種子休眠與萌發調控的研究進展

宋松泉 唐翠芳 雷華平 姜孝成 王偉青 程紅焱

1 中國科學院植物研究所, 北京 100093; 2 湖南師范大學生命科學學院, 湖南長沙 410081; 3 湘南學院南嶺現代種業研究院, 湖南郴州 423099

種子休眠(seed dormancy)被定義為種子在適宜的條件下暫時不能完成萌發的特性[1], 這一特性可防止種子在不利季節的短期有利條件下萌發[2]。種子休眠也是一種顯著的農藝性狀, 低水平的休眠可能產生收獲前萌發(pre-harvest sprouting), 而高水平的休眠則抑制迅速和整齊的萌發; 二者都嚴重地影響作物的產量與質量[3-5]。研究表明, 種子休眠是一個復雜的性狀, 受多種內源和外部因素的影響; 被認為是種子生物學中理解最少的領域之一[6]。種子休眠研究的一個主要困難是休眠被功能性定義, 目前仍然沒有評估干燥種子是否具有休眠的方法[7],常常用在一定條件下的種子萌發率來表示; 而種子休眠和萌發是2 個相互聯系的獨立事件, 具有一系列不同的生理和生化過程[1,8]。

根據Nikolaeva 等[9]的分類, Baskin 和Baskin[10-11]將種子休眠分為5 種類型: 形態(morphological)、生理(physiological)、形態生理(morphophysiological, 形態和生理的結合)、物理(physical)和組合(combinational,生理和物理的結合)休眠。生理休眠是裸子植物和被子植物中最常見的休眠類型, 而淺生理休眠(nondeep physiological dormancy)又是最普遍的生理休眠形式[10-11]。淺生理休眠的種子需要具有完整性, 即胚的覆蓋層是種子吸脹時阻止其生長所必需的[5,12];同時, 也需要種子吸脹時阻止胚生長的植物激素脫落酸(abscisic acid, ABA)[13]。成熟種子的最終休眠水平隨著種子發育過程中母體環境的不同而發生變化,例如溫度、光照和營養(如硝酸鹽)可用性[14-15]。

近年來, 種子休眠與萌發的研究取得了顯著的進展[7-8,15-16], 特別是DOG1(DelayofGermination-1)基因的發現和功能研究被認為是種子休眠研究的重要突破[5,17-18]。本文主要綜述了植物激素ABA 和赤霉素(gibberellin, GA)對種子休眠與萌發的控制,DOG1 調控種子休眠的作用機制, 以及種子休眠與萌發的表觀遺傳(epigenetic)調控, 并提出了在本領域需要進一步研究的科學問題, 試圖為深入理解種子休眠與萌發的分子機制、抗穗萌育種以及促進休眠種子的萌發提供參考。

1 植物激素ABA 和GA 對種子休眠與萌發的控制

1.1 ABA 和GA 對種子休眠與萌發的影響

植物激素ABA 和GA 是拮抗調節種子休眠與萌發的關鍵因素, ABA 正調控休眠誘導和維持, 而GA促進萌發[19-20]。在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中,高水平的ABA 首先出現在種子成熟初期, 主要來源于母體植株; 隨著成熟進程, 母體來源的ABA 逐漸被合子組織合成的ABA 所取代, 這種合子來源的ABA 對種子發育過程中休眠的誘導以及吸脹前后休眠的維持更為重要[21]。外源 ABA 顯著降低水稻(Oryzasativa)[22]、萵苣(Lactucasativa)[23]和黑黃檀(Dalbergiafusca)[24]種子的萌發速率和萌發率。ABA生物合成途徑中的八氫番茄紅素去飽和酶(phytoene desaturase)抑制劑氟啶酮(fluridone)顯著地降低萵苣種子萌發的熱抑制(thermoinbibition)或者熱休眠(thermodormancy), 而ABA 分解代謝酶ABA 8’-羥化酶(ABA 8’-hydroxylase)抑制劑烯唑醇(diniconazole)增加萵苣種子萌發的熱抑制[23]。Xu 等[25]報道了一個來自aus型水稻的數量遺傳位點(quantitative genetic locus)SD6(SeedDormancy6), 它編碼堿性螺旋-環-螺旋(basic helix-loop-helix, bHLH)轉錄因子。SD6和另一種ICE2 (inducer of C-repeat binding factors expression 2)的bHLH 因子以溫度依賴的方式通過直接調控 ABA 分解代謝基因ABA8OX3和通過OsbHLH048 間接調控ABA 生物合成基因NCED2,拮抗控制種子休眠。

后熟增加大麥休眠胚中生物活性GA1的水平[26]。隨著種子后熟, ABA 的水平下降, GA 的水平增加[27-28]。GA3能夠降低萵苣種子萌發的熱抑制, GA 生物合成途徑中的內根-貝殼杉烯氧化酶(ent-kaurene oxidase)抑制劑多效唑(paclobutrazol)增加萵苣種子萌發的熱抑制[23]。此外, GA3也能夠顯著地解除黃櫨(Cotinus coggygriavar.cinerea)種子的休眠和促進萌發[29]。Chen 等[30]發現, GA 通過啟動胚的活性、克服糊粉層或種皮施加的機械抑制以及促進胚的生長來增加萌發。

