隧道納米管介導線粒體轉移緩解氧化應激及其在慢性阻塞性肺疾病的研究進展

楊焜 程意 郭雪君

慢性阻塞性肺疾病(簡稱慢阻肺)是一種常見的氣道慢性炎癥性疾病。截至到2019年,全球30～79歲人口慢阻肺的患病率為10.3%,患病人數約3.919億人,大多數為低、中收入國家人群[[]]。吸煙是慢阻肺最重要的病因之一。煙草燃燒釋放的煙霧(cigarette smoke,CS)中已經鑒定出4 000至 7 000 種氧化劑(reactive oxygen species,ROS)成分,包括酚類、半醌類、一氧化氮、二氧化氮、過氧亞硝酸鹽等。每一口CS中約含1 015個自由基[2,3],引起全身氧化應激,尤其是進行直接接觸的肺。

慢阻肺患者體內的ROS不僅源于直接吸入的CS,也由后續炎癥反應產生。吸煙者肺部及全身的吞噬細胞均高于非吸煙者,且生成ROS的速度更快[3]。CS還誘導大量髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)的生成。MPO已被證實與慢阻肺患者呼吸功能障礙程度相關[4]。

線粒體是參與能量代謝及維持穩態的重要結構,參與ROS生成與調節。線粒體DNA (mitochondrial Deoxyribonucleic Acid,mtDNA) 對氧化損傷易感[5]。ROS積累會影響線粒體形態與功能。

間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)不僅保留了多向分化潛力,還參與組織修復與免疫調節。研究證實其對氧化應激引起的細胞損傷具有保護作用。其中線粒體轉移是重要的機制之一[6,7]。MSCs可以通過多種方式將線粒體轉移至損傷細胞,從而改善細胞能量代謝,減少凋亡。其中隧道納米管(tunneling nanotubes,TNT)介導的線粒體轉移是目前研究的熱點之一[6,8]。

TNT是由細胞膜延伸出的突起結構[9]。直徑約50納米至200納米,長度數微米,外觀很少表現出分支,通常懸浮于培養基中,與基質無接觸[10-15]。TNT是瞬態結構,壽命約幾分鐘到幾個小時不等[11,14]。允許細胞間小分子、囊泡、線粒體甚至致病微生物交換[11]。不同種類細胞TNT結構、組成、功能、性質和形成機制具有差異[11]。F-肌動蛋白是TNT的主要組分,通常根據TNT中是否含微管將其分為兩種類型[11-15]。 研究證實, MSCs通過TNT介導與CS損傷后細胞間的線粒體轉移[7,16],因此在慢阻肺中具有潛在治療作用。

一、氧化應激引起線粒體功能障礙

氧化應激參與慢阻肺的發生與發展,是CS引發慢阻肺的啟動環節[2,3,17]。 ROS的積累可以引發肺泡上皮受損以及細胞外基質重塑,使得肺表面活性物質與抗蛋白酶活性減低,促進炎癥介質釋放與呼吸道粘液大量分泌。

ROS可以引起線粒體形態改變與損傷。氣道疾病患者的氣道平滑肌細胞(airway smooth muscle cells,ASMCs)線粒體表現出明顯的形態學缺陷,線粒體分裂與融合失衡[5]。進一步研究發現CS影響了線粒體分裂融合過程的相關基因,如磷酸酶和張力蛋白同源物誘導激酶1、 E3泛素蛋白連接酶、Ras同系物家族成員T1和動力蛋白相關蛋白1[18,19]。慢阻肺患者和CS誘導肺氣腫小鼠血清中mtDNA水平升高。香煙煙霧提取物(cigarette smoke extract,CSE)刺激后的細胞培養液中也發現mtDNA的釋放,提示線粒體損傷。同時,DNA損傷相關標志物表達增加,包括DNA酶Ⅲ、環磷酸鳥苷-腺苷合成酶、NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3、促炎細胞因子及衰老相關標志物p16和p21[20]。

二、TNT介導MSCs與細胞間線粒體轉移

細胞間TNT的形成及其介導的線粒體轉移在大量體外試驗中發現。在對細胞、MSCs線粒體及TNT主要組分(F-肌動蛋白)進行染色后,通過熒光顯微鏡觀察到了線粒體經TNT由MSCs轉移到受體細胞[6]。利用激光掃描共聚焦顯微鏡發現,TNT在MSCs與人臍靜脈內皮細胞中共培養4小時內形成,并且檢測到了線粒體通過TNT的轉移[21]。

TNT可以在MSCs與多種細胞間形成[7,13,14,22-26]。 包括支氣管上皮細胞、氣道平滑肌細胞、關節軟骨細胞、角膜內皮細胞、神經元、T細胞、巨噬細胞等,參與機體生長發育與免疫調節。TNT還調節細胞衰老。共培養第5代(P5)與第11代(P11)MSCs后發現,相比于單獨培養P11 MSCs,共培養體系中細胞存活率更高,上清中血管內皮生長因子,白介素-6分泌升高。此外,P5MSCs明顯減少了P11MSCs衰老標志物p16的表達,而這種作用在使用TNT抑制劑后明顯減弱。證明此過程主要通過TNT介導[27]。

