大蒜全基因組ABCB基因鑒定及表達(dá)分析

摘要：" 為探究生長素轉(zhuǎn)運蛋白ABCB基因（AsaABCB）在大蒜體細(xì)胞胚發(fā)生過程中的作用機(jī)理，以徐蒜6號為試驗材料，采取生物信息學(xué)方法，對大蒜AsaABCB基因家族成員進(jìn)行全基因組鑒定，并利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)進(jìn)行胚發(fā)育過程中AsaABCB家族基因表達(dá)模式分析。結(jié)果表明，大蒜中共存在17個AsaABCB基因，定位在7條染色體上，在系統(tǒng)進(jìn)化樹上可分為5個亞組。AsaABCB基因編碼的氨基酸數(shù)量為545～1 379個，相對分子量為59 627.17～152 864.21，理論等電點為5.72～9.34。AsaABCB4、AsaABCB6、AsaABCB15蛋白定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中，其余AsaABCB蛋白僅定位于細(xì)胞膜。17個AsaABCB基因的啟動子區(qū)存在196個光反應(yīng)元件、48個茉莉酸反應(yīng)調(diào)控元件、26個脫落酸反應(yīng)元件及12個生長素響應(yīng)元件。11個AsaABCB家族基因在大蒜胚性愈傷組織（EC）階段相對表達(dá)量較高，5個AsaABCB家族基因在愈傷組織（CA）階段表達(dá)量較高，這表明該家族基因可能主要調(diào)控大蒜體細(xì)胞胚發(fā)育過程中EC和CA的形成與發(fā)育。本研究結(jié)果為深入探索大蒜體細(xì)胞胚發(fā)育過程中AsaABCB基因的功能奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：" 大蒜；ABCB基因家族；體細(xì)胞胚

中圖分類號：" Q786；S633.4""" 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：" A""" 文章編號：" 1000-4440（2024）12-2207-12

收稿日期：2024-03-07

基金項目：徐州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院科研基金項目（XM2023009）；徐州市政策引導(dǎo)類計劃（產(chǎn)學(xué)研合作）項目（KC22452）；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目（CARS-24-A-07）

作者簡介：李夢倩（1996-），女，河南鶴壁人，碩士，研究實習(xí)員，主要從事大蒜育種研究。（E-mail）limengqian1014@163.com

通訊作者：楊" 峰，（E-mail）xz-yangfeng@163.com

李夢倩，樊繼德，葛" 潔，等. 大蒜全基因組ABCB基因鑒定及表達(dá)分析［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2024，40（12）：2207-2218.

doi：10.3969/j.issn.1000-4440.2024.12.003

Genome-wide identification and expression analysis of ABCB genes in garlic（Allium sativum L.）

LI Mengqian，" FAN Jide，" GE Jie，" YANG Qingqing，" LU Xinjuan，" ZHAO Yongqiang，" LIU Canyu，" ZHANG Biwei，" LIU Guangyang，" YANG Yan，" YANG Feng

（Xuzhou Institute of Agricultural Sciences of the Xuhuai District of Jiangsu Province， Xuzhou 221121， China）

Abstract：" In order to explore the mechanism of auxin transporter ABCB gene （AsaABCB） in the process of somatic embryogenesis of garlic， the whole genome of garlic AsaABCB gene family members was identified by bioinformatics method. The expression pattern of AsaABCB family genes during embryo development was analyzed by real-time fluorescence quantitative PCR （qRT-PCR） using Xusuan 6 as experimental material. The results showed that there were 17 AsaABCB genes in garlic， which were located on seven chromosomes and could be divided into five subgroups. The number of amino acids encoded by AsaABCB gene was 545-1 379， the relative molecular weight was 59 627.17-152 864.21， and the theoretical isoelectric point was 5.72-9.34. AsaABCB4， AsaABCB6 and AsaABCB15 proteins were localized in the cell membrane and cytoplasm， and the remaining AsaABCB proteins were only localized in the cell membrane. There were 196 light response elements， 48 jasmonic acid response elements， 26 abscisic acid response elements and 12 auxin response elements in the promoter region of 17 AsaABCB genes. The relative expression levels of 11 AsaABCB family genes were higher in the embryogenic callus （EC） stage of garlic， and the expression levels of five AsaABCB family genes were higher in the callus （CA） stage， indicating that the family genes may mainly regulate the formation and development of EC and CA during the development of garlic somatic embryos. The results of this study lay a foundation for further exploring the function of AsaABCB genes during garlic somatic embryo development.

