大蒜內(nèi)生貝萊斯芽孢桿菌促進(jìn)蒜氨酸積累

摘要：" 內(nèi)生菌與植物之間存在著互利共生關(guān)系，它可以促進(jìn)宿主植物中活性物質(zhì)的積累。為探究大蒜內(nèi)生菌能否促進(jìn)大蒜活性物質(zhì)蒜氨酸的積累，以貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）KLBMP108和蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）KLBMP81為供試菌株，測(cè)定其對(duì)3個(gè)不同地區(qū)不同品種大蒜葉片中蒜氨酸含量的影響。結(jié)果表明，與對(duì)照相比，處理后第6 d， 菌株KLBMP108能使其宿主改良大蒜的蒜氨酸含量提高至1.68 mg/mL，蒜氨酸裂解酶表達(dá)量顯著提高；而對(duì)非宿主品種河南紫蒜以及云南苔蒜的蒜氨酸含量沒(méi)有顯著影響。分離自紅豆杉的菌株KLBMP81處理的3種大蒜蒜氨酸含量均較低。本研究證實(shí)菌株KLBMP108能夠提高其宿主改良大蒜葉片中蒜氨酸含量，是大蒜品種改良的寶貴微生物資源。

關(guān)鍵詞：" 大蒜；大蒜素；蒜氨酸；蒜氨酸裂解酶；內(nèi)生菌；貝萊斯芽孢桿菌

中圖分類(lèi)號(hào)：" S633.4;S182""" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：" A""" 文章編號(hào)：" 1000-4440（2024）12-2283-09

收稿日期：2023-12-06

基金項(xiàng)目：徐州市科技計(jì)劃項(xiàng)目基礎(chǔ)研究計(jì)劃青年科技人才項(xiàng)目（KC22022）；國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31801720）

作者簡(jiǎn)介：田孟凡（2000-），女，四川會(huì)理人，碩士研究生，主要從事內(nèi)生菌與植物互作研究。（E-mail）Tianmengfan0526@163.com

通訊作者：王軍娟，（E-mail）wjj1139@jsnu.edu.cn

田孟凡，戴威威，周佳慧，等. 大蒜內(nèi)生貝萊斯芽孢桿菌促進(jìn)蒜氨酸積累［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2024，40（12）：2283-2291.

doi：10.3969/j.issn.1000-4440.2024.12.011

Promotion of alliin accumulation by endogenous Bacillus velezensis in garlic

TIAN Mengfan1，2，" DAI Weiwei1，2，" ZHOU Jiahui1，" XUE Yan1，" FENG Zhaozhong1，" WANG Junjuan1，2

（1.School of Life Sciences， Jiangsu Normal University， Xuzhou 221000， China;2.State Key Laboratory of Medicinal Plant Biotechnology， Jiangsu Normal University， Xuzhou 221000， China）

Abstract：" A mutually beneficial symbiotic relationship happens between endophytic bacteria and plants， which can promote the accumulation of active substances in the host plant. To investigate whether endophytic bacteria of garlic promote the accumulation of alliin， an active substance in garlic， Bacillus velezensis KLBMP108 and Bacillus cereus KLBMP81 were used as the test strains to determine their effects on the alliin content in leaves of three different varieties of garlic in different regions. The results showed that compared with the control， on the 6th day after treatment， the strain KLBMP108 could increase the alliin content of the improved garlic to 1.68 mg/mL， and the expression of alliinase was significantly increased. However， there was no significant effect on the alliin content of non-host varieties Henan purple garlic and Yunnan moss garlic. The alliin content of three kinds of garlic treated by strain KLBMP81 isolated from Taxus chinensis was low. In conclusion， strain KLBMP108 can increase the alliin content in its host Gailiang garlic leaves， and is a valuable microbial resource for garlic variety improvement.