此外, GA3對萵苣種子萌發的促進作用被ABA降低, 被氟定酮增加; 而氟定酮降低的萵苣種子萌發熱抑制被多效唑拮抗[23]。GA3處理解除水稻種子休眠[31], 而多效唑增加高粱(Sorghumbicolor)種子的休眠[32]。這些結果表明, GA3在種子萌發過程中具有拮抗ABA 的作用。

1.2 ABA 和GA 調控種子休眠與萌發的機制

不管種子的休眠水平深淺, ABA 的水平在干種子吸脹初期下降; 然而, 在吸脹的休眠種子中其萌發的抑制是由于在吸脹過程中持續的較高水平的ABA 積累[7]。吸脹時ABA 的積累激活ABA 信號, 維持胚的狀態和阻止種子萌發[33]; 這個過程包括增加ABI3(ABAINSENSITIVE3)和ABI5的表達。ABI3和ABI5分別編碼B3 轉錄因子(transcription factor)和堿性亮氨酸拉鏈(basic leucine-zipper, bZIP)轉錄因子,促進種子成熟保護程序; 同時, 它們也引起LEA(LATEEMBRYOGENISISABUNDANT)基因的表達,以及通過阻斷三酰甘油(triacylglycerol)的分解代謝來抑制胚中的儲存物消耗[34]。核心ABA 信號轉導組分包括ABA 受體PYR/PYL/RCAR (pyrabactin resistance 1/pyrabactin resistance 1-like/regulatory components of ABA receptor)家族、A 組2C 型蛋白磷酸酶(group A type 2C protein phosphatase, PP2C)和蔗糖非發酵-1-相關的蛋白激酶2 (sucrose non-fer menting-1-related protein kinase 2, SnRK2)。當ABA缺乏時, PP2C 與SnRK2 結合, 這種結合使下游的ABA 信號因子失活, 抑制ABA 反應以促進種子萌發;當ABA 存在時, ABA 受體PYR/PYL/RCAR 與PP2C結合并使PP2C 失活, SnRK2 從PP2C 介導的抑制中釋放, 引起激酶的自體磷酸化(autophosphorylation)或磷酸化(phosphorylation), 激活的SnRK2 磷酸化下游靶子, 包括轉錄因子和通道蛋白(channel protein),從而誘導和維持種子休眠[5,8,35-37](圖1)。

赤霉素能解除種子休眠, 促進萌發[1,38-39]。核心GA 信號轉導途徑主要由 GA 受體 GID1 (GA INSENSITIVE DWARF 1)、DELLA (Asp-Glu-Leu-Leu-Ala)蛋白、F-box 蛋白和 DELLA 調控的靶因子組成[40]。當GA 缺乏時, DELLA 蛋白是穩定的,抑制GA 的反應; 當GA 存在時, GID1 與GA 結合,這種結合促進GID1-GA-DELLA 復合物的形成, 依次促進其與SLY1 (SLEEPY1)/GID2 F-box 蛋白結合和多泛素化DELLA, 從而通過26S 蛋白酶體靶向降解DELLA。這樣就解除了GA 反應的DELLA 抑制[8,40-41](圖 1)。在擬南芥DELLA 因子中, RGL2(REPRESSOR OF GA-LIKE 2)在抑制種子萌發中起主要作用[8]。

研究表明, 在種子成熟1 周內ABA 信號顯著下降, GA 信號增加, 最終導致種子萌發[42]。ABA 和GA 信號與種子休眠和休眠解除之間存在著明顯的聯系: (1) 在休眠解除過程中, ABA 水平和/或敏感性降低, 而對GA 的敏感性增加; (2) GA 不敏感與休眠種子的萌發缺陷有關, 而GA 促進非休眠種子的萌發; (3) 當休眠種子后熟時, 休眠被解除, 對ABA 和/或 GA 的敏感性發生變化[43-44]。對于水稻、大麥(Hordeumvulgare)、小麥(Triticumaestivum)和其他禾谷類植物糊粉層中控制轉錄的基因,GAMYB以GA依賴的方式促進α-淀粉酶基因的表達[8]。休眠是由被控制的激素信號網絡維持和嚴格調節的, 幾乎沒有發現, 由GA20-氧化酶基因表達水平引起的GA 含量和激素生物合成的增加降低后熟種子的ABA 敏感性和增加GA 的敏感性; 然而, 當休眠降低時, GA分解代謝基因GA2-氧化酶的表達則有下降的趨勢。此外, 隨著后熟, GA 受體GID1 增加; 當休眠解除時,由于ABA 的分解代謝增加, ABA 的積累減少[44]。其他激素, 包括茉莉酸異亮氨酸(jasmonic acid isoleucine)、油菜素內酯(brassinosteroid, BR)和吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid, IAA), 也參與種子休眠, 從而導致種子在穗上萌發或成熟前萌發[8,45](圖1)。另外, DELLA 因子促進種子中ABA 的積累; 缺乏DELLA 因子的胚乳釋放較少的 ABA[46-47], 以及DELLA 因子缺陷的突變體種子即使在低溫下也完全是非休眠的[48]。然而, 在深休眠的種子中, 外源GA 不能下調RGL2 蛋白的水平, 也不能顯著地促進種子萌發[47], 這也許是因為ABA 也能夠以不依賴GA 的作用增加DELLA 蛋白水平[46]。因此, 休眠可能是一種缺乏GA 介導的DELLA 因子降解的狀態,從而觸發種子中組成性的高ABA 積累。