Key words：" garlic;ABCB gene family;somatic embryo

大蒜（Allium sativum L.）是一種百合科蔥屬多年生草本植物，營養(yǎng)成分豐富，是藥食兼用蔬菜，具有重要的經(jīng)濟(jì)和藥用價值。大蒜花形態(tài)建成對溫度較為敏感，高溫環(huán)境下，大蒜配子體發(fā)育異常，受精過程受阻，常導(dǎo)致大蒜花粉不育，因此在生產(chǎn)上通常利用無性繁殖的方式進(jìn)行種植。但無性繁殖方式不僅影響大蒜的產(chǎn)量和品質(zhì)，制約大蒜新品種選育，還降低了中國大蒜產(chǎn)品在國際市場上的競爭優(yōu)勢。體細(xì)胞胚具有遺傳穩(wěn)定性好、繁殖系數(shù)高和再生個體整齊等優(yōu)點，被認(rèn)為是育種過程中的重要試驗材料，也是良好的遺傳轉(zhuǎn)化受體。目前關(guān)于大蒜體細(xì)胞胚發(fā)育與調(diào)控的分子機(jī)理研究較少，導(dǎo)致體細(xì)胞胚的優(yōu)勢不能充分發(fā)揮作用。大蒜基因組測序工作的完成，使研究大蒜體細(xì)胞胚發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)理成為可能。

生長素是誘導(dǎo)體細(xì)胞胚發(fā)生的重要因子，而生長素轉(zhuǎn)運蛋白在介導(dǎo)生長素進(jìn)入組織或細(xì)胞的過程中起重要作用。在外源生長素的作用下，生長素轉(zhuǎn)運蛋白通過調(diào)節(jié)植物組織或細(xì)胞中內(nèi)源生長素的分布，從而調(diào)控體細(xì)胞胚的發(fā)生。Mrquez-Lpez等 研究發(fā)現(xiàn)體細(xì)胞胚的形成不僅與生長素的積累量有關(guān)，還與生長素在外植體中的分布相關(guān)。Su等發(fā)現(xiàn)細(xì)葉百合體細(xì)胞胚誘導(dǎo)過程中，邊緣細(xì)胞會隨著環(huán)境中生長素的減少從而積累自身生長素含量。目前，擬南芥（Arabidopsis thaliana L.）、水稻（Oryza sativa L.）、葡萄（Vitis vinifera L.）、玉米（Zea mays L.）、高粱（Sorghum bicolor L.）、大豆Glycine max （L.） Merr.〗等植物中生長素轉(zhuǎn)運的調(diào)控機(jī)理得到了研究。生長素轉(zhuǎn)運主要以主動運輸形式進(jìn)行，運輸過程中除需要ATP（Adenosine triphosphate）外，還需要特殊的轉(zhuǎn)運載體，如生長素內(nèi)流載體蛋白（AUX1/LAX）、輸出載體蛋白（PIN）和ABCB蛋白。