Key words：" garlic;allicin；alliin;alliinase;endophytic bacteria;Bacillus velezensis

大蒜（Allium sativum L.）是僅次于洋蔥的第二大廣泛種植的蔬菜，中國(guó)是全球大蒜產(chǎn)量以及出口量最高的國(guó)家。大蒜是中國(guó)傳統(tǒng)中藥，具有抑菌消炎、強(qiáng)力殺菌、防癌抗癌、增強(qiáng)體質(zhì)等功效，除含有豐富的甾體苷類(lèi)、揮發(fā)性硫醚類(lèi)化合物以及氨基酸類(lèi)等物質(zhì)之外，還含特殊的活性物質(zhì)（有機(jī)含硫化合物），總稱(chēng)大蒜素。γ-谷氨酰胺-S-烯丙基-L-半胱氨酸作為這些特殊的含硫物質(zhì)的原始化合物，會(huì)被水解氧化生成蒜氨酸。當(dāng)大蒜組織受到破壞時(shí)，液泡內(nèi)的蒜氨酸裂解酶便會(huì)釋放出來(lái)，導(dǎo)致蒜氨酸被分解，進(jìn)而生成大蒜素。大蒜素性質(zhì)較不穩(wěn)定，容易被分解成各種揮發(fā)性含硫化合物，比如：S-反式-1-丙基-l-半胱氨酸亞砜（PECSO，異蒜素）等。這些揮發(fā)性含硫化合物是味覺(jué)前體，調(diào)控著大蒜生長(zhǎng)過(guò)程中鱗莖的味道和氣味。大蒜素是大蒜中的關(guān)鍵生物活性分子。相關(guān)研究結(jié)果表明，大蒜素具有抗細(xì)胞凋亡和抗氧化的潛能。大蒜素不穩(wěn)定，其前體物質(zhì)為蒜氨酸（分子式為C6H11NO3S，相對(duì)分子量為177.22，具有水溶性），因此蒜氨酸含量對(duì)大蒜的品質(zhì)有重要影響。

大蒜內(nèi)除了有多種活性物質(zhì)外，還具有豐富的內(nèi)生菌資源。韋智鐘等從大蒜中分離得到28株內(nèi)生菌，其中20株為內(nèi)生細(xì)菌。研究者對(duì)來(lái)自中國(guó)10個(gè)不同地區(qū)的大蒜鱗莖進(jìn)行處理，分離出了102株大蒜內(nèi)生菌，其中92株為內(nèi)生細(xì)菌。Wang等從生長(zhǎng)在中國(guó)不同地點(diǎn)的健康大蒜鱗莖中共分離出194株內(nèi)生菌，其中，暹羅芽孢桿菌（Bacillus siamensis）為優(yōu)勢(shì)菌。這些研究結(jié)果表明大蒜內(nèi)生菌多為細(xì)菌，而芽孢桿菌屬占絕大部分。已有研究結(jié)果表明植物內(nèi)生細(xì)菌可以促進(jìn)植物中次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成，甚至它們自身也能產(chǎn)生與其宿主植物相同或相近的活性物質(zhì)，比如從人參（Panax ginseng C.A.Meyer）根中分離的高地芽孢桿菌（Bacillus altitudinis）KX230132.1可以作為一種有效的激發(fā)劑，促進(jìn)人參中人參皂苷的合成和積累，與對(duì)照相比，人參皂苷含量增加了4倍。此外，內(nèi)生細(xì)菌還可以直接參與人參中活性成分的生物轉(zhuǎn)化，比如從人參中分離出1株內(nèi)生菌GE17-7，它能夠?qū)⑷藚⒃碥誖b1經(jīng)人參皂苷Rd轉(zhuǎn)化為人參植株內(nèi)含量較低的Rg3，這對(duì)于開(kāi)發(fā)抗腫瘤化合物人參皂苷Rg3具有重要意義。Cao等從紅豆杉（Taxus yunnanensis）中分離出1株假雙孢菌（Pseudodidymocyrtis lobariellae）KL27，并發(fā)現(xiàn)P. lobariellae可以誘導(dǎo)參與紫杉醇生物合成相關(guān)的多個(gè)關(guān)鍵基因的表達(dá)，進(jìn)而提高紅豆杉針葉中紫杉醇的積累，與對(duì)照相比，紫杉醇含量增加了3.26倍。李艷冰等從滇重樓（Paris polyphylla var.yunnanensis）中分離到23株內(nèi)生菌，通過(guò)篩選發(fā)現(xiàn)，人參生柱隔孢（Cylindrocarpon sp.）和木霉菌（Trichoderma viride）能夠促進(jìn)滇重樓組培苗中皂苷含量的積累，與對(duì)照相比，皂苷含量分別提高了79.9%和75.7%。但是目前關(guān)于內(nèi)生菌與大蒜之間的相互作用的研究較少。

