華南熱帶水庫擬柱孢藻產(chǎn)毒基因型的低優(yōu)勢及影響因子分析
——以珠海市水庫為例

吳孟李 范利青 吳艷龍 秦 偉 商添雄 程 楠 雷臘梅

(1.珠海市供水與排水治污中心, 珠海 519000; 2.珠海市水資源中心, 珠海 519000;3.暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院生態(tài)學(xué)系, 廣州 510632)

拉氏擬柱孢藻(Cylindrospermopsis raciborskii,簡稱擬柱孢藻CYL)被認(rèn)為是熱帶特征性藍(lán)藻, 有學(xué)者建議將其與尖頭藻合并, 改稱拉氏尖頭藻(Raphidiopsis raciborskii)[1]。擬柱孢藻所產(chǎn)生的擬柱孢藻毒素(CYN)是一類環(huán)胍類生物堿物質(zhì), 具有肝毒性,神經(jīng)毒性、繁殖毒性和細(xì)胞毒性, 進(jìn)入細(xì)胞后能抑制谷胱甘肽、細(xì)胞色素P450和蛋白質(zhì)的合成, 是一種潛在的致癌物, 對(duì)人類健康造成嚴(yán)重危害[2,3]。澳大利亞最早對(duì)飲用水中CYN濃度進(jìn)行限定, 安全限值為1 μg/L[3], 美國在2016年也發(fā)布了CYN衛(wèi)生警告水平, 6歲以下人群為≤0.7 μg/L, 6歲以上則為≤3.0 μg/L[4], 2022年WHO建議CYN的長期暴露濃度應(yīng)不超過0.7 μg/L。由此可見, CYN引起的水華毒性在國際上已廣受關(guān)注。

作為一種入侵藍(lán)藻, 擬柱孢藻已廣泛擴(kuò)張至加拿大、新西蘭、歐洲各國等溫帶地區(qū)的水體, 目前僅南極洲未出現(xiàn)擬柱孢藻的報(bào)道[5,6]。在我國, 擬柱孢藻發(fā)現(xiàn)在廣東、福建、云南、湖北、臺(tái)灣、山東和北京等多個(gè)省份有分布[7—11], 并在臺(tái)灣、福建、廣東等地區(qū)形成優(yōu)勢和較高生物量[7,11,12],尤其在地處熱帶-亞熱帶的廣東省, 擬柱孢藻已逐漸取代微囊藻成為多個(gè)水庫的優(yōu)勢種群, 在廣東省江門市鎮(zhèn)海水庫中常年優(yōu)勢度可達(dá)93.5%[9,13]。

然而, 在自然水體中同一藍(lán)藻的產(chǎn)毒和非產(chǎn)毒基因型往往共存, 兩者通過顯微觀測無法區(qū)分[14,15],基于毒素合成酶基因的PCR檢測可鑒別兩種基因型, 而進(jìn)一步發(fā)展的熒光定量PCR(qPCR)則可實(shí)現(xiàn)對(duì)水體中產(chǎn)毒和非產(chǎn)毒藍(lán)藻的準(zhǔn)確定量[16,17]。包括我國在內(nèi)的世界上許多國家已將qPCR大量應(yīng)用于湖泊、水庫及河流中產(chǎn)毒微囊藻的分布動(dòng)態(tài)及室內(nèi)模擬研究[15,16,18,19]。相比較而言, 盡管擬柱孢藻已廣泛分布于全球, 將qPCR用于產(chǎn)毒擬柱孢藻監(jiān)測的研究僅有幾例[14,20—23], 如我國澳門水庫中產(chǎn)毒擬柱孢藻豐度與氨氮濃度顯著正相關(guān)[22], 澳大利亞North Pine水庫中開展的中宇宙試驗(yàn)則發(fā)現(xiàn)磷添加顯著促進(jìn)浮游植物群落中產(chǎn)毒擬柱孢藻的生長[14]。初步研究表明環(huán)境因子在調(diào)節(jié)產(chǎn)毒和非產(chǎn)毒兩種基因型的演替中起重要作用[20,22—23], 但基于上述有限的研究難以弄清產(chǎn)毒基因型的發(fā)生規(guī)律。

