G1期纖毛細胞器對宿主細胞PEDV敏感性的調控

摘要：" 本研究旨在分析宿主細胞周期對豬流行性腹瀉病毒（PEDV）增殖能力的調控效果。使用PEDV分別感染豬睪丸（ST）細胞、豬小腸上皮（IPEC-J2）細胞，用流式細胞術（FACS）和免疫印跡（WB）技術鑒定細胞周期，用免疫熒光法觀察纖毛組裝效果，通過測定半數組織培養感染劑量（TCID50）鑒定病毒的增殖能力。結果表明，PEDV感染ST細胞、IPEC-J2細胞7 h后，會導致宿主細胞阻滯于合成期（S期），感染31 h后則會導致宿主細胞阻滯于合成前期（G1期）；FACS、WB檢測結果證實，通過雙胸苷（Thy）釋放協同諾考達唑（Noc）能夠將細胞周期分別阻滯于G1-S轉換期、S期和細胞分裂期（M期）；PEDV（MOI=1）感染處于各細胞周期的ST、IPEC-J2細胞，同步化于G1-S轉換期的細胞感染PEDV后的TCID50最高，誘導纖毛去組裝的細胞對PEDV的敏感性下降。由研究結果可知，PEDV感染導致宿主細胞阻滯于G1-S轉換期，G1期細胞因具有纖毛細胞器而最有利于PEDV增殖。

關鍵詞：" 豬流行性腹瀉病毒（PEDV）；細胞周期；細胞同步化；ST細胞；IPEC-J2細胞；纖毛

中圖分類號：" S852.65""" 文獻標識碼：" A""" 文章編號：" 1000-4440（2024）12-2302-08

收稿日期：2024-12-06

基金項目：江蘇省自然科學基金-青年基金項目（BK20220748）；國家自然科學基金-青年科學基金項目（32300577）；江蘇省重點研發計劃-社會發展項目（BE2022787）;江蘇省農業科技自主創新基金全產業鏈關鍵技術協同創新項目

作者簡介：莊騰寒（1991-），男，上海人，博士，助理研究員，主要從事病毒-細胞互作機制和細胞工程改造及工藝放大等相關方面的研究。（E-mail）zhuangtenghan@foxmail.com

通訊作者：馮" 磊，（E-mail）fenglei@jaas.ac.cn；莊騰寒，（E-mail）zhuangtenghan@foxmail.com

莊騰寒，楊" 鵬，馬心宇，等. G1期纖毛細胞器對宿主細胞PEDV敏感性的調控［J］. 江蘇農業學報，2024，40（12）：2302-2309.

doi：10.3969/j.issn.1000-4440.2024.12.013

Regulation of cilia in G1 phase on the susceptibility of host cells to PEDV

ZHUANG Tenghan1，" YANG Peng2，" MA Xinyu2，" XU Yue1，" CHEN Li1，" BAO Xi1，" YANG Danchen2，" FENG Lei1

（1.Institute of Veterinary Immunology and Engineering， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China;2.College of Veterinary Medicine， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China）

Abstract：" This study aimed to research on the regulation of host cell cycle on porcine epidemic diarrhea virus （PEDV） proliferation. Swine testis （ST） and intestinal porcine epithelial cell line-J2 （IPEC-J2） cells were infected using PEDV with multiplicity of infection （MOI）=1， and the cell cycle was identified by fluorescence activated cell sorting （FACS） and Western blot （WB）. Ciliary assembly was observed by immunofluorescence. Medium tissue culture infective dose （TCID50） was measured to identify virus proliferation ability. PEDV infected ST cells and IPEC-J2 cells， and the host cells were arrested at the synthesis phase （S phase） and the pre-synthesis phase （G1 phase） after infection of 7 h and 31 h， respectively. FACS and WB tests confirmed that the use of double-thymidine release in coordination with nocodazole could block the cell cycle in the G1-S transition phase， S phase and cell division phase （M phase）， respectively. PEDV （MOI=1） infected synchronized ST cells and IPEC-J2 cells， and the TCID50 of cells synchronized in the G1-S transition phase was the highest after PEDV infection. Cells with ciliary disassembly were less sensitive to PEDV. PEDV infection arrested cell cycle to G1-S transition. Cells in G1 phase were most conducive to PEDV proliferation due to cilia.