實(shí)驗(yàn)室前期在對(duì)大蒜內(nèi)生菌拮抗大蒜白腐病及其促進(jìn)大蒜生長(zhǎng)的研究中，發(fā)現(xiàn)1株不僅具有潛在的抗真菌活性，還能使大蒜產(chǎn)生濃郁辛辣味的菌株，經(jīng)鑒定為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis），編號(hào)KLBMP108。本研究擬以此為著手點(diǎn)，選用課題組前期從紅豆杉中分離出的蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus），編號(hào)KLBMP81，設(shè)置LB培養(yǎng)液（對(duì)照）、菌株KLBMP108發(fā)酵液、菌株KLBMP81發(fā)酵液3個(gè)處理，通過(guò)對(duì)改良大蒜、河南紫蒜、云南苔蒜3個(gè)不同地區(qū)、不同品種的大蒜莖基部處理后，采集處理后第6 d（萌芽期）、第20 d（幼苗期）、第30 d（鱗莖膨大期）的大蒜葉片，初步探究菌株KLBMP108和菌株KLBMP81對(duì)不同地區(qū)、不同品種大蒜蒜氨酸含量的影響，以期為未來(lái)揭示內(nèi)生菌促進(jìn)宿主活性成分的積累提供一定理論基礎(chǔ)。

1" 材料與方法

1.1" 試驗(yàn)材料

1.1.1" 植物材料" 改良大蒜由西北農(nóng)林科技大學(xué)程智慧教授提供。河南紫蒜和云南苔蒜分別采集于中國(guó)河南開(kāi)封和云南大理的大蒜種植基地。

1.1.2" 供試菌株" 貝萊斯芽孢桿菌B.velezensis KLBMP108和蠟狀芽孢桿菌B.cereus KLBMP81由江蘇師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存和提供。

1.2" 內(nèi)生菌KLBMP108的形態(tài)學(xué)觀(guān)察

挑取菌株KLBMP108于LB培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫過(guò)夜培養(yǎng)24 h，隨后觀(guān)察菌株KLBMP108的菌落形態(tài)、顏色等特征；挑取單菌落置于LB培養(yǎng)液中，使用搖床37 ℃、180 r/min培養(yǎng)36 h，培養(yǎng)好的菌液于離心機(jī)中5 000 r/min離心10 min，將收集的菌體用0.1 mol/L pH 7.2磷酸緩沖液反復(fù)漂洗3次，確保漂洗干凈。漂洗后的菌體用2.5%的戊二醛在4 ℃冰箱中避光放置12 h，然后收集菌體，再用0.1 mol/L pH 7.2磷酸緩沖液連續(xù)漂洗3次，漂洗后的沉淀物用體積分?jǐn)?shù)為25%、50%、75%、95%的乙醇逐級(jí)洗脫，每梯度洗脫時(shí)間為10 min，將洗脫后得到的沉淀凍干24 h以上，凍干完成后，采用離子濺射儀對(duì)制備好的樣品進(jìn)行真空鍍金，最后使用掃描電子顯微鏡（SEM）觀(guān)察菌株KLBMP108的表面形態(tài)。