在我國, 產(chǎn)毒擬柱孢藻和CYN已在浙江、湖北、福建、安徽、廣東、澳門等地區(qū)的水體被檢測到[8,21,22,24,25], Jiang等[8]認(rèn)為產(chǎn)CYN的擬柱孢藻在我國是呈零星分布的, 非產(chǎn)毒擬柱孢藻的分布更為普遍。而基于Lei等[9]的研究, CYN在廣東省東莞市水庫中廣泛分布, 檢到的頻次顯著高于微囊藻毒素, 濃度最高可達(dá)8.25 μg/L, 但該研究沒有區(qū)分?jǐn)M柱孢藻的產(chǎn)毒與非產(chǎn)毒種群。Lei等[21]進(jìn)一步建立了基于CYN毒素合成酶基因cyrJ的qPCR方法, 發(fā)現(xiàn)廣東省水庫約74%的樣品中可檢到產(chǎn)毒擬柱孢藻, 即產(chǎn)毒基因型在該地區(qū)廣泛存在, 但其在擬柱孢藻種群中并不占優(yōu)勢, 最高比例不超過35%, 而目前對(duì)產(chǎn)毒擬柱孢藻在我國熱帶地區(qū)發(fā)生分布的影響因子還缺乏研究。本研究以位于華南熱帶地區(qū)的廣東省珠海市20座水庫為對(duì)象, 對(duì)比分析2018和2022年水庫中產(chǎn)毒擬柱孢藻豐度、比例和CYN濃度的變化, 結(jié)合同步測定的環(huán)境因子, 分析和了解產(chǎn)毒擬柱孢藻發(fā)生分布規(guī)律, 為該地區(qū)防范擬柱孢藻水華的毒性風(fēng)險(xiǎn)和水質(zhì)管理提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 采樣點(diǎn)的布設(shè)與樣品采集

珠海市位于廣東省南部, 全市都屬于熱帶地區(qū)(21°48′—22°27′ N 和 113°03′—114°19′E; 圖1)。20座水庫主要分布在香洲區(qū)(7座)和斗門區(qū)(8座),高新區(qū)和高欄港區(qū)各2座, 大鏡山、竹銀、乾務(wù)和鳳凰山等4座水庫為中型水庫, 其余16座為小型水庫(表1)。分別在2018和2022年對(duì)20座水庫進(jìn)行采樣, 除了大鏡山和蛇地坑水庫的采樣是在2018年的10月進(jìn)行, 其他水庫的采樣均在當(dāng)年雨季結(jié)束后的7—8月進(jìn)行, 并在1周內(nèi)完成所有水庫的采樣。在水庫的出水口或大壩處設(shè)置1個(gè)監(jiān)測點(diǎn), 2次共采集到40個(gè)樣品。在水庫監(jiān)測點(diǎn)的表層0.5 m處使用有機(jī)玻璃采水器采集2 L水樣, 于2h內(nèi)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室, 其中1 L用于理化指標(biāo)測定, 另外1 L水樣取200 mL用0.45 μm孔徑濾膜過濾收集藻細(xì)胞用于DNA 提取, 同時(shí)取2 mL水樣用于測定總擬柱孢藻毒素和微囊藻毒素濃度, 上述處理的樣品未測定前直接凍存于-20℃冰箱保存。

表1 珠海市20座調(diào)查水庫的主要特征參數(shù)Tab.1 Main characteristics of twenty reservoirs in Zhuhai city

圖1 珠海市20座調(diào)查水庫的分布Fig.1 Location of twenty reservoirs in Zhuhai city

1.2 理化指標(biāo)分析

1.3 熒光定量PCR分析

水庫浮游植物樣品中的基因組DNA采用試劑盒(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司)提取, 將收集到藻細(xì)胞的濾膜剪碎, 加入800 μL試劑盒中的裂解液, 置于細(xì)胞破碎儀(Fastprep 24-5G)輔助裂解細(xì)胞,隨后按照說明書進(jìn)行DNA的提取, 在分析前基因組DNA置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