ABCB蛋白隸屬ATP結(jié)合盒蛋白（ABC）家族的B亞家族，其成員多為膜結(jié)合蛋白，在激素、糖類和次生代謝物的跨膜運輸中扮演著重要的角色。ABC蛋白的保守結(jié)構(gòu)域為核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域（Nucleotide-binding domain，NBD）（PF00005），由Walker A序列、Walker B序列、ABC特征基序、H環(huán)和Q環(huán)等5個保守基序組成。除NBD外，ABC轉(zhuǎn)運蛋白還包含跨膜結(jié)構(gòu)域（Transmembrane domain，TMD）（PF00664）。ABC家族蛋白在植物中主要有全分子轉(zhuǎn)運蛋白、半分子轉(zhuǎn)運蛋白和可溶性蛋白3種存在形式。一般情況下，全分子轉(zhuǎn)運蛋白包含2個NBD和2個TMD，半分子轉(zhuǎn)運蛋白包含1個NBD和1個TMD，可溶性蛋白僅包含1個NBD，而ABCB亞家族蛋白中不包含可溶性蛋白。一些ABCB亞家族成員已被證實參與生長素的轉(zhuǎn)運。Jenness等研究結(jié)果顯示，擬南芥AtABCB21基因能夠調(diào)控子葉、根韌皮部和葉片中的生長素水平，促進(jìn)生長素向頂輸送。

目前，擬南芥、水稻、大白菜、山核桃、毛竹等作物ABCB基因家族的全基因組分析已經(jīng)完成，而大蒜AsaABCB基因家族的鑒定和表達(dá)分析還比較缺乏。本研究利用大蒜基因組測序數(shù)據(jù)，對大蒜AsaABCB基因家族進(jìn)行鑒定，明確大蒜AsaABCB基因的結(jié)構(gòu)、染色體定位、啟動子元件及基因編碼的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、跨膜區(qū)域、進(jìn)化樹及亞細(xì)胞定位，并對體細(xì)胞胚發(fā)育過程中AsaABCB基因的表達(dá)特征進(jìn)行分析，旨在為深入研究大蒜體細(xì)胞胚發(fā)生過程中AsaABCB基因的作用以及體細(xì)胞胚的培育和調(diào)控提供基礎(chǔ)。

1" 材料與方法

1.1" 植物材料與處理

供試大蒜品種為徐蒜6號，保存于江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所。B5培養(yǎng)基、MS培養(yǎng)基和2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）購自北京索萊寶科技有限公司，呋喃甲氨基嘌呤（KT）購自上海麥克林生化科技股份有限公司。在B5培養(yǎng)基中添加2，4-D 和KT，得到2，4-D 含量為2 mg/L、KT含量為0.5 mg/L的B5培養(yǎng)基，再在上述培養(yǎng)基中添加瓊脂和蔗糖得到蔗糖含量為30 g/L、瓊脂含量為7 g/L的培養(yǎng)基，用于愈傷組織和胚性愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)。在MS培養(yǎng)基中添加2，4-D 和KT，得到2，4-D 含量為1 mg/L、KT含量為0.5 mg/L的MS培養(yǎng)基，再在上述培養(yǎng)基中添加瓊脂和蔗糖得到蔗糖含量為30 g/L、瓊脂含量為7 g/L的培養(yǎng)基，用于體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)培養(yǎng)。

以大蒜鱗莖盤為外植體（EX），利用添加2，4-D和KT的B5培養(yǎng)基在25 ℃的培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)60 d，在培養(yǎng)10 d和60 d時取樣得到愈傷組織（CA）和胚性愈傷組織（EC）。然后轉(zhuǎn)入添加2，4-D和KT的MS培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)60 d，得到體細(xì)胞胚（SE）。每次取樣0.1 g，3次重復(fù)，取樣得到的外植體（EX）、愈傷組織（CA）、胚性愈傷組織（EC）和體細(xì)胞胚（SE）樣品液氮凍存后置于-80 ℃冰箱存放。

