基于CRISPR/Cas13a系統建立大口黑鱸彈狀病毒檢測方法

張敏琳 黃楓淇 左小玲 梁建韜 梁凱珊 單金紅 李宗烊 喻 婕羅麗媛 禤梓杰 趙會宏, 王 慶,

(1.華南農業大學海洋學院, 廣州 510642; 2.華南農業大學粵港海洋生物資源保護與開發聯合實驗室, 廣州 510642)

大口黑鱸(Micropterus salmoides)是我國重要的淡水經濟魚類之一, 因其肉質鮮美、無肌間刺,加之其適應性強、養殖周期短等優點, 深受消費者和養殖者的喜歡, 近年來大口黑鱸的養殖出現了快速增長[1]。目前, 我國大口黑鱸年養殖產量已達70萬噸, 養殖場主要集中分布在廣東、江蘇、浙江、江西、四川和福建6省份, 占全國生產總量的90%以上[2]。然而, 在大口黑鱸的養殖過程中, 其病害日趨嚴重, 細菌病和病毒病成為危害其養殖的主要疾病[3], 其中大口黑鱸彈狀病毒(Micropterus salmoides rhabdovirus, MSRV)危害巨大。該病毒能引起幼魚嗜睡、漫游、腹部腫脹和體形扭曲, 以及誘導壞死性潰瘍和多器官出血, 一旦感染死亡率超過90%[4]。MSRV是一種包膜狀、短棒狀或子彈狀的單股負鏈RNA病毒, 能夠嚴重危害大口黑鱸養殖業的發展, 該病毒具有傳播速度快、死亡率高、防控難度大的特點[5]。MSRV包含11300—11600個核苷酸, 包括3′非翻譯區和5種結構蛋白[核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基質蛋白(M)、糖蛋白(G)和RNA聚合酶]。其中MSRV的3′前導區與其他魚類彈狀病毒相比在遺傳水平上具有低同源性[6]。彈狀病毒共有9個屬, 除了一些未被分類的病毒之外, 感染魚類的彈狀病毒主要為水泡性口炎病毒屬、諾拉彈狀病毒屬和佩彈狀病毒屬這3個屬[7]。其中, MSRV屬彈狀病毒科(Rhabdoviridae), 水泡性口炎病毒屬(Vesiculovirus)[8,9]。每年因MSRV導致的大口黑鱸魚苗損失超過30%, 給大口黑鱸養殖產業發展帶來巨大損失。但是目前關于該病毒的治療和檢測方法還不成熟, 尤其是現有檢測技術較難做到在無復雜檢測設備的情況下開展現場檢測。

目前關于檢測MSRV的方法主要分為組織病理學檢測、免疫學檢測和分子生物學檢測等。組織病理學檢測主要是采取魚的患病組織器官制作石蠟病理切片, 后在顯微鏡下觀察組織病理變化[10];免疫學檢測主要是采用ELISA檢測大口黑鱸血清中的G蛋白抗體水平, 用以分析MSRV誘導的抗原特異性免疫反應[11]; 分子生物學上經常使用的是聚合酶鏈式反應(PCR)[12]、熒光實時定量PCR[13]等。上述檢測方法還存在一些不足之處, 如檢測方法不夠高效方便、檢測設備需要專業的溫控功能、檢測所需時間較長、實驗人員需要一定的實驗技能等。除此之外, 目前關于MSRV還沒有有效的治療方法, 故很有必要在感染之前及時發現病毒并做好有效的防范措施, 能夠在一定程度上減少養殖過程中的損失。因此, 開發一種靈敏度高、特異性強并且適合現場診斷的MSRV檢測方法迫在眉睫。