水樣中的總擬柱孢藻豐度和產(chǎn)毒擬柱孢藻豐度的測定采用Lei等[21]建立的熒光定量PCR(qPCR)方法, 該方法針對(duì)擬柱孢藻rpoC1基因(RNA聚合酶β'亞基1)和cyrJ基因(CYN合成酶基因簇中的J基因)篩選獲得特異性引物對(duì)和探針(表2)。以克隆有兩個(gè)基因的質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品, 利用質(zhì)粒 DNA 為模板建立rpoC1和cyrJ基因的不同拷貝數(shù)與對(duì)應(yīng)Ct值間的標(biāo)準(zhǔn)曲線, 獲得基因組拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)與Ct值的線性方程, 根據(jù)樣品的Ct值算出其初始模板的濃度,計(jì)算獲得水體中的擬柱孢藻總豐度(rpoC1基因拷貝數(shù))和產(chǎn)毒擬柱孢藻豐度(cyrJ基因拷貝數(shù)), 非產(chǎn)毒擬柱孢藻豐度為兩者的差值, 擬柱孢藻種群中產(chǎn)毒細(xì)胞比例為(cyrJ/rpoC1)×100。

表2 熒光定量PCR主要的引物和探針序列Tab.2 Premiers and probes for Real-time PCR

熒光定量PCR反應(yīng)體系如下: PCR反應(yīng)液15.4 μL,引物探針混合液2 μL, Hot-startTaq酶1.2 μL, DNA模板5 μL, 加純水至50 μL。PCR反應(yīng)為熱啟動(dòng), 反應(yīng)條件: 95℃, 2min, 然后94℃ 15s, 55℃ 45s, 50個(gè)循環(huán)。

1.4 擬柱孢藻毒素和微囊藻毒素分析

水庫水樣反復(fù)凍融后超聲處理1min, 離心10min后留上清液用于擬柱孢藻毒素(CYN)和微囊藻毒素(MC)濃度的測定。MC的檢測采用美國Beacon公司的微囊藻毒素檢測試劑盒, 該試劑盒是為直接競爭ELISA(酶聯(lián)免疫吸附性分析)模式, 在450 nm波長進(jìn)行吸光值的測定后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線, 獲得線性模擬曲線和方程, 并根據(jù)方程計(jì)算樣品中MC濃度。

CYN的檢測亦為直接競爭ELISA方法, CYN單克隆抗體N8為Lei等[27]篩選制備, HRP-CYN采用文獻(xiàn)[28]報(bào)道的連接方法, ELISA具體步驟如下: 包被二抗的微孔板中依次加入50 μL的HRP-CYN、CYN標(biāo)準(zhǔn)品(0、0.1、1、5和10 ng/mL)或樣品、CYN單抗N8, 37℃振動(dòng)孵育1h, 洗滌液沖洗6次, 加入顯色劑100 μL, 室溫孵育10—30min, 加入終止液后采用酶標(biāo)儀測OD450nm的吸光值, 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算樣品中CYN濃度。

1.5 數(shù)據(jù)處理和分析

在R軟件采用程序包boxplot對(duì)2018和2022年的環(huán)境因子、總擬柱孢藻和產(chǎn)毒擬柱孢藻豐度、產(chǎn)毒細(xì)胞比例和CYN濃度進(jìn)行箱須圖的繪制, 并采用One-way ANOVA進(jìn)行顯著性比較, 顯著水平為P＜0.05。對(duì)擬柱孢藻豐度、產(chǎn)毒藻比例、CYN濃度與環(huán)境因子進(jìn)行Spearson相關(guān)分析并在P＜0.05水平上進(jìn)行統(tǒng)計(jì)顯著性檢驗(yàn)。采用混合效應(yīng)模型分析環(huán)境因子對(duì)擬柱胞藻豐度和產(chǎn)毒細(xì)胞比例的影響,并將采樣年份設(shè)為隨機(jī)變量, 分析前將擬柱孢藻豐度進(jìn)行l(wèi)og2(N+1)轉(zhuǎn)換。在R語言中調(diào)用 “l(fā)mertest”包估計(jì)線性混合效應(yīng)模型參數(shù), 使用“step”函數(shù)剔除模型中不顯著的變量。