Key words：" porcine epidemic diarrhea virus （PEDV）;cell cycle;cell synchronization;ST cells;IPEC-J2 cells;cilia

豬流行性腹瀉病毒（PEDV）是α冠狀病毒屬成員，可引起急性新生仔豬腹瀉、嘔吐、脫水和死亡。PEDV于20世紀70年代末首次在英國出現，自2010年以來，中國、美國、日本、韓國和越南相繼暴發了豬流行性腹瀉，其他國家隨后也報道了疫情，該病對全球養豬業造成了重大經濟損失。

病毒必須依靠宿主細胞資源來完成自身的復制，常見機制是通過改變宿主細胞周期等生物過程，從而獲得有利于自身復制的條件。冠狀病毒根據自身復制的特點，進化出了多種調控宿主細胞周期的策略，如通過調節細胞周期相關蛋白質、p53信號通路和細胞凋亡相關通路調控細胞周期。細胞周期阻滯可能會抑制被感染細胞的早期死亡，使細胞逃避免疫防御，或者幫助促進病毒組裝。目前，雖然冠狀病毒介導的宿主細胞周期阻滯機制已經被廣泛研究，但仍有許多問題尚不清楚，關于病毒在細胞周期被阻滯的細胞中的復制情況仍有待研究。

本研究分別從感染PEDV后對宿主細胞周期的影響和將細胞同步化于特定細胞周期或去組裝纖毛后接毒檢測半數組織培養感染劑量（TCID50）2個方面進行研究，對于揭示PEDV和細胞周期的相互關系及相互調控作用，以及以此為依據進行PEDV新疫苗的開發和生產具有重要的意義。

1" 材料與方法

1.1" 病毒、細胞、抗體和試劑

PEDV（AH2012/12株）、豬睪丸（ST）細胞為本實驗室留存。豬小腸上皮（IPEC-J2）細胞購自北納生物-河南省工業微生物菌種工程技術研究中心。

細胞周期蛋白（Cyclin） A、Cyclin E、Cyclin B、乙酰化-α-微管蛋白（AcTub）、α-微管蛋白、纖毛內轉運（IFT）88蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）等多克隆抗體和羊抗兔免疫球蛋白（IgG）-辣根過氧化物酶（HRP）抗體均購自武漢愛博泰克生物科技有限公司。抗PEDV核衣殼（N）蛋白抗體購自北京溯本源和生物科技有限公司。

胸苷（Thy）、諾考達唑（Noc）購自Sigma公司。DMEM培養基、胎牛血清購自賽默飛世爾科技公司。碘化丙啶（PI）染色液購自BD公司。

1.2" 細胞同步化

用2.5 mmol/L Thy處理ST或IPEC-J2細胞17 h，然后在新鮮培養基中釋放10 h。細胞經第2輪16 h的2.5 mmol/L Thy處理后阻滯于合成前期-合成期（G1-S）轉換期。隨后，使用新鮮培養基釋放細胞4～5 h至合成期（S期）。

用5 μmol/L Noc處理細胞6 h，將細胞阻滯于細胞分裂期（M期）。用含有0.5%血清的培養基培養并誘導細胞進入靜止期（G0期）。

1.3" 流式細胞術（FACS）

將ST、IPEC-J2細胞固定于-20 ℃預冷的70%乙醇中過夜，用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗后重懸細胞，使用PI于室溫染色30 min，用AccuriTM C6流式細胞儀收集細胞周期分布數據，用FlowJo軟件分析并作圖。

1.4" 免疫印跡（WB）鑒定

將ST、IPEC-J2細胞分別接種于6孔板中，培養24～48 h后加入細胞裂解液，離心后取上清液，對蛋白質樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，將蛋白質樣品轉至硝酸纖維素膜上后，在室溫下用1%脫脂奶粉封閉1 h；用一抗（按1∶1 000的體積比稀釋于1%脫脂奶粉溶液中）于4 ℃孵育過夜，再用二抗（抗體與1%脫脂奶粉溶液體積比為1∶5 000）于室溫孵育1 h；通過化學發光法顯影觀察并記錄Western blotting（WB）結果。

