-NF-κB-NLRP3炎癥小體途徑,HMGB1增強了TAM的M1樣極化。在巨噬細胞中,HMGB1通過細胞外調節蛋白激酶(ERK1/2)的磷酸化激活RAGE,然后激活NF-κB和細胞因子產生。已有研究表明,MAPK和NF-κB可能在巨噬細胞M1樣極化中起關鍵作用[19]。He等人[20]研究表明,用RAGE抑制劑對巨噬細胞培養物進行預處理,可抑制MAPK-p38信號通路的激活,促進巨噬細胞的M1極化。此外,HMGB1與RAGE的結合與HMGB1的釋放增加和RAGE的表達之間建立了正反饋機制,導致M1巨噬細胞極化的增強。說明,在巨噬細胞中,HMGB1可通過RAGE/NF-κB信號通路誘導M1巨噬細胞的極化。所以,深入研究RAGE在巨噬細胞極化中的作用可能對IPF的治療帶來一定幫助。

4. RAGE與其相關配體

RAGE被認為是一種模式識別受體(PRR),在單體狀態下,RAGE對幾種配體只有弱親和力,而多聚化是配體結合所必需的。RAGE對配體的識別主要是通過細胞膜上的3種結構域實現,其結合的配體又與其他受體結合, 構成復雜的RAGE配體軸。IPF患者中,RAGE的主要相關配體,包括SI00蛋白、AGEs和HGMB1等升高。RAGE與配體結合被激活后,促進各種細胞過程,包括炎癥、遷移和增殖,導致多種疾病,如糖尿病、腫瘤和器官纖維化等。

在IPF中,S100A9激活肺成纖維細胞增殖,并通過RAGE信號激活NF-κB通路,誘導α平滑肌肌動蛋白(Acta2)、膠原1A1 (Col1a1)、基質金屬蛋白酶-9 (MMP9)和RAGE的表達并誘導促炎細胞因子的產生,從而參與纖維化[6]。

有文獻報道,當HMGB1對各種刺激做出反應時,通過與幾種跨膜受體(如RAGE和Toll樣受體)相互作用,激活多種細胞內信號通路,包括MAPK、ERK1/2、NF-κB和PI3K通路及其下游靶標AKT[21]。MAPK信號傳導對成纖維細胞分化和成纖維細胞活化至關重要,導致基質產生和積累增加,而肌成纖維細胞持續活化為IPF重要“核心效應細胞”。IPF的發生及惡化與肺部持續炎癥有關[22]。PI3K/AKT通路介導下游炎性細胞因子的釋放,例如TNF-α和白細胞介素,最終誘導炎癥和組織損傷[23]。NF-κB途徑在HMGB1-RAGE相互作用時也可被激活,釋放多種炎癥因子如TNF-α、IL-6和IL-1β等炎癥因子過表達[24],導致肌成纖維細胞聚集合成成纖維細胞灶,最終形成肺纖維化。有文獻報道,腎素-血管緊張素系統與IPF有關[25]。血管緊張素Ⅱ 1型受體(AT1R)能與 RAGE形成異構復合物,Ang Ⅱ誘導的AT1R 激活反式激活RAGE細胞質尾部的跨式激活和NF-κB驅動的促炎基因表達。當RAGE被刪除或其胞質尾部的轉導被抑制時,由AT1受體激活誘導的不良促炎信號傳導事件被減弱[26]。

HMGB1與RAGE結合后,RAGE的細胞質尾部可通過募集Dia-1,來活化小GTP酶Rac1/Cdc42, 從而增加細胞的遷移、調節細胞骨架的重塑、細胞運動、神經軸突生長和腫瘤生長等,最終發生IPF。在AGE-RAGE相互作用期間也可激活小GTP酶Cdc42/Rac[1]。同時,當細胞處于炎癥狀態時,AGEs與RAGE相互作用,持續激活許多與炎癥機制(粘附分子的表達,細胞因子的產生)相關的細胞內信號轉導途徑,包括MAPK、p38-MAPK和p-p38MAP[27]。AGEs/RAGE軸激活也可促進TGF-β1的表達。有研究證實,RAGE通過阻斷TGF-β誘導的Smad2、ERK和JNK信號激活,抑制EMT進程[1, 7]。

綜上,RAGE與配體結合被激活后,通過眾多途徑參與肺纖維化?？芍?靶向配體/RAGE軸可能對IPF的治療和預防有積極作用。

四、治療

1. RAGE抑制劑

(1)RAGE抑制劑阻斷RAGE信號轉導或與配體結合

RAGE抑制劑可阻斷相關配體與RAGE結構域的結合,從而抑制RAGE下游信號轉導。通常用于抑制RAGE在動物實驗中的作用?，F已發現的RAGE抑制劑有很多,如FPS-ZM1、生物堿和曲尼司特等。