2 結(jié)果

2.1 水庫理化特征

圖2顯示了2018和2022年兩次調(diào)查的理化因子均值和變化范圍。兩次調(diào)查時(shí)20座水庫水溫均值都在30℃以上, 10月采樣的大鏡山和蛇地坑水溫稍低, 分別為26℃和23℃。2018年水庫的pH為5.26—8.97, 比2022年(7.19—8.5)波動(dòng)明顯, 但兩個(gè)年份間pH差異不顯著(P＞0.05); 水庫的透明度整體在2018年更深, 但2018和2022年間無顯著差異(P＞0.05)。2018和2022年水庫TP濃度分別在0.01—0.112和0.005—0.05 mg/L, 2018年20座水庫的TP和NO3-N濃度均值均高于2022年, 但統(tǒng)計(jì)分析表明兩個(gè)年份間差異不顯著(P＞0.05)。PO4-P是濃度呈顯著增加的唯一理化因子(P＜0.01), 2022年20座水庫的均值為14.9 μg/L, 比2018年高3.4倍。與2018年相比,水庫的TN和NH4-N濃度在2022年顯著下降(P＜0.05), 兩者的均值分別從2018年的1.38和0.097 mg/L降至2022年的0.66和0.034 mg/L。均發(fā)現(xiàn), 2018和2022年水庫Chl.a濃度分別為0.685—69.73和0.5—46 μg/L, 最高濃度出現(xiàn)在2018年的南屏水庫, 盡管Chl.a濃度在水庫間差異明顯, 但兩個(gè)年份間無顯著差異(P＞0.05)。根據(jù)TSI指數(shù), 兩次調(diào)查時(shí)珠海市水庫整體為中營養(yǎng)狀態(tài), 2018和2022年間的TSI均值無顯著差異(P＞0.05); 茶冷逕水庫為唯一的貧營養(yǎng)水庫, 但其TSI從2018年的29.3上升到2022年38.3,2022年TSI＞50的水庫為6座(大鏡山、梅溪、竹銀、先鋒嶺、木頭沖和白水寨), 稍高于2018年的4座(大鏡山、南屏、竹銀和竹仙洞)。

圖2 2018年和2022年20座水庫理化因子變化范圍的比較Fig.2 Comparison of variabilities on environmental variables of twenty reservoirs between 2018 and 2022

2.2 水庫中的總擬柱孢藻、產(chǎn)毒擬柱孢藻豐度和比例

在兩次調(diào)查期間, 基于rpoC1和cyrJ基因的熒光定量PCR方法在20座水庫的40個(gè)樣品中均檢到擬柱孢藻, 在其中33個(gè)樣品中檢到產(chǎn)毒擬柱孢藻,2018和2022年未檢到產(chǎn)毒基因型的樣品分別為3個(gè)(大鏡山、青年和茶泠逕)和4個(gè)(銀坑、乾務(wù)、西坑水陂和先鋒嶺), 表明這些水庫中只存在非產(chǎn)毒基因型或產(chǎn)毒基因型豐度低至無法檢出。2018和2022年20座水庫的擬柱孢藻總豐度分別在2.03×104—5.71×108和4.79×105—2.3×109cells/L(圖3A), 產(chǎn)毒擬柱孢藻豐度分別在1.33×103—2.18×108和5.26×103—1.14×108cells/L(圖3B), 種群內(nèi)產(chǎn)毒基因型的比例(cyrJ/rpoC1)在0.046%—38.66%, 最大值出現(xiàn)在2018年的龍井水庫(圖3B), 但20座水庫中產(chǎn)毒基因型比例在2018和2022年均沒有超過50%, 表明非產(chǎn)毒基因型在擬柱孢藻種群內(nèi)占據(jù)優(yōu)勢。

圖3 2018年和2022年20座水庫的總擬柱孢藻豐度(rpoC1拷貝數(shù))(A)、產(chǎn)毒擬柱孢藻豐度(cyrJ拷貝數(shù), 柱狀圖)(B)和比例(cyrJ/rpoC1, 散點(diǎn)圖)及其變化范圍(C)Fig.3 Total abundances of C.raciborskii (A, rpoC1 gene copies), the abundances of the toxic genotypes (B, cyrJ gene copies) and its ratio within C.raciborskii population (B, cyrJ/rpoC1) in twenty reservoirs and their variabilities in 2018 and 2022 (C)