1.5" PEDV TCID50的測定

將ST、IPEC-J2 細胞接種于96孔板中，待細胞匯合度生長至95%時，接入待測PEDV。在無菌1.5 mL離心管中，用加入10 μg/mL胰酶的DMEM培養基對病毒進行10倍體積連續稀釋，取各稀釋度的病毒液依次接種到96孔板中，每孔接種100 μL，每個稀釋度設置8個重復孔。同時，以正常ST、IPEC-J2細胞作為對照。將96孔板置于37 ℃、5% CO2細胞恒溫培養箱中培養48 h，觀察細胞病變（CPE）情況并計數，按照Reed-Muench法測定病毒的TCID50。

1.6" 免疫熒光染色

分別將ST、IPEC-J2細胞接種于17 mm載玻片上，用含有0.5%血清的培養基培養細胞，于36～72 h誘導纖毛組裝，用含有4%多聚甲醛的溶液于室溫固定細胞20 min，用含有0.2% Triton的溶液對細胞進行打孔，用乙酰化-α-微管蛋白（纖毛指示物）標記纖毛，用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）標記DNA。

1.7" RNA干擾

將ST細胞分別接種于17 mm載玻片上，轉染IFT88 siRNA（正義鏈：5′-CGACUAAGUGCCAGACUCAU-3′；反義鏈：5′-AAUGAUCUGGGCACUUAGUCG-3′），收取細胞后進行免疫熒光標記染色。

1.8" 數據統計分析

所有試驗均重復3次及以上，用GraphPad Prism軟件進行作圖和統計分析，用Student’s t檢驗進行統計學分析，數據用平均值±標準差表示；ns表示無顯著差異（P≥0.05）；*表示在0.05水平差異顯著（Plt;0.05），**表示在0.01水平差異顯著（Plt;0.01），***表示在0.001水平差異顯著（Plt;0.001）。

2" 結果與分析

2.1" PEDV感染導致宿主細胞G1-S阻滯的結果

為了研究PEDV對宿主細胞周期的影響，用PEDV分別感染ST、IPEC-J2細胞。流式結果顯示，與對照細胞相比，PEDV感染7 h后，處于S期的ST、IPEC-J2細胞占比升高，處于合成后期（G2）-M期的ST、IPEC-J2細胞占比下降；PEDV感染31 h后，處于G1、S期的ST、IPEC-J2細胞占比升高，處于G2-M期的ST、IPEC-J2細胞占比下降（圖1）。Western blotting結果顯示，PEDV感染7 h后，ST、IPEC-J2細胞中的Cyclin A得到高表達，提示細胞被阻滯于S期，此時可以檢出PEDV N蛋白，但是需要長曝光才能檢出；PEDV感染31 h后，N蛋白的檢出量增加。此外，被PEDV感染后，Cyclin B的檢出量降低，提示處于G2-M轉換期的細胞減少（圖1）。綜合流式細胞術、WB結果得出，PEDV感染會使ST、IPEC-J2細胞發生G1-S轉換阻滯。

2.2" ST、IPEC-J2細胞同步化至細胞周期各時期的結果

分別使用雙Thy釋放結合Noc抑制的方式，將ST、IPEC-J2細胞同步化于G1-S轉換期、S期和M期。流式細胞術驗證結果顯示，ST、IPEC-J2細胞被成功富集于相應細胞周期中（圖2）。

進一步用WB檢測G1-S轉換時期的標志物Cyclin E、S期的標志物Cyclin A和M期的標志物Cyclin B，證實ST、IPEC-J2被成功同步化于相應的細胞周期中（圖3）。