1.3" 內(nèi)生菌KLBMP108 16S rDNA的序列比對(duì)分析

采用TIANamp細(xì)菌DNA試劑盒，對(duì)內(nèi)生菌KLBMP108基因組DNA進(jìn)行提取。然后使用細(xì)菌通用引物以及Taq酶進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增。反應(yīng)條件為95 ℃ 3 min；隨后95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s進(jìn)行35次循環(huán)；最終72 ℃ 7 min。使用Sanger測(cè)序?qū)σ?7F和1492R擴(kuò)增出的產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，最后對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列比對(duì)分析。

1.4" 內(nèi)生菌KLBMP108系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

采用MEGA11軟件中的最大似然法構(gòu)建內(nèi)生菌KLBMP108系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。通過(guò)總結(jié)、歸納、分析目的菌株和已知菌株之間的進(jìn)化關(guān)系，確定所測(cè)菌株的種屬。

1.5" 內(nèi)生菌的處理及植物樣品采集

1.5.1" 大蒜的種植" 大蒜鱗莖表面消毒方法：首先用自來(lái)水沖洗，待沖洗干凈后，將大蒜鱗莖浸泡于70%乙醇中，持續(xù)1 min，以去除表面雜質(zhì)。然后，轉(zhuǎn)入0.3%次氯酸鈉溶液持續(xù)浸泡20 min，以實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步的滅菌效果。隨后，將大蒜鱗莖從上述溶液中取出，用無(wú)菌水沖洗20 min，徹底去除殘留消毒劑，然后用無(wú)菌濾紙吸干表面水分，此步驟重復(fù)3遍。隨后，將大蒜鱗莖種植在裝滿(mǎn)消毒泥炭的花盆（22 cm×15 cm×15 cm）中。花盆定期澆水，并在22～25 ℃的溫室條件下培養(yǎng)，光照16 h/黑暗8 h循環(huán)。

1.5.2" 內(nèi)生菌的處理" 將內(nèi)生菌KLBMP108和KLBMP81于LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)16 h獲得發(fā)酵液，然后將發(fā)酵液調(diào)整為1.0 mL 1×108個(gè)細(xì)胞的處理液，對(duì)照用等量LB培養(yǎng)液接種。分別將0.5 mL的LB培養(yǎng)液、菌株KLBMP108和KLBMP81發(fā)酵液滴在大蒜幼苗的莖基部周?chē)脽o(wú)菌土覆蓋，在25 ℃條件下黑暗保存24 h，然后光照16 h/黑暗8 h循環(huán)，持續(xù)處理3 d。

1.5.3" 樣品的采集" 于處理后第6 d（萌芽期）、第20 d（幼苗期）、第30 d（鱗莖膨大期）隨機(jī)采集大蒜葉片，保存于超低溫冰箱中備用。

1.6" 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)大蒜葉片蒜氨酸裂解酶的表達(dá)水平

按照試劑盒所附說(shuō)明書(shū)，運(yùn)用Plant RNA試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司產(chǎn)品）從大蒜葉片組織中提取總RNA。隨后，使用定量PCR專(zhuān)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將已提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA備用。以大蒜的蒜氨酸裂解酶基因（Alliinase）為目的基因，以大蒜α-微管蛋白基因（TUA）作為內(nèi)參基因。采用Primer Premier 5設(shè)計(jì)相關(guān)引物，然后由生工生物工程（上海）股份有限公司合成相應(yīng)引物（表1）。關(guān)于實(shí)時(shí)熒光定量PCR，按照RT-PCR試劑盒（北京聚合美生物科技有限公司產(chǎn)品）配置反應(yīng)體系如下：5.0 μL的2×M5 HiPer Realtime PCR Super mix（SYBR green， with antiTaq），0.2 μL上游引物（F）以及0.2 μL下游引物（R），1.0 μL cDNA模板和4.5 μL無(wú)菌水。數(shù)據(jù)從3個(gè)獨(dú)立的生物重復(fù)中收集，并評(píng)估無(wú)任何模板的陰性對(duì)照，以確保沒(méi)有污染。反應(yīng)條件包括95 ℃加熱3 min；然后95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s， 40次循環(huán)，在72 ℃ 30 s處收集熒光，最后95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。