ABA/GA 比率也調控種子的休眠狀態, 而其他植物激素, 包括乙烯(ethylene, ET)、BR、茉莉酸( jasmonic acid, JA)、水楊酸(salicylic acid, SA)、細胞分裂素(cytokinin, CTK)和獨腳金內酯(strigolactone,SL), 也通過影響ABA 和GA 的水平和信號轉導來調控種子休眠[8](圖1)。在種子休眠過程中, 內源/外源ABA 水平是通過類胡蘿卜素(carotenoid)前體的解體和不同種子組織中8’-羥基化沉默來精確調節激素的產生[15]。在種子脫落后, 除GA 外, ABA 的分解在種子萌發之前發生, 從而解除休眠。研究表明,ABA/GA 的比率也整合了環境因素例如光照、溫度和氨態氮, 并對胚的發育和胚乳弱化起作用[8,38](圖1)。

2 DOG1 調控種子休眠的作用機制

2.1 DOG1 調控種子休眠的分子機制

DOG1 是一種血紅素(heme)結合蛋白, 是擬南芥種子休眠的重要調控因子[7,17,49]; 其顯著功能是誘導種子休眠, 包括溫度依賴的休眠[50-53]。研究發現, 種子成熟時的溫度越低, 休眠程度越高,DOG1-mRNA 和蛋白的水平也增加[50]。在擬南芥中,DOG1基因由3 個外顯子(exon)和2 個內含子(intron)組成, 其中, 第2 個內含子被可變剪接(alternative splice), 從而產生 5 個轉錄變異體(transcript variant)[54]; 由于β、γ 和ε 轉錄本的翻譯產生相同的蛋白, 因此, 只產生3 種不同的蛋白異構體[17,55]。短DOG1-ε 不包含第3 個外顯子, 但含有第2 個外顯子的一部分[56]。新生的mRNA-ε 是通過可變多聚腺苷酸化(alternative polyadenylation)而不是通過可變剪接形成的[57-58]。DOG1α、β、γ、δ 和ε 蛋白異構體都具有生物學功能[54]。DOG1-α、-β 和-δ 定位于細胞核內, DOG1-β 比其他異構體豐富[54]。短DOG1-ε蛋白異構體的積累足夠產生休眠表型, 即短DOG1-mRNA 在體內被翻譯, 產生的DOG1 蛋白也在控制種子休眠的建立中起作用[56]。在擬南芥中,短ε-mRNA 最豐富, 產生與β-和γ-mRNA 相同的蛋白; 這種短DOG1 蛋白異構體比其他2 種蛋白異構體更保守, 因為第3 個外顯子在其他物種中高度可變甚至被丟失, 以及在休眠誘導中也最為活躍。Nakabayashi 等[54]描述, 所有的DOG1 蛋白異構體都表現出自身結合的特性, 這種自身結合能力的喪失不改變蛋白水平, 但引起非休眠表型: 即DOG1 蛋白的功能通過其自身結合的特性增加。因此, 在不同的DOG1 異構體中二聚體的形成對于DOG1 功能的精確調控是必需的。在種子成熟的最后階段, 盡管DOG1 蛋白的豐度沒有減少, 但DOG1轉錄本的水平顯著下降[59]。

在擬南芥基因組中有5種類DOG1(DOG1-LIKE,DOGL)基因,DOGL1、DOGL2、DOGL3、DOGL4和DOGL5[5]。DOGL1～DOGL4位于4號染色體上, 彼此相鄰, 而DOGL5位于3號染色體上。DOGL1、DOGL2和DOGL3與DOG1相對類似, 而DOGL4和DOGL5在氨基酸序列上分別與DOG1只有28%和30%的相似性[5]。與擬南芥類似, 在一些雙子葉和許多單子葉植物中也發現了DOG1基因[17]。在所研究的雙子葉植物中, DOG1之間的氨基酸序列相似性很高[60-61]。許多單子葉植物中也存在DOGL基因,如大麥、小麥、水稻、玉米(Zeamays)、高粱和二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)[3,60,62]。

張洋洋[63]從發育中的水稻9311 (O.sativaL.‘9311’, 非休眠)種子中克隆了AtDOG1的同源基因OsDOG1L1和OsDOG1L2, 并研究了這2個基因在9311和東鄉野生稻 (O.rufipogonGriff., 休眠)種子發育和萌發過程中的表達變化。OsDOG1L1位于1號染色體上, 含有2個外顯子和1個內含子;Os-DOG1L2位于5號染色體上, 不含內含子。比較分析這2個基因編碼的蛋白的氨基酸序列和二級結構發現, 它們都含有與AtDOG1相同的結構域和保守結構域。利用實時定量PCR技術分別比較了OsDOG1L1和OsDOG1L2在9311和東鄉野生稻種子發育和萌發過程中的表達變化, 結果表明在東鄉野生稻胚中,OsDOG1L2的表達量在發育和萌發過程中增加, 而在9311胚中則降低。因此推測,OsDOG1L2與種子的休眠與萌發顯著相關[63]。