CRISPR系統最初是在細菌和古細菌中得到確認[14], CRISPR-Cas系統是結合和切割外來核酸的原核適應性免疫系統[15]。CRISPR-Cas系統主要分為兩類: 使用多蛋白復合物破壞外來核酸的一類系統, 包括Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型, 以及使用單一蛋白質的二類系統, 包括Ⅱ、Ⅴ和Ⅵ型[16]。Ⅰ型和Ⅲ型系統擁有如下特征: Cas核酸內切酶處理前crRNA, 每個crRNA被組裝成多Cas蛋白復合物, 從而可以識別和切割與crRNA互補的核酸片段。而Ⅱ型系統處理前crRNA的機制不同, 其中與前crRNA中重復序列互補的反式激活crRNA(tracrRNA)在Cas9蛋白存在的情況下會觸發雙鏈RNA特異性核糖核酸酶RNaseⅢ的處理[17]。近年來, CRISPR-Cas13a引發了很多的研究。CRISPR-Cas13a(以前稱為C2c2)是一種新表征的單效應子Ⅱ類, Ⅵ型, RNA引導的RNA編輯系統[18]。Cas13a的序列分析顯示存在兩個更高的真核和原核核苷酸結合內核糖核酸酶結構域, 且不存在DNase催化位點[19]。CRISPR-Cas13a具有RNA引導的RNA靶向內切酶和非特異性RNA內切酶活性兩種活性, 故逐漸被開發為核酸檢測的工具[18]。當Cas13a與crRNA結合后, 會形成具有核酸酶活性的核糖核蛋白復合體, 當識別到具有互補序列的單鏈靶標RNA時, 會激活Cas13a切割單鏈靶標RNA[20]。其切割活動可通過連接的熒光體-淬滅體的ssRNA來檢測, 被激活的Cas13a會切割ss-RNA導致其裂解后發熒光[18,21]。基于這一特性,CRISPR/Cas13a的檢測已成功應用于檢測赤點石斑魚神經壞死病毒[22]、豬繁殖與呼吸綜合征病毒[23]和甲型H7N9禽流感病毒[24], Cas13a與對應的crRNA結合形成復合物并且與靶向RNA結合時, Cas13a的切割活性被激活以降解非靶向RNA。

MIRA (Multienzyme Isothermal Rapid Amplification, MIRA)技術是一種基于重組酶恒溫核酸快速擴增技術, 通過MIRA反應可實現對目標核酸序列的擴增, 無須復雜的熱循環儀, 而是可以通過簡單的水浴或加熱塊在20—37℃的恒定溫度下完成。整個反應過程需要3種酶: 重組酶, 負責將特異性引物與模板DNA配對; 單鏈DNA結合蛋白(SSB),在不加熱的情況下形成單鏈DNA; 鏈置換DNA聚合酶, 負責擴增和延伸。反應一旦開始, DNA擴增會迅速進行, 并在20min時間內達到可檢測的水平[25]。與RPA (T4 UvsX)或RAA (大腸桿菌UvsX)中使用的重組酶不同[26], MIRA使用螺旋酶(gp41)和重組酶(SC-recA)的組合來形成單鏈DNA并啟動反應。多酶系統加速了反應速度, 促進了對潛在抑制劑的耐受性。在MIRA中, 核酸模板的擴增過程可以在37—42℃下10—30min內完成。這項技術已被用于檢測豬瘟病毒[25]。與其他等溫擴增類似, 反轉錄-MIRA (RT-MIRA)產物也可以通過側流條檢測或實時定量PCR進行可視化檢測。

本研究開發了一種結合MIRA技術和CRISPR/Cas13a系統的MSRV核酸檢測方法, 該方法特異性強, 靈敏度高并且操作簡便, 為MSRV的現場檢測提供幫助, 也為盡早發現MSRV采取防控措施提供幫助。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

從鱸魚養殖場采集患有大口黑鱸彈狀病毒全長約2 cm的魚苗樣品, 均存放于-80℃冰箱保存。

1.2 實驗儀器與試劑

主要試劑: 純化的LwaCas13a (East Mad東抗生物公司); Tris飽和酚(pH7.8); RNAiso plus和RTPCR試劑盒(TaKaRa公司); 反轉錄試劑(TOYOBO東洋紡公司); T7高產RNA轉錄試劑盒、ChamQ SYBR qPCR Master Mix(Without ROX)試劑盒(Vazyme諾唯贊生物技術有限公司); CRISPR/Cas13a檢測系統的緩沖液使用Macklin麥克林試劑公司定制(40 mmol/L Tris-HCl pH 7.3, 60 mmol/L NaCl,6 mmol/L MgCl2); MIRA-RNA恒溫快速擴增試劑盒(基礎型)(濰坊安普未來生物科技有限公司)。

主要儀器: Tannon2500 凝膠成像系統、實時熒光定量 PCR儀(美國Bio-Rad 公司); 高速離心機(美國Beckman 公司); 電泳儀(北京白晶生物技術有限公司); 紫外透射器(美國MaestroGen公司)。