1.2" 試驗方法

1.2.1" AsaABCB基因鑒定" 根據(jù)大蒜基因組數(shù)據(jù)，構(gòu)建AsaABCB基因編碼的氨基酸序列本地數(shù)據(jù)庫，同時以擬南芥的AtABCB蛋白氨基酸序列（https：//www.arabidopsis.org/）和水稻的OsABCB蛋白氨基酸序列作為參考（https：//www.uniprot.org/）。通過Pfam數(shù)據(jù)庫（https：//www.ebi.ac.uk/interpro/entry/pfam/）查找并下載保守結(jié)構(gòu)域為ABC轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域（PF00005）和ABC跨膜結(jié)構(gòu)域（PF00664）的HMM格式文件，利用HMMER 3.0軟件在大蒜基因組中尋找AsaABCB基因，然后將候選AsaABCB基因編碼的所有蛋白質(zhì)氨基酸序列上傳到SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）數(shù)據(jù)庫，進(jìn)一步驗證候選基因編碼的蛋白質(zhì)中是否存在ABC轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域和ABC跨膜結(jié)構(gòu)域，剔除缺少ABC轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域、ABC跨膜結(jié)構(gòu)域及氨基酸序列小于300編碼的候選基因。最后結(jié)合NCBI CDD數(shù)據(jù)庫，進(jìn)一步確定大蒜AsaABCB家族基因成員。AsaABCB蛋白理化性質(zhì)分析使用在線軟件Expasy（https：//web.expasy.org/protparam/），亞細(xì)胞定位預(yù)測使用在線軟件Cell-PLoc 2.0（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/），AsaABCB蛋白跨膜區(qū)分析使用在線軟件TMHMM2（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）。

1.2.2" AsaABCB基因系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建" 以擬南芥和水稻的ABCB蛋白氨基酸序列作為參考，使用MEGA 11軟件對候選AsaABCB蛋白的氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，采用最大似然法（ML，Maximum Likelihood）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，Bootstrap設(shè)置為1 000，其他參數(shù)為默認(rèn)值。

1.2.3" AsaABCB基因結(jié)構(gòu)、保守基序分析與染色體定位" 利用MEME（https：//meme-suite.org/tools/meme）軟件對17個AsaABCB基因的保守基序進(jìn)行分析，利用TBtools軟件對AsaABCB基因的染色體位置、基因結(jié)構(gòu)和保守基序分布情況進(jìn)行圖片繪制。

1.2.4" AsaABCB基因啟動子順式作用元件預(yù)測" 根據(jù)大蒜基因組數(shù)據(jù)，提取17個AsaABCB基因起始位點上游2 000 bp的序列，利用在線軟件PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對其進(jìn)行啟動子元件分析，利用 TBtools 軟件將其可視化。

1.2.5" AsaABCB基因?qū)π焖?號體細(xì)胞胚發(fā)育的調(diào)控和表達(dá)分析" 取冷凍保存的外植體（EX）、愈傷組織（CA）、胚性愈傷組織（EC）和體細(xì)胞胚（SE）4種不同狀態(tài)下的樣品，液氮環(huán)境下研磨成粉末，利用柱式植物總RNA抽提純化試劑盒提取徐蒜6號的總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司產(chǎn)品）合成cDNA。利用Primer 6.0軟件設(shè)計引物（表1），引物由生工生物（上海）工程股份有限公司合成。以AsACTIN為內(nèi)參基因，利用SGExcel Universal SYBR qPCR Mix試劑盒和實時熒光定量PCR系統(tǒng)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)體系為：10 μL SGExcel Universal SYBR qPCR Mix，7.2 μL無菌去離子水，正向引物和反向引物各0.4 μL，以及2 μL cDNA。反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性15 s，60 ℃退火/延伸 30 s，40個循環(huán)。設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)，利用-2△△Ct法計算基因的相對表達(dá)量。

1.3" 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2007和IBM SPSS Statistics 27.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計和分析，利用Duncan’s法進(jìn)行處理間差異顯著性分析（Plt;0.05），利用TBtools軟件進(jìn)行圖片繪制。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 大蒜AsaABCB基因家族成員的鑒定及其編碼的蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)

大蒜全基因組中共鑒定出17個AsaABCB基因，其編碼的蛋白質(zhì)氨基酸數(shù)量為545～1 379，相對分子量為59 627.17～152 864.21，理論等電點為5.72～9.34。其中AsaABCB4、AsaABCB6、AsaABCB13、AsaABCB17不穩(wěn)定指數(shù)大于40，為不穩(wěn)定性蛋白。AsaABCB17總平均親水性指數(shù)為負(fù)數(shù)，為親水性蛋白，其他均為疏水性蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果表明，AsaABCB4、AsaABCB6、AsaABCB15 3個蛋白質(zhì)定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，其他14個蛋白質(zhì)僅定位于細(xì)胞膜（表2）。跨膜區(qū)域預(yù)測發(fā)現(xiàn)17個AsaABCB蛋白都具有跨膜區(qū)域，但跨膜區(qū)域的數(shù)量各不相同（圖1）。