DOG1與2種磷酸酶AHG1 (ABAHYPERSENSITIVE GERMINATION 1)和AHG3發生物理相互作用, 在種子休眠解除中在功能上阻斷它們必需的下游作用[17,64-65](圖2)。AHG1和AHG3屬于A分枝2C型PP2C家族(clade-A type 2C PP2C family); 在擬南芥中有9個成員, 作為ABA信號轉導和種子休眠的負調控因子起作用[64-65]。因此, 當DOG1蛋白水平增加時, 不僅增加種子的休眠和ABA敏感性[59], 而且在ahg1-ahg3雙突變體中也增加種子的休眠和ABA敏感性[64]。同樣,ahg1-1ahg3-1hai3-1三重突變體的種子具有更強的休眠, 從而提出至少AHG1、AHG3和HAI3 (HIGHLY ABAINDUCED PP2C GENE3)參與休眠的調控[65]。此外,DOG1通過抑制專一的PP2C的作用來控制休眠,PP2C作為ABA和DOG1途徑的交匯點起作用[64]。另一方面, 在休眠過程中, DOG1與血紅素基團的結合對于DOG1的作用也是必需的[65]。血紅素是一種結合鐵的原卟啉IX (protoporphyrin IX), 調控不同的生物學活性, 如信號轉導; 但其在ABA信號轉導中的作用研究仍處于初期階段。DOG1與AHG1或者血紅素的結合似乎是一個獨立的過程, 盡管這2個過程對DOG1在體內的功能是必需的[66]。像DOG1一樣,DOGL3和DOGL5也與PP2C結合,DOGL3的過表達導致種子萌發時ABA過敏感, 而DOGL5過表達不引起種子對ABA的敏感性增加[66]。

圖2 擬南芥種子休眠的DOG1基因(啟動子為紅色, 編碼區為綠色)的轉錄調控模型Fig. 2 A model for the transcriptional regulation of DOG1 gene (promotor in red; coding region in green) to induce dormancy in Arabidopsis thaliana seeds

2.2 直接參與DOG1功能的轉錄因子

種子成熟是其發育的重要階段, 包括儲藏物積累、胚生長停止、耐脫水性和休眠特性的獲得[1,67]。雖然有許多轉錄因子專一地與種子成熟相關, 但只有ABI3、FUS3 (FUSCA3)、LEC1 (LEAFY COTYLEDON 1)和LEC2被認為是擬南芥種子中的關鍵調控因子[4-5,17](圖2)。這些轉錄因子的突變引起種子成熟發生變化, 包括種子貯藏蛋白(seed storage protein, SSP)的積累, ABA敏感性和種子休眠程度,例如, 突變體abi3-lec1和abi3-fus3表現出SSP含量顯著降低, 產生嚴重的胎生現象(viviparism)[4-5,68]。研究表明,DOG1的表達間接地依賴于LEC1[69-70]。然而, LEC1與DOG1啟動子之間沒有直接地相互作用。在lec1突變體中,DOG1的基因活性降低。ABI3、FUS3和LEC2都包含一個B3 DNA結合結構域, 該結構域專一地識別許多成熟相關基因啟動子區域中存在的RY (CATGCA (TG))基序[62,69]。AtDOG1啟動子中存在一個RY基序, 其在種子發育中的轉錄模式表明,DOG1很可能被上述至少一個轉錄因子調控[59]。bZIP67是大豆(Glycinemax)中參與SSP沉積的幾個基因的調控因子[71]; 在種子成熟過程中,bZIP67在LEC1下游起作用, 反式激活DOG1, 有助于擬南芥種子產生休眠[17,72](圖2)。研究證明, (1)bZIP67是DOG1表達和DOG1積累所必需的; (2)bZIP67和DOG1在功能上可能屬于同一途徑; (3)bZIP67可能通過控制DOG1的表達有助于休眠的調控; (4) DOG1由LEC1誘導, 這一過程發生在bZIP67誘導之后; (5) 體內外試驗表明, bZIP67通過GBL順式元件與DOG1啟動子結合; (6) 種子成熟過程中, 低溫條件增加bZIP67的數量, 但不增加bZIP67-mRNA的數量[72]。