1.3 crRNA的制備以及MIRA引物設計

在GenBank中下載MSRV序列, 針對其衣殼蛋白(CP)基因序列(NCBI: MK397811.2)設計長度為20 nt的靶點, 并根據靶點所在位置設計出兩個crRNA(分別為crRNA1和crRNA2), 如表1所示, 并通過NCBI-BLAST來確認其特異性。設計使用兩對不同MIRA引物分別對含有靶序列的基因片段進行擴增, 并命名分別為MIRA-F1/R1和MIRA-F2/R2,如表2所示。

表1 針對MSRV設計的crRNA序列Tab.1 crRNA sequences designed for MSRV

表2 MIRA擴增引物序列Tab.2 Primer sequences for MIRA amplification

1.4 MIRA擴增以及體外轉錄

使用MIRA恒溫快速擴增試劑盒,在42℃恒溫條件下, 用MIRA引物將提取出來的樣品RNA進行擴增, 并將擴增產物進行切膠回收, 得到的DNA使用體外轉錄試劑盒體外轉錄為RNA, 從而獲得病毒RNA序列。

1.5 標準品的制備

基于實驗室現有的cDNA庫, 用MSRV引物對cDNA進行qPCR驗證是否為MSRV。經測序確定后的模板cDNA經PCR擴增后進行體外轉錄, 測定濃度并稀釋得到RNA標準品。

1.6 ssRNA報告探針合成

ssRNA報告探針序列為: 5′-UUUUUU-3′, 5′端和3′端分別標記了熒光基團和淬滅基團。我們使用RNA酶來測試ssRNA報告探針作為檢測信號的可行性, 同時, 利用Cas13a蛋白的特性, ssRNA報告探針可被激活的Cas13a蛋白裂解, 從而發出熒光, 可通過簡單的紫外燈或熒光定量儀檢測。

1.7 Cas13a檢測體系

CRISPR/Cas13a檢測反應體系如表3所示, 將反應物充分混勻離心后置于熒光定量儀上, 選擇觀察 FAM 熒光強度, 在37℃恒溫條件下反應1h, 并且每隔1min收集一次熒光值, 反應結束后用紫外燈照射觀察熒光值。

表3 CRISPR /Cas13a檢測體系Tab.3 CRISPR /Cas13a detection system

1.8 檢測體系優化

為了確定用CRISPR/Cas13a檢測MSRV的最佳反應體系, 我們對檢測體系的四個部分進行了優化: crRNA種類、反應溫度、ssRNA報告探針含量以及Cas13a與crRNA的反應濃度比, 同時我們在實驗中使用ddH2O作為空白對照。

首先保持所有的參數不變, 變量為crRNA的種類(即crRNA1和crRNA2), 最后根據單位時間內反應效率及最終收集的熒光值來選擇最佳的crRNA;探究最佳反應溫度, 除了反應溫度, 其他參數保持不變, 分別在31℃、34℃、37℃和40℃進行實驗;接下來, 除了ssRNA報告探針含量, 其他參數保持不變, 設置探針濃度分為100、200、300、400、500、600和700 nmol/L; 最后, 保持其他參數不變, 改變Cas13a與crRNA的反應濃度比。根據單位時間內反應效率及最終收集的熒光值來選擇最佳的反應溫度、ssRNA報告探針濃度及Cas13a與crRNA的反應濃度比。

1.9 靈敏度試驗

使用優化后的CRISPR/Cas13a檢測系統檢測不同濃度的RNA標準品, 以104fM到10-1fM的濃度對RNA標準品進行10倍連續稀釋, 以無目標RNA樣品為陰性對照, 從而探尋CRISPR/Cas13a檢測系統最低檢測濃度。

1.10 特異性試驗

使用優化后的CRISPR/Cas13a檢測系統檢測不同的水產RNA病毒, 包括RGNNV、BFNNV、TPNNV,用無病毒感染魚的RNA作為陰性對照, 用ddH2O作為空白對照, 測試含有特異性crRNA的CRISPR/Cas13a檢測系統是否能檢測出其他的水產RNA病毒。