2022年有17座水庫總擬柱孢藻豐度較2018年明顯增加, 水庫總豐度均值從2018年的3.41×107cells/L上升至2022年的3.15×108cells/L, 增長近10倍, 兩個(gè)年度間總擬柱孢藻豐度呈顯著差異(圖3C;P＜0.05)。盡管2022年有13座水庫的產(chǎn)毒細(xì)胞豐度較2018年有一定的升高, 但兩個(gè)年度間的產(chǎn)毒細(xì)胞豐度均值無顯著差異(圖3C;P＞0.05)。從2018年到2022年, 非產(chǎn)毒基因型在擬柱孢藻種群內(nèi)的優(yōu)勢進(jìn)一步擴(kuò)大, 產(chǎn)毒基因型比例進(jìn)一步顯著降低(P＜0.05),其均值和最大值分別從2018年的14.86%和38.66%降至2022年的4.17%和17.24%(圖3B和3C)。

2.3 擬柱孢藻毒素和微囊藻毒素濃度

2018年水庫樣品僅測定了CYN濃度, 僅大鏡山水庫未檢到CYN, 其他19座水庫中CYN濃度范圍在0.19—1.58 μg/L(圖4A), 最高濃度出現(xiàn)在乾務(wù)水庫。2022年同時(shí)檢測了CYN和MC, 20座水庫中有6座水庫(梅溪、銀坑、乾務(wù)、龍井、鳳凰山和先鋒嶺水庫)中未檢到CYN, 其他14座水庫中CYN濃度在0.1—0.767 μg/L(圖4A); MC僅在竹銀和先鋒嶺兩座水庫中檢到, 濃度分別為0.192和0.103 ng/mL。2018年有4座水庫(銀坑、乾務(wù)、龍井和南山)的CYN濃度超過WHO建議的0.7 μg/L的安全限值, 而2022年僅月坑水庫的CYN濃度超過安全限值(圖4A)。與2018年相比, 16座水庫的CYN濃度在2022年出現(xiàn)明顯下降, 2018年水庫的CYN濃度均值(0.56 μg/L)顯著高于2022年(0.19 μg/L; 圖4B;P＜0.05)。

圖4 2018和2022年20座水庫中的CYN濃度(A)及變化范圍的箱須圖(B)Fig.4 CYN concentrations in twenty reservoirs (A), and its range of variability in 2018 and 2022 (B)

2.4 產(chǎn)毒擬柱孢藻豐度和比例、擬柱孢藻毒素濃度與環(huán)境因子的關(guān)系

Spearson相關(guān)分析表明(表3), 總擬柱孢藻豐度和產(chǎn)毒基因型豐度與pH (P＜0.001), Chl.a(P＜0.05)和 TSI (P＜0.05)呈顯著正相關(guān); 此外, 總擬柱孢藻豐度還與PO4-P (P＜0.05)顯著正相關(guān), 與NO3-N (P＜0.05)顯著負(fù)相關(guān)。種群中產(chǎn)毒擬柱孢藻的比例則與TN和 NH4-N都呈顯著正相關(guān)(P＜0.05)。CYN濃度分別與水溫(P＜0.01)和NH4-N (P＜0.05) 顯著正相關(guān); 此外, 線性回歸分析表明CYN與與總擬柱孢藻豐度無明顯關(guān)系, 與產(chǎn)毒細(xì)胞比例均呈極顯著正相關(guān)(圖5B;R2=0.459;n=40;P＜0.001), 與產(chǎn)毒細(xì)胞豐度呈顯著相關(guān)(圖5A;R2=0.133;n=40;P＜0.05)。

表3 總擬柱孢藻豐度、產(chǎn)毒擬柱孢藻豐度、產(chǎn)毒擬柱孢藻比例、CYN濃度與理化因子的相關(guān)系數(shù)Tab.3 Spearman correlations coefficients of environmental variables with total and toxic C.raciborskii abundance, ratio of toxic cell and CYN concentration