2.3 DOG1與ABA和乙烯信號

DOG1和ABA的協同作用引起休眠, 這是種子發育過程中的一個顯著特征[35,58], 即DOG1對休眠的調控在功能上需要ABA信號途徑[5]。盡管dog1的休眠表型類似于ABA合成和信號轉導的突變體[65,73],但現有的證據表明DOG1和ABA以獨立的途徑起作用。近等基因系(near isogenic line, NIL) DOG1-Cvi(強DOG1表達)與ABA缺陷突變體aba1-1(ABA生物合成缺陷和種子休眠缺乏)的整合仍然產生非休眠的種子[74], 這些結果表明, ABA對于DOG1在種子休眠中的作用是不可缺少的, 盡管在缺乏DOG1的情況下ABA不能強加種子休眠[74]。ABA和DOG1必須同時存在以誘導休眠, 因為這2個調控因子中的一個因子缺乏都將導致休眠的完全喪失, 即使當另一個調控因子被高度積累[49,73-74]。

ABI3和ABI5編碼ABA依賴的必需轉錄因子,是種子中ABA信號轉導中的2個主要組分。Zhao等[75]表明, ABI5與休眠有關, DOG1通過調控ABI5的表達來控制休眠。此外, DOG1通過激活種子成熟基因和抑制萌發相關基因來刺激ABI5的表達[52]。Dekkers等[76]也證明, DOG1與PP2C相互作用, 從而促進ABI5的表達和種子休眠; 即ABA的積累和ABI5的活性有助于種子休眠的維持。

體內下拉試驗(pull-down experimentinvivo)表明, 有184組蛋白與DOG1直接相互作用, 這些結果顯示DOG1與ABA反應有關的蛋白相互作用[51,64]。這些下拉蛋白中包括一些PP2C家族成員[64-65]。在ABA信號轉導途徑中, DOG1在AHG1的上游起作用, 并以ABA依賴的方式直接調控AHG1的PP2C活性[64]。在擬南芥中, DOG1蛋白N端區域中1～18殘基的缺失對與AHG1的相互作用和休眠的誘導均有強大的負作用[65]。這種缺失阻止了DOG1賦予ABA過敏感表型的能力, 表明與AHG1的相互作用對于DOG1在休眠和萌發控制中的作用是必不可少的。相反, C-端區域257～291殘基的缺失不影響DOG1與AHG1的相互作用[65]。Nishimura等[65]證明,DOG1的DSYLEW N-端序列(跨越位置13～18)對于與AHG1的相互作用是必需的。因此, DOG1通過與AHG1和AHG3的結合增加ABA的信號轉導[64]。此外, DOG1的存在降低了其靶子SnRK2上的AHG1活性, 與PYL/PYR/RCAR相同, DOG1通過抑制AHG1的PP2C活性來正調控SnRK2的活性[65]。

Li等[77]在擬南芥中發現了一個調節初生休眠的模塊。DOG1在ETR1 (ethylene receptor 1)/RDO3(reduced dormancy 3)和ERF12 (ethylene-responsive transcription factor-12, ERF-1B家族成員)的下游起作用;RDO3編碼一種乙烯受體ETR1(圖2)。事實上,ERF12直接與DOG1啟動子結合, 在細胞核過程中招募輔阻遏因子TPL (TOPLESS), 以及抑制DOG1的表達。同樣, 雙突變體tpl-9dog1-2的遺傳分析表明, TPL對休眠的調控依賴于DOG1[78]。此外, 擬南芥中的轉錄抑制因子ERF12和TPL通過抑制DOG1途徑來促進種子萌發; ERF12在ETR1的下游起作用,參與調控由RDO3介導的休眠; ETR1和ERF12可能通過DOG1途徑調控休眠[77]; 以及ERF12與DOG1的啟動子結合并抑制其表達[17](圖2)。Li等[77]提出,ETR1/RDO3-ERF12-TPL-DOG1模塊的作用是乙烯控制休眠機制的一個重要部分。

3 種子休眠與萌發的表觀遺傳調控

3.1 表觀遺傳對種子休眠與萌發的調控

植物通過激活信號途徑對環境刺激起反應, 信號途徑迅速修飾反應基因的轉錄速率并誘導生理反應[79]。對于不可避免地暴露于每天和季節性環境變化的陸生植物, 發育重編程(development reprogramming)和對環境刺激的反應尤為重要[80]。環境條件可以誘導植物的適應性表觀遺傳反應(adaptive epigenetic response), 并且這種影響可以持續數代[81]。在種子中, 表觀遺傳過程在許多關鍵的溫度響應基因的調節中起作用, 包括DOG1和FLC(FLOWERINGLOCUSC)[82-83]。轉錄調控包括多個層次, 組蛋白(histone)的翻譯后修飾(post-translational modifification, PTM)是一個重要的調控過程。組蛋白修飾通過建立全染色質環境和協調基于DNA的生物學過程來影響基因表達和基因組功能[84]。染色質結構顯著地受環境相關的重編程過程的影響[83,85]。組蛋白上專一賴氨酸殘基的乙酰化(acetylation)以及賴氨酸和精氨酸殘基的甲基化(methylation)在基因表達的調節中起關鍵作用。活性基因的啟動子區域降低了核小體(nucleosome)的占有率, 增加了組蛋白的乙酰化和組蛋白3賴氨酸4 (H3K4)的甲基化,而H3K27甲基化水平的增加與基因抑制相關[84]。H3K27、H3K9、H4K20、H3K79和H2BK5的單甲基化(monomethylation)都與基因的激活有關, 而H3K27、H3K9和H3K79的三甲基化(trimethylation)都與基因的抑制有關[84]。許多研究表明, 染色質重塑(chromatin remodeling)在種子萌發過程中起重要作用。組蛋白H3K4的三甲基化通過調控AHG3的表達在ABA驅動的種子萌發抑制中起作用[86]。Wolny等[87]表明, 在種子成熟和萌發過程中, 二穗短柄草胚中的組蛋白H3和H4的乙酰化模式比DNA甲基化的模式更為活躍。根據染色質重塑對擬南芥種子休眠循環的分析表明,DOG1上三甲基化的H3K4 (H3K4me3)和H3K27me3隨著季節性環境信號的變化而發生改變[88]。

