高效液相色譜法（HPLC）測定樂脈丸中丹參素鈉含量

＊宋易 易琦銘

（貴州輕工職業技術學院 貴州 550025）

中藥制劑在世界各地尤其是亞洲地區具有悠久的歷史和廣泛的應用。樂脈丸是一種傳統的中藥制劑，主要用于治療心血管疾病，如心絞痛、心肌缺血、冠心病等[1]。

樂脈丸主要由丹參、川芎、赤芍等中藥材組成[6]，其中丹參素鈉是丹參的主要活性成分之一。近年來，許多研究已經采用HPLC對中藥制劑中的活性成分進行測定。然而，關于樂脈丸中丹參素鈉含量的HPLC測定研究相對較少。本研究通過建立一種可靠、準確的HPLC方法，用于測定樂脈丸中丹參素鈉的含量。通過對不同品牌、不同批次樂脈丸樣品的測定，評估其質量差異，為樂脈丸的質量控制和產品研發提供有力支持。

1.實驗部分

（1）儀器與試劑。高效液相色譜儀島津LC-20AT；色譜柱Waters XBridge C18（4.6mm×250mm，5μm）；電子天平奧豪斯EX125DZH；超聲清洗儀KQ-500DA（昆山市超聲儀有限公司）；移液槍L-1000大龍；丹參素鈉對照品中國食品藥品檢定研究院；冰醋酸科密歐；色譜甲醇TEDIA；樂脈丸貴州景峰制藥有限公司；樂脈丸康美保寧（四川）制藥有限公司。

（2）溶液配制。①對照品溶液的制備。稱取丹參素鈉對照品適量，精密稱定，加70%甲醇溶液制成每1mL含22.75μg的溶液，即得。②供試品溶液的制備。取樂脈丸粉末0.4g，精密稱定，置50mL具塞錐形瓶中，精密量取25mL 70%甲醇，稱定重量，超聲60min（功率100W，頻率40kHz，溫度4～10℃），用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，過濾，取續濾液經0.45μm微孔濾膜過濾，即得。

（3）色譜條件。色譜柱：Waters C18柱（4.6mm×250mm，Column），流動相以甲醇-0.2%冰醋酸（10:90），柱溫30℃，檢測波長280nm，流速1mL/min，進樣量10μL。理論塔板數按丹參素鈉峰計算應不低于6000。

2.結果與討論

(1)提取時間的考察

①提取溶劑體積分數篩選。分別用甲醇體積分數為：50%、70%、75%、80%、90%提取樂脈丸，按上述方法制備該供試品溶液，以上述色譜條件，采用HPLC法進行提取溶劑濃度篩選。

通過用不同體積分數的甲醇對樂脈丸進行提取并測定，實驗結果顯示，樂脈丸中70%甲醇提取時丹參素鈉的含量最高，其含量值為2.219mg/g，則最終本實驗中最佳提取甲醇體積分數為70%。

②提取時間的考察。按上述提取操作，70%甲醇為提取溶劑，將樂脈丸樣品分別超聲10min、20min、30min、45min、60min、70min，以上述的色譜條件，采用HPLC法進行超聲提取時間的篩選。

通過對不同超聲時間的考察，數據顯示，超聲隨著超聲（功率100W，頻率40kHz）時間的延長，樂脈丸中丹參素鈉的含量隨之增加，超聲60min與70min時含量值趨于平穩，考慮到節約時間時間最終本實驗中提取樂脈丸中丹參素鈉的超聲時間為60min。

(2)精密度

取丹參素鈉對照品溶液（22.75μg/mL），同一瓶對照品溶液，進樣6次，上述色譜條件，以丹參素鈉的峰面積計算，由結果計算其RSD值為0.28%，精密度達到要求。

(3)線性關系考察

取5個不同濃度的丹參素鈉對照品溶液，進樣量10μL，采用HPLC法對丹參素鈉進行測定，以丹參素鈉峰面積為縱坐標，以濃度為橫坐標，得線性回歸方程：y=6368.9x-6156.5（r=0.9999），范圍：0.1468～2.2945mg，結果見表1。