FPS-ZM1是一種高效RAGE抑制劑,已在動物模型中各種炎癥的治療中進行了測試。Nam等人[28]用FPS-ZM1處理小鼠晶狀體上皮細胞,證實其顯著抑制了TGF-β2誘導的α-SMA表達,Smad2磷酸化比對照明顯降低,抑制了纖維化的發展。另有研究表明,用FPS-ZM1治療自發性高血壓大鼠,可抑制NF-κB的活化并降低促炎細胞因子的表達,降低腎臟AngII水平,可減輕腎臟的氧化應激,進而減少腎小管間質纖維化[29]。說明FPS-ZMI可能對IPF的治療具有積極作用,然而,該化合物仍需進一步的體內研究,證明其在實際臨床研究中的適用性,從而證明其是否可用于IPF的治療。

生物堿是RC的主要藥理成分,包括小檗堿(BBR)和罌粟堿等。Xiao等人[30]利用db/db小鼠證實,BBR下調了腎組織中AGEs-RAGE-TGF-β/Smad2和PI3K-Akt通路中相關蛋白的表達,緩解了db/db小鼠的結構異常和腎纖維化。有報道發現,BBR通過減少ACES的產生來抑制RAGE的表達,還抑制TGF-β/Smad3誘導的腎纖維化和NF-κB介導的腎臟炎癥[31]。表明生物堿可作為先導分子,用于開發新型有效的RAGE拮抗劑,可以是IPF有前途的候選藥物。

曲尼司特是一種常用的抗過敏藥物,具有抗纖維化作用[32]?？赏ㄟ^阻斷S100A11與RAGEV結構域之間的相互作用,從而抑制細胞增殖[33]。

現已發現,他汀類藥物、替米沙坦被用于抑制RAGE。二甲雙胍也能抑制AGE誘導的MCF-7細胞RAGE和VEGF mRNA水平的上調[34]。這可能對于IPF合并高血脂、高血壓及糖尿病患者的治療是一重大進展。

(2)可在細胞內結合的RAGE小分子抑制劑

RAGE的細胞內結構域對各種類型的RAGE信號和下游效應起著關鍵作用。Manigrasso等人[35]在一組58000個分子中鑒定出13個最佳的小分子(化合物11-23),這些小分子可以與RAGE的細胞質結構域結合,抑制RAGE和DIAPH1的結合。在AGEs-BSA刺激的Ager小鼠巨噬細胞模型中,用ctRAGE/Diaph1抑制劑(化合物11,inhRAGE)處理顯著但部分抑制AGEs-BSA-RAGE介導的NF-κB活化[36]?？芍?阻斷RAGE和DIAPH1之間的相互作用對IPF的治療有積極作用。

綜上可知,RAGE抑制劑可能是IPF治療的新型策略,目前該類藥物在IPF治療中的研究甚少,還需對其進行更多的相關研究,進而為IPF的治療提供更廣闊的前景。

2. sRAGE

sRAGE是一種強大的保護分子,在IPF患者中,sRAGE的循環水平降低,且sRAGE水平較低與AE-IPF發病較早且預后不良有關[10]。sRAGE的保護作用已在臨床前模型中得到證實,sRAGE給藥可減少由RAGE刺激引發的不同有害損傷。體內直接施用sRAGE已被證明可以逆轉RAGE介導的病理狀況[37]。表明sRAGE在IPF的治療中具有積極作用,其可能為未來IPF的治療新前景。他汀類藥物、血管緊張素轉換酶抑制劑、羅格列酮和維生素D被用于增加sRAGE水平,這可能作為RAGE介導途徑的調節劑。

3. siRNA

siRNA具有轉染效果、效力和特異性高及免疫反應低等特點,是最適合RNAi療法的藥物。Gross 等人[38]在實驗中發現可用siRNA轉染HCE細胞來對抗RAGE。表明siRNA在RAGE介導的疾病中具有治療潛力。可能是IPF未來治療的新領域。

五、小結與展望

抗纖維化藥物的使用對IPF的生存率產生了重大影響,但發病率和死亡率并沒有下降,故需早期發現新的治療方法。RAGE通過多種機制參與IPF的發生及發展,進一步探究RAGE的作用,將會對IPF的臨床治療產生積極的指導意義。且鑒于這一靶點在多種疾病中的重要性,RAGE藥物化學的未來發展可能為新一代新型療法的發展提供了土壤。