2.3" 最有利于PEDV復制的細胞周期具體時期分析

為了進一步研究宿主細胞所處細胞周期對PEDV病毒增殖的影響，分別將ST、IPEC-J2細胞同步化至G1-S轉換期、S期和M期，按照感染復數（MOI）=1的標準接入PEDV。22 h后鏡下觀察可見同步化于G1-S轉換期的ST細胞（圖4A）和IPEC-J2細胞（圖4B）中出現以大量合胞體為代表的細胞病變效應；同步化于S期、M期的ST、IPEC-J2細胞病變效應則較少，其中同步化于M期的細胞由于自身細胞周期特性，大量細胞呈圓形（圖4A、圖4B）。TCID50結果顯示，與非同步化的對照細胞相比，同步化于G1-S轉換期的ST細胞（圖4C）和IPEC-J2細胞（圖4D）的TCID50，無顯著差異；與同步化于G1-S轉換期的細胞相比，同步化于S期的ST、IPEC-J2細胞的TCID50顯著下調（圖4C、圖4D）；與同步化于G1-S轉換期的細胞相比，同步化于M期的ST細胞的TCID50顯著下調，同步化于M期的IPEC-J2細胞的TCID50高于同步化至S期的細胞，與同步化于G1-S轉換期的細胞相比則表現出極顯著下調。由此可見，位于G1期、G1-S轉化期的細胞最有利于PEDV的感染和增殖。

2.4" G1期ST、IPEC-J2細胞纖毛細胞器的觀察結果

G1期細胞的一大特性為有大量纖毛細胞器，且與PEDV同為冠狀病毒的新型冠狀病毒已被報道經由纖毛進入細胞，為了研究G1期細胞適合PEDV增殖的機制，本研究使用纖毛指示物乙酰化-α-微管蛋白（AcTub）標記ST、IPEC-J2細胞的纖毛（圖5）。隨后，為了研究纖毛細胞器是否參與PEDV增殖的調控，通過血清饑餓法誘導ST、IEPC-J2細胞進入靜止期（G0期，特殊的G1期，其間組裝大量纖毛），有40%～50%的ST、IPEC-J2細胞組裝纖毛（圖6A）。分別敲低ST細胞纖毛組裝關鍵基因IFT88的相對表達量或使用纖毛組裝小分子抑制劑Ciliobrevin D處理ST細胞，處理后纖毛的組裝比例均下降，其中用Ciliobrevin D處理細胞后，纖毛的比例下降至10%左右，效果好于敲低纖毛組裝關鍵基因IFT88相對表達量的處理（圖6B）。

2.5" 誘導纖毛去組裝對宿主細胞對PEDV敏感性的影響

分別用5 μmol/L、15 μmol/L和50 μmol/L纖毛組裝小分子抑制劑Ciliobrevin D處理非同步化的ST細胞和經血清饑餓誘導于靜止期的ST細胞，用PEDV（MOI=1）感染24 h后，在光學顯微鏡下觀察CPE。結果顯示，與非同步化組相比，靜止期細胞的CPE更廣泛，與對照細胞相比，幾乎所有細胞發生了病變。用5 μmol/L、15 μmol/L Ciliobrevin D處理的ST細胞部分發生CPE，用50 μmol/L Ciliobrevin D處理的ST細胞的CPE較少，呈現隨著Ciliobrevin D處理濃度的升高CPE水平下降的趨勢（圖7）。

繼續培養細胞，使PEDV完全感染細胞，當感染時間達到72 h時測定TCID50。結果顯示，靜止期對照ST細胞的TCID50極顯著高于非同步化細胞對照的ST細胞，靜止期ST細胞的TCID50普遍高于非同步化細胞組的ST細胞。靜止期細胞與非同步化細胞均呈現出隨著Ciliobrevin D處理濃度升高，TCID50下降的趨勢（圖7）。由此可見，誘導纖毛去組裝的ST細胞對PEDV的敏感性隨著纖毛比例的下降而降低。