1.11 重復性試驗以及樣品檢驗

采集有明顯患病跡象的病魚樣品, 并對樣品進行預處理和擴增RNA。采用本研究優化后的CRIS-PR/Cas13a檢測系統, 與實驗室常規使用的MSRV檢測方法(qPCR)做對比, 以MSRV基因作為陽性對照組, 無MSRV病毒感染魚的RNA樣品作為陰性對照組, ddH2O作為空白對照組。

2 結果

2.1 MIRA引物對篩選

使用兩對不同MIRA引物對含有靶序列的基因片段進行擴增, 擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳, 如圖1a所示。電泳圖位于100 bp的位置, 3個泳道均出現明亮的條帶, 表明有非特異性擴增產物。泳道2和3中250 bp處為擴增的目的條帶。用Image J軟件分別將電泳圖泳道2中長度為224 bp和泳道3中長度為255 bp的目的條帶進行定量分析, 并用“灰度值”表示定量分析的結果。從分析結果得出, 灰度值越低表示引物利用率高, 即引物特異性結合擴增效率高,如圖1b所示。結果表明: 采用MIRA-F2/R2引物對時, 特異性結合擴增效率高。

圖1 MIRA引物對篩選電泳膠圖以及灰度值分析Fig.1 MIRA primer pair screening electrophoretic gel plots as well as gray value analysis

2.2 CRISPR/Cas13a檢測體系

CRISPR/Cas13a檢測體系反應結束后用紫外燈進行照射, 觀察熒光值(圖2)。

圖2 CRISPR/Cas13a檢測體系-熒光亮度圖Fig.2 CRISPR/Cas13a detection system-fluorescence brightness map

2.3 CRISPR/Cas13a-MSRV最佳反應體系

我們分別用RNA標準品和擴增的樣品RNA進行實驗, 如圖3a所示, 靶向目標RNA的定位速度,crRNA2要優于crRNA1; crRNA1比crRNA2有更強的最終熒光信號; crRNA1+crRNA2等比例混合使用能綜合兩者的優點, 反應效率更好。

圖3 優化CRISPR/Cas13a-MSRV檢測反應條件檢測效果各數據圖Fig.3 Optimization of CRISPR/Cas13a-MSRV assay reaction conditions to detect the effect of each data graph

探究反應溫度對檢測系統的影響, 設置了31℃、34℃、37℃和41℃不同反應溫度, 如圖3b所示, CRISPR/Cas13a-MSRV檢測體系最佳反應溫度是37℃。

探究ssRNA報告探針濃度對檢測系統的影響,如圖3c所示, 在測試范圍內, 熒光強度與ssRNA報告探針濃度呈正相關, ssRNA報告探針濃度在 500—700 nmol/L檢測效果差異不大, 考慮到現實經濟問題, 最佳的ssRNA報告探針濃度為500 nmol/L。

為探究不同Cas13a與crRNA的反應濃度比對檢測系統的影響, 如圖3d所示, 當以每份100 nmol/L比例的基礎上,Cas13a∶crRNA的比例為4∶1和3∶1時,Cas13a達到飽和狀態; 當Cas13a數量一定時, 熒光信號的強度并沒有與crRNA數量的增加呈正相關。因此, Cas13a與crRNA比例為2∶1時, CRISPR/Cas13a-MSRV檢測系統能夠獲得最大的檢測活性。

2.4 靈敏度評估

為探究CRISPR/Cas13a-MSRV檢測系統對MSRV的最低檢測濃度, 故將RNA標準品進行10倍梯度連續稀釋, 并用CRISPR/Cas13a-MSRV檢測系統進行檢測。如圖4所示, CRISPR/Cas13a-MSRV檢測系統至少能檢測到102fM MSRV的ssRNA。當目標RNA濃度低于102fM時, 機器檢測到的熒光信號與空白對照無明顯差異。因此, CRISPR/Cas13a-MSRV檢測系統至少能檢測到102fM MSRV的ss-RNA。

圖4 評估CRISPR/Cas13a-MSRV檢測系統對MSRV的靈敏度Fig.4 Assessing the sensitivity of the CRISPR/Cas13a-MSRV detection system for MSRV

2.5 特異性評估

為評估CRISPR/Cas13a-MSRV檢測系統的特異性, 使用優化后的CRISPR/Cas13a檢測系統檢測不同的水產RNA病毒, 包括RGNNV、BFNNV和TPNNV。如圖5所示, 只有MSRV的檢測體系能檢測出熒光信號, 其他病毒的檢測體系檢測出的熒光信號與陰性對照無差別, 為陰性結果。這表明CRISPR/Cas13a-MSRV檢測系統可特異性靶向MSRV,該檢測方法特異性很好。