2.2" 大蒜AsaABCB家族系統(tǒng)進(jìn)化樹

大蒜、水稻和擬南芥中編碼具有ABC轉(zhuǎn)運蛋白保守結(jié)構(gòu)域（PF00005）和跨膜結(jié)構(gòu)域（PF00664）蛋白質(zhì)的ABCB基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹如圖2 A所示。根據(jù)進(jìn)化關(guān)系的遠(yuǎn)近，大蒜、水稻和擬南芥的ABCB基因可以分為5個亞組（亞組1～亞組5），其成員數(shù)量分別為16個、2個、19個、13個、22個（圖2B）。除亞組2外，其他亞組均含有AsaABCB家族成員。亞組1含 AsaABCB8、AsaABCB9、AsaABCB11、AsaABCB16 4個AsaABCB基因；亞組3含AsaABCB4、AsaABCB5、AsaABCB6、AsaABCB12、AsaABCB14 5個AsaABCB基因；亞組4含AsaABCB1、AsaABCB7、AsaABCB13、AsaABCB15、AsaABCB17 5個AsaABCB基因；亞組5含AsaABCB2、AsaABCB3、AsaABCB10 3個AsaABCB基因。

2.3" 大蒜AsaABCB基因染色體定位

大蒜AsaABCB基因的染色體定位預(yù)測結(jié)果如圖3所示。14個AsaABCB家族基因定位在大蒜基因組7條染色體上，另外3個基因AsaABCB1、AsaABCB2、AsaABCB3未能定位在大蒜的8條染色體上，因此將其所在位置命名為0號染色體。其中AsaABCB8、AsaABCB9、AsaABCB10、AsaABCB11 4個基因定位在4號染色體上，AsaABCB5、AsaABCB6、AsaABCB7 3個基因定位在3號染色體上，2號、7號、8號染色體各有1個家族基因，1號染色體上沒有AsaABCB基因。

2.4" 大蒜AsaABCB蛋白的保守基序及結(jié)構(gòu)域

大蒜AsaABCB蛋白的保守基序預(yù)測結(jié)果如圖4A所示。從圖中可以看出，大蒜AsaABCB蛋白中共鑒定出6種保守基序。除AsaABCB3、AsaABCB8、AsaABCB16外，其他AsaABCB蛋白均包含全部的6種保守基序，且其位置一致，表明這14個蛋白質(zhì)的保守性較強(qiáng)。AsaABCB3蛋白沒有保守基序6（Motif 6），AsaABCB8蛋白和AsaABCB16蛋白沒有保守基序2（Motif 2）。

所有AsaABCB蛋白均含有TMD結(jié)構(gòu)域和NBD結(jié)構(gòu)域，且排列順序為TMD-NBD（圖4 B），這說明本研究鑒定得到的17個蛋白質(zhì)均為大蒜AsaABCB蛋白。其中，AsaABCB1、AsaABCB4、AsaABCB5、AsaABCB6、AsaABCB7、AsaABCB10、AsaABCB12、AsaABCB14和AsaABCB15 9個成員含有2個TMD和2個NBD，屬于全分子轉(zhuǎn)運蛋白。AsaABCB2、AsaABCB3、AsaABCB8、AsaABCB9、AsaABCB11、AsaABCB16 6個成員被鑒定為半分子轉(zhuǎn)運蛋白，含有1個TMD和1個NBD結(jié)構(gòu)域。AsaABCB13和AsaABCB17蛋白的結(jié)構(gòu)域排列順序為NBD-TMD-NBD，與傳統(tǒng)意義上的全分子蛋白和半分子蛋白不同。

2.5" 大蒜AsaABCB基因結(jié)構(gòu)