分別使用5 μmol/L、15 μmol/L和50 μmol/L Ciliobrevin D（一種細胞質動力蛋白抑制劑）處理非同步化和處于靜止期的豬睪丸（ST）細胞，用PEDV感染細胞72 h，在鏡下觀察細胞病變（CPE）情況并計數，用Reed-Muench法測定病毒半數組織培養感染劑量（TCID50）并進行統計學分析。Asy：非同步化細胞（對照）；G0：靜止期細胞；DMSO：二甲基亞砜。ns表示差異不顯著（P≥0.05），*表示在0.05水平差異顯著（Plt;0.05）；**表示在0.01水平差異顯著（Plt;0.01），***表示在0.001水平差異顯著（Plt;0.001），G0表示靜止期，標尺代表50 μm。

3" 討論

細胞周期由一系列受到高度調控的事件組成，包括細胞成分的嚴格復制和單細胞分離成2個子細胞。細胞周期控制的基本機制無論是在酵母還是人類中都保守，主要分為G1期、S期、G2期和M期。在本研究中，非同步化細胞大部分處于G1期，因此與同步化于G1-S轉換期的細胞感染PEDV后的TCID50差異不顯著。動物機體內的大多數細胞都是非循環細胞并且含有非常低水平的核苷酸、復制因子，因此限制了病毒復制，調控細胞周期因而成為許多病毒為了創造適合生存的環境而采取的策略。盡管該調控對病毒生命周期有益，但是病毒介導的細胞周期的改變可能對細胞生理產生有害影響，并可能最終導致與病毒感染相關的病理現象，包括細胞轉化和癌癥發生等。

纖毛組裝、去組裝過程與細胞周期緊密關聯，正常增殖的細胞中約有10%～25%可以觀測到纖毛，當通過血清饑餓誘導的細胞進入靜止期時，組裝纖毛的細胞比例大幅提高，成體體內各種組織中的細胞即接近或類似于這一狀態。纖毛長度由纖毛組裝、去組裝的平衡調控。PEDV是單股正鏈RNA病毒。PEDV基因組長度約為28 kb，包含5′帽子、3′多腺苷酸化尾巴、5′非翻譯區域（UTR）和3′UTR及至少7個開放閱讀框。ORF1a、ORF1b編碼病毒復制酶，其余ORF編碼結構蛋白，包括刺突蛋白（S）、包膜蛋白（E）、膜蛋白（M）和核衣殼蛋白（N）。PEDV E蛋白、M蛋白、N蛋白均被報道能夠引起宿主細胞的周期阻滯。目前，豬流行性腹瀉已成為制約中國養豬行業發展的重要傳染病之一。

本研究選取PEDV天然宿主細胞IPEC-J2和可用于疫苗生產的ST細胞作為試驗對象，2種細胞均為豬來源細胞，且能增殖PEDV。通過Thy釋放、Noc阻滯等方法分別將ST、IPEC-J2細胞同步化至G1-S轉換期、S期和M期，并通過細胞周期標志蛋白進行鑒定，確認同步化效果。隨后進一步深入探究同步化后的ST、IPEC-J2細胞對PEDV感染的反應，結果顯示，同步化于G1-S轉換期的細胞的TCID50最高。目前已有對PEDV N蛋白造成的細胞周期阻滯和由Thy誘導的非洲綠猴腎（Vero）細胞周期阻滯差異的研究，但Vero細胞具有干擾素分泌缺陷的特點。本研究對ST、IPEC-J2的細胞周期進行同步化，明確PEDV感染和宿主細胞周期之間的相互調控關系，并發現纖毛細胞器的去組裝有助于宿主細胞抗PEDV反應和能力的提升，對于進一步研制PEDV新型疫苗和改進相關病毒生產工藝具有重要意義。

4" 結論

PEDV感染會導致ST、IPEC-J2細胞阻滯于G1-S轉換時期。本研究使用雙Thy釋放結合Noc抑制方法，分別成功將ST、IPEC-J2細胞阻滯于G1-S轉換期、S期和M期，并通過比較同步化于不同時期的ST、IPEC-J2細胞感染PEDV后的TCID50，證實G1-S轉換期的細胞最適于PEDV的增殖，并證明細胞去組裝纖毛后增殖PEDV的能力下降。

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（責任編輯：徐" 艷）