1.7" 高效液相色譜法測(cè)定大蒜葉片中的蒜氨酸含量

1.7.1" 樣品溶液的制備" 進(jìn)行試驗(yàn)前，用m1表示1.5 mL離心管的重量。將存于超低溫冰箱的樣品取出，用液氮研磨后，裝在對(duì)應(yīng)的離心管中，稱(chēng)取重量，用m2表示。研磨的大蒜葉片重量為m=m2-m1。往離心管中注入樣品體積2 000倍的無(wú)菌蒸餾水，振蕩后，于常溫放置至少30 min。然后離心，用注射器吸取500 μL上清液，通過(guò)0.22 μm水相膜過(guò)濾到新的離心管中，封口后保存于-20 ℃冰箱中。

1.7.2" 檢測(cè)方法：高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）" 樣品采用Angilent1200高效色譜儀（Angilent，美國(guó)）串聯(lián)TripleTOF4600質(zhì)譜（AB SCIEX，美國(guó)）進(jìn)行分離，色譜柱為Phenomenex C18 100 mm×2 mm，色譜條件分別為：柱溫25 ℃，流速0.4 mL/min，進(jìn)樣量20 μL。流動(dòng)相組成，A：水，B：乙腈。洗脫程序如下：0 min，100%A，0 B；20 min，30%A，70%B；30 min，30%A，70%B；40 min，100%A，0B。

1.7.3" 蒜氨酸含量計(jì)算" 以蒜氨酸標(biāo)準(zhǔn)品的不同濃度為X軸，吸收峰的峰面積為Y軸，畫(huà)出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到兩者間的線(xiàn)性關(guān)系。在此基礎(chǔ)上，按上述方法制備樣品溶液進(jìn)行高效液相色譜分析，測(cè)出其對(duì)應(yīng)的吸收峰面積，將其代入到線(xiàn)性回歸公式中，進(jìn)而計(jì)算出對(duì)應(yīng)濃度。最后，根據(jù)大蒜水分含量，計(jì)算大蒜葉片中蒜氨酸的含量（mg/mL）。

1.8" 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2016以及GraphPad Prism 8.0繪制圖表。此外，數(shù)據(jù)采用SAS19.0軟件進(jìn)行分析，以單因素方差分析對(duì)組間差異進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。通過(guò)比較，標(biāo)注不同小寫(xiě)字母用以區(qū)分相同時(shí)間點(diǎn)不同菌株處理組間的顯著差異，其中P＜0.05即認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以此確保研究結(jié)果的嚴(yán)謹(jǐn)性與可靠性。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 內(nèi)生細(xì)菌KLBMP108的形態(tài)及分子鑒定

菌株KLBMP108具有典型的芽孢桿菌形態(tài)特征，其在LB培養(yǎng)基上為乳白色不透明菌落，表面有褶皺，邊緣較不規(guī)則（圖1A、圖1B）。通過(guò)掃描電子顯微鏡觀(guān)察，菌株KLBMP108的菌體呈桿狀（圖1C、圖1D）。

擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后測(cè)序，用BLAST程序進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果（表2）表明，菌株KLBMP108的16S rDNA序列長(zhǎng)度為1 404 bp，在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)中與其最相關(guān)菌株為Bacillus velezensis KKLW，該相關(guān)菌株在GenBank的序列登錄號(hào)為GP054714，菌株KLBMP108與該相關(guān)菌株相似度為99.93%；菌株KLBMP81的16S rDNA序列長(zhǎng)度為1 456 bp，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中與其最相關(guān)菌株為Bacillus cereus ATCC 21281，該相關(guān)菌株在GenBank的序列登錄號(hào)為FJ501984，兩者相似度為99.75%。