三、TNT的形成與調節機制

TNT受到多種外界因素的影響。在缺氧缺血、藥物、CSE等刺激下,TNT的形成率明顯增高[7,16,28-30]。 說明細胞傾向于通過TNT構建網絡以提高應激下存活率。

TNT的形成與調節機制目前仍處于研究中。Guy等[31]提出線粒體Rho GTP酶1(mitochondrial Rho-GTPase 1,Miro1)參與調節線粒體運動。研究發現線粒體轉移效率與Miro1有關。人類誘導多能干細胞衍生的MSCs (Mesenchymal Stem Cells Derived from Induced Pluripotent Stem Cells, iPSC-MSCs)較骨髓MSCs高表達Miro1,其線粒體轉移效率更高。此外,腫瘤壞死因子α促進iPSC-MSC 形成TNT。進一步研究發現人腫瘤壞死因子α/核因子-κB/人腫瘤壞死因子α誘導蛋白2信號通路調節此過程[32]。使用膜聯蛋白V屏蔽損傷的血管內皮細胞表面暴露的磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine, PS)后,MSCs與內皮細胞間的TNT形成明顯減少。說明PS結構域引導TNT的形成[21]。 p53參與星形膠質細胞和神經元之間TNT的形成。siRNA沉默p53后TNT形成抑制[33]。 線粒體轉錄因子A被證實參與MSCs與肺微血管內皮細胞間TNT的形成[34]。 研究發現下調MICAL2PV(神經元引導基因MICAL2的剪接異構體)可以促進TNT生成。此外,MICAL2PV與線粒體Rho GTP酶2(Miro2)相互作用可以調節亞細胞線粒體運輸。單加氧酶結構域參與介導此過程[15]。

四、TNT介導的轉運具有方向性

有研究認為MSCs可以通過TNT將胞質內容物轉移到支氣管上皮細胞中。但這種轉移是單向的[35]。Wang等[9]提出了不同的見解,他們發現jurkat細胞(人T細胞急性淋巴細胞白血病細胞系)借助TNT將線粒體轉移到MSCs,但很少從MSCs接受線粒體。而MSCs與關節軟骨細胞間建立的TNT存在雙向線粒體轉移[13]。血管平滑肌細胞與MSCs共培養體系中發現TNT介導線粒體的雙向轉移,但僅MSCs出現促增殖效應,血管平滑肌細胞的增殖速率并未改變。因此,這種交換對不同細胞的影響相異[36]。Lou等[37]發現TNT可以在惡性細胞間或間皮細胞間形成。但并未在惡性細胞和間皮細胞間發現TNT。Matula等[38]也觀察到相同的現象。脂肪來源的MSCs與jurkat細胞共培養后,僅發現jurkat細胞間形成TNT結構。

關于TNT介導物質轉運的方向性目前仍有爭議,需要進一步深入研究。

五、TNT介導的治療作用

大量動物和臨床研究證實了MSCs在慢阻肺中的治療作用,線粒體轉移是潛在機制之一[18,39]。使用iPSC-MSCs 與骨髓MSCs治療CS暴露大鼠,可以改善肺結構,緩解CS暴露引發的氣道纖維化。體外研究證實了MSCs與支氣管上皮細胞間TNT樣結構的形成,通過流式細胞熒光分選證實了細胞間線粒體轉移。而這種轉移在應用TNT抑制劑后受到阻斷。此外,研究證實TNT介導的線粒體轉移效率具有細胞特異性,iPSC-MSCs轉移能力更強[16]。直接共培養iPSC-MSCs與ASMCs,先觀察到了iPSC-MSCs線粒體轉移,后觀察到了ASMCS線粒體轉移。這種轉移在煙草刺激存在下增強。直接共培養緩解了煙草刺激后ASMCs線粒體ROS生成、細胞凋亡及Ψm損失。而使用MSCs條件培養基或Transwell共培養ASMC等非直接共培養僅見線粒體ROS生成減少。體外實驗證實iPSC-MSCs可以減少ROS生成及Ψm損失從而緩解線粒體功能障礙,減低氣道高反應性,肺泡灌洗液中的炎細胞數量明顯減少,并且證實了iPSC-MSCs對肺部炎癥的緩解[7]。

TNT不僅介導線粒體轉移,還可以影響細胞旁分泌。小鼠心肌細胞(cardiomyocytes,CM)和人多能脂肪衍生干細胞(human multipotent adipose derived stem cells,hMADS)共培養后發現:CM對hMADS的旁分泌有影響作用。使用痛苦狀態小鼠的CM模擬心肌梗死,與hMADS共培養后發現培養液中多種細胞因子含量變化。其中人血管內皮生長因子、人肝細胞生長因子、單核細胞趨化蛋白3和人基質細胞衍生因子1α等心臟保護因子在應用TNT阻斷劑后減少。從而支持TNT對這些細胞因子的刺激作用[40]。

六、結語

線粒體轉移參與多種生理、病理活動,是生物界普遍存在的現象。由于氧化與抗氧化失衡,慢阻肺患者體內ROS堆積,引發線粒體損傷,導致細胞能量代謝障礙及穩態失衡。TNT介導MSCs與細胞間線粒體轉移,可以恢復細胞正常生理功能,從而緩解疾病進展。在治療慢阻肺中具有潛在應用前景。