表1 線性關系考察

(4)重復性實驗

取同一批號的樂脈丸樣品，照上述方式制備該供試品溶液共6份，以丹參素鈉的峰面積計算，得丹參素鈉RSD=0.67%，重復性數據達到數據要求，供試品重現性良好。

(5)中間精密度實驗

由不同的操作人員，取同一批號樂脈丸，照上述方式制備供試品溶液6份，上述色譜條件，進行丹參素鈉含量測定，以丹參素鈉的峰面積計算，RSD值：1.32%。

(6)穩定性實驗

取前序制備的同一樣品溶液，同一瓶供試品依次在0h、2h、4h、6h、8h、12h的間隔時間內進樣，共測6次，以丹參素鈉面積計算，結果表明是否供試品在12h內丹參素鈉峰面積前后沒有明顯變化。

(7)加樣回收率試驗

取同一批號樂脈丸粉末0.2g，精密稱定，共6份，分別于50mL錐形瓶內，加入70%甲醇配制丹參素鈉對照品溶液0.505mg，按照“3.1.3”項下制備供試品溶液，按上述色譜條件，進行測定，計算丹參素鈉的平均加樣回收率為99.8%，RSD值為1.14%，達到準確度要求。

(8)耐用性變化實驗

①流速微小變化。分別以0.98mL/min、1.00mL/min、1.02mL/min為流速，測定樣品相關數據，考察其分離效果，結果見表2。

表2 流速的微小變化

由實驗結果表明，當流速出現微小變化時，理論塔板數、拖尾因子及分離度不受影響。

②流動相比例的微小變化。分別以流動相比例為甲醇-0.2%冰醋酸（12:88）；甲醇-0.2%冰醋酸（10:90）；甲醇-0.2%冰醋酸（8:92）；測定樣品相關數據，考察其分離效果，結果見表3。

表3 流動相比例的微小變化

實驗結果顯示，流動相的微小變化對樣品的分離效果無影響。

③柱溫的微小變化。分別以28℃、30℃、32℃為柱溫，測定樣品相關數據，考察其分離效果，結果見表4。

實驗結果表明，當柱溫出現微小變化時，實驗測定方法不受其影響。

(9)專屬性試驗

分別取丹參素鈉陰性樣品溶液、丹參素鈉對照品溶液、供試品溶液、溶劑（70%甲醇），進樣體積10μL，上述方法進行數據采集，結果見圖1、圖2、圖3、圖4。

圖1 溶劑

圖2 樂脈丸樣品

圖3 丹參素鈉對照品

圖4 缺丹參素鈉陰性樣品

溶劑與陰性樣品在丹參素鈉峰位置均無陰性干擾。

(10)樣品含量測定

按照上述方法制備供試品溶液，以上述色譜條件，測定6個批號的樂脈丸中丹參素鈉的含量，1～3為景峰制藥有限公司產品，4～6號為康美保寧（四川）制藥有限公司產品。實驗結果見表5。

表5 樂脈丸中丹參素鈉含量測定統計表

由數據顯示，兩種不同品牌間3個批次的樂脈丸中丹參素鈉的含量值相差無幾。

3.討論

通過文獻[7-9]閱讀，經過多次方法調整，對樂脈丸樣品提取時甲醇溶劑體積分數、提取時間的考察，結果表明70%甲醇提取效果最好，超聲60min時丹參素鈉的含量最高。實驗中通過對色譜條件中流速、流動相及柱溫的微小變化進行實驗，由實驗結果表明，從樣品中檢測出的丹參素鈉峰形、拖尾因子和對稱性來看，當流速、流動相及柱溫發生微小改變時，拖尾因子、分離效果與對稱性不理想，比較下來，則選擇流動相比例為甲醇-0.2%冰醋酸（10:90），流速為1mL/min，柱溫為30℃。

為研究市面不同品牌樂脈丸質量差異，對兩種不同品牌的樂脈丸中丹參素鈉含量進行測定，發現其丹參素鈉含量相當，質量幾乎無差別。

未來，我們將繼續優化實驗方法，同時測定樂脈丸中不同成分的含量，以期更全面的對樂脈丸的質量進行評價，為中藥質量控制和產品研發做出更多貢獻。