大蒜AsaABCB基因結(jié)構(gòu)可視化結(jié)果如圖5所示。從圖中可以看出，17個大蒜AsaABCB基因含有3～20個外顯子，AsaABCB8基因的外顯子數(shù)量最多，為20個；AsaABCB17基因的外顯子數(shù)量最少，僅3個。

2.6" 大蒜AsaABCB基因順式作用元件

大蒜AsaABCB基因啟動子區(qū)的順式作用元件分布如圖6所示。從圖6中可以看出，大蒜AsaABCB基因啟動子區(qū)含量最多的順式作用元件是光反應(yīng)元件，共196個，各家族基因中均存在；與植物生長發(fā)育相關(guān)元件有5種，包括玉米蛋白質(zhì)代謝調(diào)節(jié)元件、胚乳表達(dá)元件、晝夜節(jié)律控制元件、細(xì)胞周期調(diào)控元件、種子特異性調(diào)節(jié)元件，數(shù)量分別為11個、5個、4個、1個、1個；與脅迫相關(guān)的元件有厭氧調(diào)節(jié)元件、干旱響應(yīng)元件、低溫反應(yīng)元件、防御與脅迫響應(yīng)元件、創(chuàng)傷反應(yīng)元件5種，數(shù)量分別為43個、23個、13個、13個和1個。激素相關(guān)元件中，茉莉酸反應(yīng)調(diào)控元件、脫落酸反應(yīng)元件、生長素響應(yīng)元件和赤霉素反應(yīng)元件較多，數(shù)量分別為48個、26個、12個和12個，分別存在于13個、11個、8個和9個AsaABCB家族基因中。生長素響應(yīng)元件主要存在于AsaABCB2和AsaABCB15基因的啟動子區(qū)，數(shù)量分別為4個和2個，AsaABCB5、AsaABCB9、AsaABCB10、AsaABCB11、AsaABCB12、AsaABCB17等基因各有1個生長素響應(yīng)元件。此外，大蒜AsaABCB基因啟動子區(qū)還存在8個水楊酸反應(yīng)元件。

2.7" 大蒜 AsaABCB家族基因在體細(xì)胞胚發(fā)生過程中的表達(dá)模式

大蒜體細(xì)胞胚發(fā)生過程中，AsaABCB家族成員表達(dá)模式如圖7所示。大蒜體細(xì)胞胚發(fā)生過程中，除AsaABCB13、AsaABCB14、AsaABCB15 和AsaABCB17基因外，其他13個成員相對表達(dá)量均呈先上升再下降的趨勢。AsaABCB2、AsaABCB3、AsaABCB4、AsaABCB5、AsaABCB6、AsaABCB8、AsaABCB9、AsaABCB10、AsaABCB11、AsaABCB15、AsaABCB16" 11個基因在胚性愈傷組織階段的相對表達(dá)量最高， AsaABCB1、AsaABCB7、AsaABCB12、AsaABCB13、AsaABCB17 5個基因在愈傷組織階段相對表達(dá)量最高，而AsaABCB14基因在外植體階段相對表達(dá)量最高。除AsaABCB13、AsaABCB17基因外，其他15個基因在體細(xì)胞胚發(fā)育階段的相對表達(dá)量均比胚性愈傷組織階段有所下調(diào)。

3" 討論

大蒜基因組測序的完成，為開展全基因組關(guān)聯(lián)分析，建立穩(wěn)定高效的大蒜遺傳轉(zhuǎn)化體系以及基因功能驗證等提供了可能。目前對大蒜WOX、NAC、NCED、WRKY等基因家族的鑒定已有研究。ABCB作為三大轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)之一，與PIN和AUX1/LAX協(xié)同調(diào)控植物生長素的極性運輸。本試驗以擬南芥和水稻的ABCB蛋白氨基酸序列作為參考，對大蒜AsaABCB基因家族進(jìn)行全基因組生物信息學(xué)分析，共鑒定出 17個同源性較高的AsaABCB候選基因。系統(tǒng)進(jìn)化分析將其分為5個亞組，大蒜ABCB基因系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果與擬南芥和水稻類似，表明不同物種間ABCB同源基因在進(jìn)化過程中高度保守。染色體定位圖譜顯示，AsaABCB6與 AsaABCB7、AsaABCB14與 AsaABCB15位置幾乎重合，推測其可能存在串聯(lián)重復(fù)現(xiàn)象。串聯(lián)重復(fù)是由非同源重組產(chǎn)生的，這種方式形成的重復(fù)基因在染色體位置上非常接近，串聯(lián)重復(fù)事件在生物進(jìn)化中起著重要的作用，水稻ABCB家族基因中也有類似串聯(lián)重復(fù)事件發(fā)生。