圖5 評估CRISPR/Cas13a-MSRV檢測系統對MSRV的特異性Fig.5 Assessing the specificity of the CRISPR/Cas13a-MSRV detection system for MSRV

2.6 樣品檢測

對從鱸魚養殖場采集有明顯患病跡象的病魚樣品, 驗證病魚所感染病原體是否為MSRV, 使用MSRV衣殼蛋白序列特異性引物進行PCR擴增, 并將圖6a中電泳圖中相對應條帶送測, 比對確認為MSRV。

圖6 MSRV序列信息確認Fig.6 Confirmation of MSRV serial information

對感染了MSRV的病魚樣品進行預處理和預擴增病毒RNA, 然后與陰性對照組進行檢測。同時提取樣品的cDNA做常規檢測qPCR進行比較。如圖7所示, 用CRISPR/Cas13a-MSRV檢測系統檢測出陽性樣品(3、6、7、8、9、12、13、14和15號)與常規檢測qPCR的結果一樣, 其中qPCR的CQ值處于18—25; 而陰性樣品(1、2、4、5、9、10和11號)閾值循環數則都大于38, 表明樣品無攜帶MSVR病毒。綜上所述, CRISPR/Cas13a-MSRV檢測系統與常規檢測RT-qPCR的檢測數據相符合, 表明CRISPR/Cas13a-MSRV檢測系統的可行性且在一定程度上可以代替原先常規繁雜的檢測方法。

圖7 樣品qPCR檢測數據以及CRISPR檢測數據縱向比較圖Fig.7 Longitudinal comparison of sample qPCR assay data and CRISPR assay data

3 討論

大口黑鱸是我國淡水魚養殖的重要品種之一,但是在養殖過程中, 病害頻發, 其中MSRV是影響其苗種成活的主要病原, 幼苗感染該病毒后死亡率可達90%[10]。故盡早發現MSRV并采取有效針對性措施進行預防和控制是至關重要的。準確的病毒核酸檢測方法能為病毒的檢測提供準確且高效的技術支持。在現階段的研究中, 關于MSRV的快速檢測方法的研究很少, 傳統檢測方法需要復雜設備和較長的檢測時間[27]。因此, 建立一種準確、高效的病毒核酸檢測方法對于后續疾病的控制作用很大。

本研究利用CRISPR/Cas13a系統結合等溫擴增MIRA技術檢測MSRV, 根據MSRV的衣殼蛋白序列設計了檢測靶標位點和設計合成了MIRA引物,并用它們進行等溫擴增目標序列, 并對CRISPR/Cas13a-MSRV系統進行了優化, 探索建立了最優的檢測體系為在20 μL的檢測體系中含有200 nmol/L Cas13a、100 nmol/L crRNA1、100 nmol/L crRNA2、500 nmol/L ssRNA報告探針, 在反應溫度為37℃的情況下能夠獲得最佳的CRISPR/Cas13a-MIRA-MSRV檢測效果。此外, 檢測了該方法的靈敏性和特異性, 發現CRISPR/Cas13a-MSRV檢測系統能檢測到102fM的MSRV, 只有MSRV的檢測體系能檢測出熒光信號, 其他病毒的檢測體系檢測出的熒光信號與陰性對照無差別, 說明該檢測系統靈敏度高、特異性強。結合等溫擴增MIRA技術的CRISPR/Cas13a-MSRV核酸檢測方法能在一管內進行反應,當檢測到MSRV時, ssRNA報告探針也相應被裂解,能夠通過肉眼直接觀察。從理論方面來看, 檢測體系中除了crRNA的需要根據樣品而改變, 其他組分不改變, 這在一定程度上能與多種核酸擴增技術相兼容。在本研究中我們還將檢測結果與常規核酸檢測方法qPCR的數據進行了對比, 以檢驗CRISPR/Cas13a技術應用于MSRV檢測的可行性和優勢。檢測結果只有陽性樣本組才能觸發CRISPR/Cas13a系統熒光信號的顯著產生, 而其他非目標序列病毒或陰性對照組則沒有熒光信號, 說明該檢測系統具有良好的特異性。同時, 該檢測系統與qPCR在靈敏度和重復性方面也表現出一致性和穩定性, 陽性樣本檢出符合率高。