對(duì)菌株KLBMP108和KLBMP81的16S rDNA進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，結(jié)果（圖2）表明，菌株KLBMP108和KLBMP81均隸屬于芽孢桿菌屬，其中，菌株KLBMP108與貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）形成一個(gè)分支，進(jìn)化距離最近，反映出它們遺傳關(guān)系最接近；菌株KLBMP81與蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）同源性最接近。

2.2" 不同菌株處理后改良大蒜葉片中蒜氨酸含量變化

對(duì)改良大蒜幼苗的莖基部分別進(jìn)行菌株KLBMP108發(fā)酵液、菌株KLBMP81發(fā)酵液及LB培養(yǎng)液處理，并于處理后第6 d（萌芽期）、第20 d（幼苗期）、第30 d（鱗莖膨大期）采集大蒜葉片，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)樣品和改良大蒜葉片中的蒜氨酸含量，標(biāo)準(zhǔn)樣品和改良大蒜葉片中蒜氨酸的高效液相色譜圖如圖3所示，標(biāo)準(zhǔn)樣品峰型較好，出峰時(shí)間為7.5 min，改良大蒜葉片提取物也在該時(shí)間點(diǎn)下有相應(yīng)的吸收峰。

由圖4可知，在處理后第6 d，菌株KLBMP108處理的改良大蒜葉片中的蒜氨酸含量達(dá)到峰值，約為1.68 mg/mL，顯著高于對(duì)照與菌株KLBMP81處理（Plt;0.05）。處理后第30 d，菌株KLBMP108處理后改良大蒜葉片中的蒜氨酸含量約為0.61 mg/mL，但仍顯著高于對(duì)照和菌株KLBMP81處理后的改良大蒜蒜氨酸含量（圖4）。從處理后第6 d到處理后第30 d，菌株KLBMP81處理后改良大蒜蒜氨酸含量從0.38 mg/mL減少到0.05 mg/mL（圖4）。這些結(jié)果表明，菌株KLBMP108的處理，能促進(jìn)其宿主改良大蒜的蒜氨酸含量積累，而菌株KLBMP81處理的改良大蒜蒜氨酸含量較低。

2.3" 不同菌株處理后河南紫蒜和云南苔蒜葉片中蒜氨酸含量變化

因改良大蒜在菌株KLBMP108處理后其葉片中的蒜氨酸含量整體高于對(duì)照，而菌株KLBMP81處理后其蒜氨酸含量變化不顯著。在此基礎(chǔ)上，采集了來(lái)自2個(gè)地區(qū)的不同品種的大蒜，進(jìn)一步探究來(lái)自相同屬但分離自不同宿主植物的內(nèi)生菌是否會(huì)影響不同地區(qū)大蒜的蒜氨酸含量。圖5表明，在對(duì)河南紫蒜處理后第6 d，2個(gè)菌株處理后的河南紫蒜葉片中的蒜氨酸含量均顯著低于對(duì)照，均約為對(duì)照的1/2，但菌株KLBMP108和KLBMP81處理之間無(wú)顯著差異。而在處理后第30 d，菌株KLBMP108處理的河南紫蒜葉片中的蒜氨酸含量高于菌株KLBMP81處理組，達(dá)到1.55 mg/mL，但與對(duì)照無(wú)顯著差異。菌株KLBMP81處理后的河南紫蒜葉片中的蒜氨酸含量于處理后第20 d達(dá)到峰值，為2.10 mg/mL。以上結(jié)果表明，菌株KLBMP108和KLBMP81均不能提高非宿主植物河南紫蒜蒜氨酸的含量。