擬南芥中AtABCB21通過調(diào)節(jié)部分組織的生長素濃度參與植株的向光性運動，且在植物生長素濃度較高時充當(dāng)輸出載體蛋白角色，在生長素濃度較低時發(fā)揮內(nèi)流載體蛋白作用。徐艷霞研究發(fā)現(xiàn)OsABCB14編碼水稻中的一個生長素輸入載體。對PhABCB基因家族在毛竹節(jié)間發(fā)育過程中的表達(dá)水平研究發(fā)現(xiàn)，PhABCB7等8個基因在次生細(xì)胞壁（SCW）發(fā)育過程中顯著上調(diào)，而生長素是影響SCW發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子。本研究發(fā)現(xiàn)，大蒜AsaABCB家族成員的啟動子順式作用元件中光反應(yīng)元件最多，存在于每1個AsaABCB家族基因中，植物生長發(fā)育元件有5種，脅迫相關(guān)元件有5種，激素相關(guān)元件有5種。生長素響應(yīng)元件主要存在于AsaABCB2和AsaABCB15基因。

在植物體細(xì)胞胚形成和發(fā)育過程中，生長素起重要調(diào)控作用。番木瓜（Carica papaya）體細(xì)胞胚誘導(dǎo)過程中，生長素內(nèi)流載體蛋白（AUX1/LAX）家族成員表達(dá)量上調(diào)。宋勝利研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)葉百合體細(xì)胞胚發(fā)生過程中，LpABCB21和LpPILS7的相對表達(dá)量顯著上調(diào)。本試驗研究結(jié)果表明，在大蒜胚性愈傷組織階段，AsaABCB2等11個家族基因表達(dá)量最高；在大蒜愈傷組織階段，AsaABCB1等5個家族基因表達(dá)量最高；在體細(xì)胞胚階段，AsaABCB1等15個家族成員表達(dá)量均降低。因此AsaABCB家族基因可能主要調(diào)控大蒜愈傷組織和胚性愈傷組織的形成與發(fā)育，這可能是由于生長素轉(zhuǎn)運過程非常快，在體細(xì)胞胚誘導(dǎo)前期，生長素轉(zhuǎn)運基因就完成了對外源生長素的轉(zhuǎn)運及細(xì)胞內(nèi)的分布，而在后期體細(xì)胞胚發(fā)育階段僅需少量特異的生長素轉(zhuǎn)運基因介導(dǎo)，這一結(jié)論與細(xì)葉百合體細(xì)胞胚發(fā)育過程研究結(jié)果一致。

4" 結(jié)論

本研究共鑒定出17個大蒜AsaABCB家族基因，同時對其基因結(jié)構(gòu)、表達(dá)模式及編碼的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、跨膜結(jié)構(gòu)域等進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，AsaABCB家族基因在進(jìn)化過程中高度保守。啟動子區(qū)存在多種與植物激素相關(guān)的元件，其中茉莉酸反應(yīng)調(diào)控元件、脫落酸反應(yīng)元件和生長素響應(yīng)元件較多。大蒜AsaABCB家族基因主要在大蒜愈傷組織和胚性愈傷組織發(fā)育過程中起作用。本研究結(jié)果為進(jìn)一步探討AsaABCB基因調(diào)控大蒜體細(xì)胞胚發(fā)生機(jī)制提供有力支撐。

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（責(zé)任編輯：石春林）