基于CRISPR/Cas13a系統的病毒核酸檢測方法, 能夠在短時間內建立, 其靈敏度和特異性高, 且反應迅速, 可在1h內提供檢測結果。反應所需條件簡單, 不需要依賴復雜的熱循環儀, 可在室溫條件下進行。反應可在1個試管里進行, 所耗費試劑的量小, 反應所需的cas13a蛋白及crRNA購買之后可以使用很多次, 故平均每次檢測所需成本很低。在本研究中已經建立了CRISPR/Cas13a-MSRV檢測方法, 檢測過程不需要復雜的變溫條件, 相比使用普通的PCR擴增, 這大大減少了檢測所需時間。另外, 我們的檢測方法可以在20min內檢測到102fM的MSRV, 這與其他的檢測方法相比, 該方法明顯要更迅速得出檢測結果。普通的PCR方法至少需要1h, qPCR通常需要30min到2h的時間。此外, 傳統的分子生物學檢測方法, 如RT-PCR, qPCR的檢測依賴于復雜的熱循環儀或其他昂貴的儀器或試劑; 免疫學檢測方法, 如免疫組化容易出現試劑污染、灰塵污染、染色異常、實驗耗時長等問題, 因此難以應用于非實驗室環境中的現場診斷。而用CRISPR/Cas13a系統進行檢測, 其反應過程不需要依賴熱循環儀, 且結果能夠通過紫外燈照射而得知。從上述實驗的檢測結果發現CRISPR/Cas13a系統可以特異性的檢測MSRV, 并且最低檢測濃度達到102fM。綜上所述, 將CRISPR/Cas13a系統用于MSRV檢測具有現場檢測成本低、可行性高、特異性強, 靈敏度高的特點。

在疾病的發展初期, 及時發現病原體和控制疾病的走向是非常重要的, 特別是病毒性疾病。在此基礎上, 應用CRISPR/Cas系統進行病毒的檢測, 表現出該系統的應用范圍廣的特點。CRISPR/Cas系統是原核生物的免疫系統, 用來抵抗外源遺傳物質的入侵, 比如噬菌體病毒和外源質粒。CRISPR/Cas系統可以識別出外源DNA或RNA, 并將其切斷, 這表明CRISPR/Cas系統擁有精確的靶向功能, 因此應用該系統進行病毒檢測具有較高的特異性[28]。CRISPR/Cas系統主要針對大多數DNA起作用, 而CRISPR/Cas13a系統針對的是RNA[29]。以往的RNA病毒檢測中會存在靈敏度不高的問題, 容易出現錯檢、漏檢的現象。在現在的研究中, Liu等[30]將CRISPR/Cas13a系統用于嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒-2(SARS-CoV-2)的檢測, 實現最低檢測濃度達到0.25拷貝/μL。Huang等[31]也將CRISPR/Cas13a系統用于貓杯狀病毒(FCV)的檢測, 實現最低檢測濃度達到13.13拷貝/μL, 達到了快速高效的檢測效果。基于該特點, CRISPR/Cas13a系統有望成為在臨床上快速、方便且準確診斷RNA病毒的工具。

同時, 該檢測方法在運用CRISPR/Cas13a系統的基礎上結合了等溫擴增MIRA技術, 等溫擴增MIRA技術與重組酶聚合酶擴增(RPA)類似, 是1種新型的核酸快速等溫擴增技術。能在5—30℃條件下25—42min完成反應, 可有效避免其他擴增技術的缺點, 更加靈敏、特異、經濟、方便[32]。因此,在反應條件和時間方面, 等溫擴增MIRA技術比起普通的PCR, 要更加適合于現場的快速檢測。

綜上所述, 本研究建立的CRISPR/Cas13a-MSRV檢測方法不需要昂貴的實驗儀器, 可使現場檢測變得快速、準確且方便。因此, 在實際養殖過程中如果采用該種檢測方法對MSRV進行及時的發現, 并采取針對性的有效措施, 這在很大程度上能夠減少養殖過程中病害帶來的損失, 并且該檢測方法快捷、靈敏度高、特異性高, 具有較大的應用和推廣前景。