由圖6可知，在處理后第6 d和第20 d，菌株KLBMP108和KLBMP81處理后的云南苔蒜葉片中蒜氨酸含量與對(duì)照相比無(wú)顯著變化（圖6）。但處理后第30 d，菌株KLBMP108處理后云南苔蒜葉片中蒜氨酸含量為0.64 mg/mL；而菌株KLBMP81處理后的云南苔蒜葉片中的蒜氨酸含量降低到0.28 mg/mL，約為對(duì)照1.13 mg/mL的1/4，與對(duì)照具有顯著差異（圖6）。這些結(jié)果表明，內(nèi)生菌KLBMP108對(duì)宿主植物改良大蒜和非宿主植物河南紫蒜和云南苔蒜的效果不同，這可能依賴(lài)于宿主植物和內(nèi)生菌的關(guān)系。

2.4" 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)改良大蒜葉片中蒜氨酸裂解酶的表達(dá)水平

為進(jìn)一步探究菌株KLBMP108處理后改良大蒜中蒜氨酸裂解酶的表達(dá)情況，本研究運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)改良大蒜葉片中蒜氨酸裂解酶的表達(dá)水平。結(jié)果（圖7）表明，菌株KLBMP108處理后的第6 d，改良大蒜葉片中的蒜氨酸裂解酶的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照和菌株KLBMP81處理，約為對(duì)照的36倍，為菌株KLBMP81處理的4.8倍。菌株KLBMP108處理后第20 d，改良大蒜葉片的蒜氨酸裂解酶表達(dá)量高于對(duì)照，但低于KLBMP81處理。最終，菌株KLBMP108處理第30 d后改良大蒜葉片的蒜氨酸裂解酶表達(dá)量高于對(duì)照和菌株KLBMP81處理。在一定程度上，菌株KLBMP108處理后改良大蒜中蒜氨酸裂解酶表達(dá)量的變化趨勢(shì)與其蒜氨酸含量變化趨勢(shì)類(lèi)似。

3" 討論

大蒜素作為大蒜中具有獨(dú)特辛辣氣味的物質(zhì)，是國(guó)際上公認(rèn)的大蒜活性物質(zhì)。蒜氨酸作為大蒜素的前體物質(zhì)，當(dāng)大蒜組織受到破壞時(shí)，蒜氨酸便在蒜氨酸裂解酶的作用下被分解生成大蒜素。大蒜素性質(zhì)極不穩(wěn)定，容易分解。而蒜氨酸作為它的前體物質(zhì)，性質(zhì)較為穩(wěn)定，因此多采用穩(wěn)定的蒜氨酸含量作為大蒜中的成分指標(biāo)進(jìn)行大蒜質(zhì)量的監(jiān)控。此外，蒜氨酸作為新鮮大蒜中含量最多的非蛋白質(zhì)含硫氨基酸，安全無(wú)毒性、無(wú)刺激性氣味，占大蒜含硫化合物的90%以上。蒜氨酸不僅具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活性，還具有增強(qiáng)免疫力等保健功能，在醫(yī)藥研制方面具有較大的應(yīng)用前景。

相關(guān)研究結(jié)果表明，大蒜素在葉片中合成，為防止它們?cè)馐芪⑸锖褪巢輨?dòng)物的攻擊，會(huì)將其轉(zhuǎn)移到鱗莖以及芽中。在本研究中，菌株KLBMP108處理改良大蒜的第6 d（萌芽期），其葉片中蒜氨酸含量達(dá)到峰值，隨著處理天數(shù)的增加，其葉片中的蒜氨酸含量逐漸下降，處理后第30 d（鱗莖膨大期）蒜氨酸含量最低。這可能是由于萌芽期大蒜素在大蒜葉片中合成，待大蒜生長(zhǎng)至鱗莖膨大期，葉片中的大蒜素被運(yùn)輸至其鱗莖而造成的。