對種子庫中休眠循環期間通過組蛋白2B (H2B)與染色質重塑有關的基因表達分析表明, 基因沉默阻遏因子(gene-silencing repressor)ROS1(REPRESSOROF SILENCING1)的表達與休眠呈正相關, 而抑制的組蛋白甲基轉移酶(repressive histone methyl transferase) CLF (Curly leaf)和沉默的KYP/SUVH4(Kryptonite)啟動子則相反[88]。ROS1依賴的沉默抑制,以及CLF和KYP/SUVH4依賴的基因抑制與沉默對于維持和抑制休眠是重要的[88]。DOG1上的組蛋白標記H3K4me3和H3K27me3的變化與季節性環境信號有關。在種子休眠降低過程中, H3K27me3抑制性標記在光照下緩慢積累和增加, 完成休眠解除[88]。研究表明, 染色質重塑因子PKL (Pickle)在種子萌發過程中抑制胚性狀的表達[89]。在pkl擬南芥幼苗中, GA促進種子相關性狀的抑制[90]。組蛋白脫乙酰酶(histone deacetylases) HDA6和HDA19通過抑制胚特異性基因(包括LEC1、FUS3和ABI3)來調節萌發[91-93]。

3.2 基因組印記調控種子休眠的建立與釋放

3.2.1 胚乳的基因組印跡由配子中的表觀遺傳機制建立 基因組印記(genomic imprinting)是一個給定的親本等位基因對其他親本等位基因的優先表達,這種現象在哺乳動物和種子植物中都能觀察到[94]。有花植物的種子由胚、胚乳和種皮組成。種皮來源于母體珠被的孢子體組織, 但胚和胚乳是通過雙受精形成的。受精后, 親本專一的基因表達模式是雄性和雌性配子發生過程中受精前的表觀遺傳機制的結果[94-95]。由此產生的不對稱表觀遺傳修飾(asymmetric epigenetic modification)被稱為印記(imprint)[96], 引起等位基因在母系活躍和父系沉默被稱為母系表達基因(maternally expressed gene,MEG), 或者父系活躍和母系沉默被稱為父系表達基因(paternally expressed gene, PEG)。

母系表達基因的建立。胞嘧啶C-5位置的DNA甲基化是一種典型的沉默標記(silencing mark), 這種標記在植物中發生在3種不同的序列: CG、CHG和CHH, 其中H相應于A、T或G[97]。通過堿基切除修復依賴的DNA去甲基化, 5-甲基胞嘧啶的去除由類DEMETER DNA糖基化酶(DEMETER-like DNA glycosylase)介導[98]。DNA糖基化酶DEMETER(DME)在雌性配子體(gametophyte)的中央細胞中具有活性, 但在精子細胞中不具有活性[99], 由于胚乳中MEG的母系等位基因的局部低甲基化, 導致母系偏向的基因表達(maternally-biased gene expression)[100-101]。DME激活了2個基因FIS2(FERTILIZATION INDEPENDENT SEED 2)和MEA(MEDEA), 它們編碼中央細胞和胚乳專一的FISPRC2 (Polycomb Repressive Complex 2)組分[102]。FIS-PRC2在PEG母系等位基因上的組蛋白H3的賴氨酸27上建立三甲基化標記(H3K27me3), 導致其抑制[94]。H3K27me3的去甲基化由JMJ (Jumonji-type)組蛋白去甲基化酶(JMJ histone demethylase)介導,這些酶對PRC2起拮抗作用[103]。研究表明, JMJ組蛋白去甲基化酶REF6 (RELATIVE OF EARLY FLOWERING 6)和ELF6 (EARLY FLOWERING 6)通過激活MEG的母系等位基因來控制種子休眠[104-106]。

MEG的父系等位基因的抑制由甲基轉移酶1(methyltransferase 1, MET1)介導, MET1在DNA復制過程中維持CG形式的甲基化。父系MET1功能的喪失足以激活MEG的父系等位基因, 從而消除其母系偏向的表達[107]。除MET1介導的CGm外, 營養細胞和精細胞中RNA指導的DNA甲基化(RNAdirected DNA methylation, RdDM)途徑對抑制MEG的父系等位基因也是重要的; 這一過程可能參與小分子干擾RNA (small interfering RNA, siRNA)的細胞間運動[108-109]。在這一途徑中, 花粉營養細胞中DME和ROS1的激活導致轉座子(transposable element)上甲基化胞嘧啶的切除, 引起轉座子表達的激活和siRNA的產生, siRNA從營養細胞移動到精細胞, 在靶區域建立CHHm[110-111]。這些siRNA優先在精細胞中的MEG位點積累[110]。

父系表達基因的建立。除DME直接激活中央細胞中編碼PRC2組分的基因功能外, 通過DME去除DNA甲基化有助于PRC2介導的H3K27me3沉積的范圍, 因為DNA甲基化和H3K27me3是相互拮抗的[100,112-113]。母系專一的H3K27me3與父系偏向的表達(paternally-biased expression)相關[100],除H3K27me3外, 組蛋白H3的賴氨酸9上的二甲基化(H3K9me2)和母系等位基因上的CHGm的存在是穩定父系偏向表達的標志[100,114-115]。PRC2組分FIE(FERTILIZATION INDEPENDENT ENDOSPERM)的缺失引起胚乳中CHGm的減少, 表明PEG上CHGm的建立依賴于FIS-PRC2活性[114]。PEG的父系等位基因的活性狀態與精子中起作用的表觀遺傳重置(epigenetic resetting)機制有關, 引起H3K27me3的去除。這種表觀遺傳重置的一個關鍵組分是精細胞專一的組蛋白變體H3.10, 它取代了組蛋白變體H3.1和H3.3。H3.10在賴氨酸27周圍存在很大的差異, 因此不被PRC2靶定[116]。這與精子中H3K27me3去甲基化酶的活性一起, 引起精子基因組大多數位置上的H3K27me3去除[117]。受精后, MADS-box轉錄因子PHE1 (PHERES 1)結合并激活父系PEG等位基因, 可能阻止它們在受精后被PRC2活性沉默[118]。是否需要重置H3K27me3才能允許PHE1激活其靶子仍有待研究。

3.2.2 基因組印記控制種子休眠 與單一的H3K27me3相比, 穩定的父系偏向表達與母系等位基因上存在的三重抑制標記H3K27me3、H3K9me2和CHGm (H3K27me3/H3K9me2/CHGm)緊密相關[114]。事實上, 表觀遺傳標記(epigenetic mark)的不同組合決定擬南芥發育胚乳中母系等位基因的活性狀態。盡管由三重抑制標記作記號的母系等位基因在胚乳發育過程中趨于沉默, 但僅僅由H3K27me3標記的等位基因很可能被激活, 并在控制種子休眠中起重要作用[2,104]。Sato和K?hler[2]描述了胚乳中由親本專一的表觀遺傳修飾標記的基因的調節及其以親本特異的方式在控制種子休眠中的作用(圖3)。

圖3 描述親本等位基因的不同表觀遺傳修飾組合如何影響胚乳基因表達和控制種子休眠的模型Fig. 3 Model depicting how different combinations of epigenetic modifications on parental alleles affect gene expression in the endosperm and control seed dormancy

母系等位基因上具有單一H3K27me3的基因控制種子休眠。許多由單一H3K27me3標記的基因在萌發過程中被誘導, 并富含與乙烯反應相關的功能[104]。研究發現, 乙烯通過細胞松弛促進萌發, 表明H3K27me3的去除通過激活乙烯反應在促進種子萌發中起作用[119]。與該結果一致, H3K27me3去甲基化酶REF6/ELF6的突變體表現出種子休眠增加和許多由單一H3K27me3標記的基因表達減少[104-105]。有趣的是, 具有單一H3K27me3的基因在休眠種子中表現出母系偏向的表達模式, 但在非休眠種子中不表現出母系偏向的表達模式[104,106], 這與CHHm在父系等位基因上的積累有關[120]。冷誘導的CHHm由非典型RdDM途徑介導[121], 冷敏感性與冷誘導的AGO6 (ARGONATE 6)積累相關[120]。這些結果表明,母系專一的種子休眠控制由2種不同的表觀遺傳機制介導: H3K27me3的去除引起母系等位基因的激活,冷誘導的母系等位基因的沉默通過CHHm產生。因此, 親代專一的表觀遺傳標記不僅在受精后, 而且在種子發育后期, 可以引起親代特異的表達模式, 從而對種子發育產生親代的特異性影響[2](圖3)。

REF6靶子CYP707A1和CYP707A3編碼細胞色素P450單加氧酶(cytochrome P450 monooxygenase),該酶通過分解代謝ABA來誘導萌發[105]。在ref6突變體的胚乳中, 這2個基因在種子萌發過程中都被顯著地下調[104],CYP707A3在發育的胚乳中表現出母系偏向的表達[100-101]。然而, 在授粉后4 d的胚乳中, 這2個基因在母系等位基因上都沒有檢測到H3K27me3[100], 表明REF6在授粉后的4 d前在受精前的中央細胞中起作用。同樣, 在種子休眠中具有已知作用的2個MEG, 半胱氨酸蛋白酶1(CYSTEINEPROTEASE1,CP1)和尿囊素酶(ALLANTOINASE,ALN)在授粉后4 d的胚乳中的母系等位基因上也沒有檢測到H3K27me3[100,106,120]。與CYP707A1和CYP707A3類似, 這2個基因在種子萌發過程中在ref6突變體的胚乳中被下調[104], 表明其REF6介導的激活發生在授粉后的4 d之前。REF6在雌配子體中央細胞中的可能作用也被遺傳結果所支持, 表明母系同源和異源的ref6突變體增加了種子休眠[104]。然而, 因為由H3K27me3標記的REF6靶子在授粉后4 d被檢測到, 表明REF6至少有2個不同的作用時間點: 一個在受精前, 一個在胚乳發育后期。為了確定REF6的作用時間和了解早期和后期REF6靶子之間的差異需要做進一步的研究。