內(nèi)生菌與宿主植物之間存在著一種互利共生關(guān)系。當(dāng)宿主植物為內(nèi)生菌提供養(yǎng)分的同時(shí)，內(nèi)生菌不僅能夠調(diào)節(jié)宿主植物的激素水平以及次生代謝物的合成，甚至這些內(nèi)生菌本身也可以產(chǎn)生與其宿主植物相同或相近的生物活性物質(zhì)，進(jìn)而調(diào)控宿主植物生長(zhǎng)以及協(xié)助宿主植物對(duì)抗逆境。本研究中，菌株KLBMP108處理后，促進(jìn)其宿主改良大蒜葉片中蒜氨酸的積累；在qRT-PCR檢測(cè)改良大蒜葉片蒜氨酸裂解酶表達(dá)量中，我們發(fā)現(xiàn)菌株KLBMP108處理同樣提高了蒜氨酸裂解酶的表達(dá)水平。相關(guān)研究結(jié)果表明，對(duì)待不同的宿主植物，內(nèi)生菌會(huì)通過(guò)調(diào)整其特有的微生物菌群的豐度，使其更好地適應(yīng)宿主植物內(nèi)部的微環(huán)境，從而維持其自身的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。本研究結(jié)果表明，與對(duì)照相比，菌株KLBMP81處理后改良大蒜、河南紫蒜和云南苔蒜葉片中的蒜氨酸含量并沒(méi)有提高，這可能與菌株KLBMP81分離自紅豆杉，本研究中3個(gè)地區(qū)的大蒜并非是其原始宿主，從而其與3種大蒜之間并未形成共生關(guān)系，或者與菌株KLBMP81自身調(diào)整有關(guān)。同樣，菌株KLBMP108對(duì)河南紫蒜和云南苔蒜進(jìn)行處理后，與對(duì)照相比，蒜氨酸含量幾乎無(wú)顯著變化。這可能與菌株KLBMP108在處理河南紫蒜和云南苔蒜2種非宿主植物時(shí)，菌株KLBMP108自身調(diào)整有關(guān)。以上結(jié)果表明，雖然菌株KLBMP81與KLBMP108同屬芽孢桿菌屬，但不同宿主來(lái)源的內(nèi)生菌其調(diào)控植物次級(jí)代謝產(chǎn)物的能力是有差異的。

貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）是植物相關(guān)芽孢桿菌的模式物種，因其可以產(chǎn)生種類(lèi)豐富的具有特異性和互補(bǔ)性生物活性次級(jí)代謝物，在防治植物病害、促進(jìn)作物生長(zhǎng)發(fā)育中有較好的應(yīng)用前景。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)貝萊斯芽孢桿菌的研究越來(lái)越多，主要針對(duì)其促進(jìn)植物生長(zhǎng)、拮抗病原菌、抑菌機(jī)理等方面，關(guān)于其促進(jìn)植物活性物質(zhì)的積累也有報(bào)道，比如Bacillus velezensis JB0319的接種顯著增加了生菜（Lactuca sativa L.）中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸（Pro）的積累。本研究中的菌株KLBMP108是1株貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis），我們發(fā)現(xiàn)該菌株能夠促進(jìn)其宿主改良大蒜葉片中蒜氨酸的積累。這說(shuō)明貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）在促進(jìn)植物活性物質(zhì)積累方面具有較好的應(yīng)用前景。

4" 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，分離自紅豆杉的菌株KLBMP81處理后的改良大蒜蒜氨酸含量較低，而分離自改良大蒜的菌株KLBMP108處理后改良大蒜葉片中的蒜氨酸含量較對(duì)照總體顯著升高，同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)改良大蒜葉片中蒜氨酸裂解酶的表達(dá)水平也與其蒜氨酸含量變化趨勢(shì)類(lèi)似，以上結(jié)果表明，菌株KLBMP108能夠促進(jìn)其宿主改良大蒜葉片中的蒜氨酸的積累。綜上，KLBMP108菌株作為既能拮抗大蒜白腐病病原菌，還能提高改良大蒜葉片中蒜氨酸含量的多功能菌株，是大蒜品種改良的寶貴微生物資源。

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（責(zé)任編輯：陳海霞）