具有三重H3K27me3/H3K9me2/CHGm抑制標記的基因保持穩定的印跡。具有單一H3K27me3的基因在萌發過程中被REF6/ELF6的活性激活, 與這些基因相反, 三重抑制標記H3K27me3/H3K9me2/CHGm的存在可能阻止REF6/ELF6靶向和激活一些基因[104], 與CHGm阻止REF6的結合活性一致[122]。在SUVH4、SUVH5和SUVH6(suvh456)突變體中,H3K9me2和CHGm的缺失引起胚乳中具有三重抑制標記的基因在萌發過程中上調。在這些上調的基因中, 有關鍵的休眠調控因子ABI3[104,123], 這可能是導致suvh456和suvh45突變體休眠增加的原因[104,124]。同時, 這些結果表明, 存在一個由H3K27me3/H3K9me2/CHGm建立的胚乳專一的雙重控制層次,它們阻止基因在萌發過程中激活。含有三重修飾的母系等位基因在萌發過程中將受到抑制; 相反, 由單一H3K27me3標記的基因可能在萌發過程中被激活, 以及在控制這一過程中具有重要作用[2](圖3)。這種機制確保對種子休眠的母系控制, 從而有助于最大限度地成功繁殖。被和不被REF6/ELF6激活的基因之間的關鍵區別在于H3K27me3標記的等位基因上是否存在H3K9me2/CHGm, 這就表明SUVH456和CMT3在控制種子休眠中的關鍵作用。此外, 值得注意的是, 小部分具有三重標記的基因在萌發過程中被激活, 這顯示一種未知的分子機制可以消除這種表觀遺傳抑制。然而, 為了充分了解表觀遺傳修飾的動態及其對種子休眠的影響, 需要對萌發過程中胚乳的全基因組表觀遺傳譜進行研究[2]。

4 結語

種子休眠是植物在長期進化過程中所形成的一種適應性特征, 這種特征使植物能夠在逆境條件下存活[6], 包括延長種子儲存壽命[125]和防止種子在不利季節的短期有利條件下萌發所引起的幼苗死亡[1,126]。種子休眠是一種復雜的性狀, 由多種內源和外部因素共同決定; 其中ABA的水平及其信號轉導是種子休眠調控的主要因素[15,37]。研究發現, E3連接酶催化的泛素化(ubiquitination)有助于26S蛋白酶體介導的ABA受體PYR/PYL和PP2C蛋白的降解, 許多E3連接酶通過直接或間接的相互作用調節這些靶蛋白的穩定性。然而, E3連接酶是否直接泛素化SnRK2蛋白還不明確, 這限制了對E3連接酶介導的SnRK2蛋白穩定性調控的理解[37]。此外, 種子組織特別是胚和胚乳是如何協調控制休眠誘導和萌發的信號途徑以及響應環境條件如光照、溫度和硝酸鹽的作用也不清楚[15]。

DOG1是一種休眠誘導絕對必需的蛋白[7,17], 但目前的研究進展主要是基于擬南芥突變體種子, 以及與DOG1不同位點結合的輔因子特征。雖然DOG1的功能在被子植物中似乎是保守的, 但在單子葉植物和雙子葉植物種子休眠中的作用是否不同還需要做更多的研究。DOG1在什么發育階段起促進種子休眠的作用, 即DOG1的功能是在種子發育過程中還是在種子吸脹時起作用也有待研究[7]。Dekkers等[76]表明,DOG1在種子成熟過程中調控數百個基因的表達, 包括ABI5的表達, 并與ABI3發生遺傳相互作用以促進種子成熟。因此, 研究DOG1和ABA在種子成熟和萌發事件中的相互作用, 從而調控種子休眠將成為一個新的研究內容。

調控種子休眠的表觀遺傳效應發生在胚乳中,胚乳是一種唯一的在種子整個發育過程中具有親本專一的基因表達模式的種子組織[106-107]。這與胚中大量的雙等位基因(biallele)表達不同[127], 表明中央細胞/胚乳是建立母系決定的控制休眠的關鍵部位。胚乳不同于其他組織在于抑制性表觀遺傳修飾H3K27me3和H3K9me2/CHGm共存, 但這種共存通常在孢子體組織中不存在[114]。由于種子休眠受到環境條件的調控, 不同的環境條件是否以及如何影響親本專一的表觀遺傳修飾和基因組印記是不清楚的,揭示這些關系的研究將為休眠控制及其潛在的表觀遺傳機制提供新的知識。