圖5 CYN濃度與產(chǎn)毒擬柱孢藻豐度的對(duì)數(shù)值(A)和產(chǎn)毒細(xì)胞比例(B)間的線性回歸關(guān)系Fig.5 Linear regression between CYN concentrations and the log10 toxic abundance (A) and the ratio of toxic strains within C.raciborskii population (B)

采用混合效應(yīng)模型分析擬柱孢藻豐度與各環(huán)境因子間的關(guān)系, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)年際間的隨機(jī)效應(yīng)不顯著(P＞0.05), 用“step”函數(shù)篩選后得到線性模型, 結(jié)果顯示PO4-P和NO3-N是總擬柱孢藻和非產(chǎn)毒擬柱孢藻豐度的顯著解釋變量(表4), 兩者豐度的對(duì)數(shù)值均隨PO4-P濃度的升高而增加, 隨NO3-N濃度的降低而減少(圖6)。混合效應(yīng)模型分析表明水溫(T)對(duì)產(chǎn)毒細(xì)胞比例有顯著影響(coef.est=2.01; coef.se=0.83; df=37;P=0.02)。

表4 總擬柱孢藻和非產(chǎn)毒細(xì)胞豐度與PO4-P和NO3-N的線性混合效應(yīng)模型Tab.4 The GLMM models between the log abundances of total and non-toxic C.raciborskii and of concentrations PO4-P and NO3-N

圖6 總擬柱孢藻(A和B)和非產(chǎn)毒細(xì)胞豐度(C和D)與無機(jī)磷(PO4-P)和硝態(tài)氮(NO3-N)的線性關(guān)系Fig.6 The relationship between the log abundances of total (A and B) and non-toxic (C and D) C.raciborskii and of concentrations PO4-P and NO3-N

3 討論

與微囊藻易聚集形成表面水華不同, 擬柱孢藻在水柱中的垂直分布較為均勻, 特別是在中小型水庫中幾乎沒有空間差異[22], 因此很多研究均采取表層浮游植物樣品進(jìn)行觀測[11—13,20]。本研究采用前期建立的基于rpoC1和cyrJ基因的qPCR方法對(duì)珠海市20座水庫表層0.5 m的樣品進(jìn)行定量分析[21], 結(jié)果發(fā)現(xiàn)在2018年和2022年兩次調(diào)查的40個(gè)樣品中均檢到擬柱孢藻, 其中33個(gè)樣品檢到產(chǎn)毒擬柱孢藻,表明該類水華藍(lán)藻已在廣東省水庫廣泛分布[9,29],產(chǎn)毒擬柱孢藻的發(fā)生也極為普遍[21,30]。從兩次調(diào)查的結(jié)果可知, 種群內(nèi)產(chǎn)毒基因型的比例最高為38.66%, 這與我們前期在廣東省的觀測結(jié)果一致[21,30],即非產(chǎn)毒基因型在擬柱孢藻種群內(nèi)占據(jù)優(yōu)勢。從2018到2022年, 擬柱孢藻總豐度均值增長了近十倍,這意味著我國熱帶水庫中擬柱孢藻的水華強(qiáng)度在明顯增加。然而種群內(nèi)產(chǎn)毒基因型表現(xiàn)出不一樣的規(guī)律, 其平均豐度和最高豐度在兩次調(diào)查間均沒有顯著差異, 這使得產(chǎn)毒基因型的比例進(jìn)一步降低,非產(chǎn)毒擬柱孢藻在熱帶水庫的優(yōu)勢度進(jìn)一步擴(kuò)大。

一般認(rèn)為水體富營養(yǎng)化程度的加劇導(dǎo)致有害藻類增加[15,31], 氮磷是所有藻類生長必需的營養(yǎng)物質(zhì), 在控制浮游植物生長中起主要的限制作用[5,15,31]。線性回歸模型顯示擬柱孢藻總豐度與PO4-P呈顯著正相關(guān), 與NO3-N呈負(fù)相關(guān), 表明水庫無機(jī)磷濃度的升高和氮的下降有利于該藍(lán)藻增殖并形成優(yōu)勢。擬柱孢藻能在全球快速擴(kuò)張的策略之一是具靈活的磷利用策略, 擁有快速吸收和儲(chǔ)存無機(jī)磷的能力[5,6,32], 因而可明顯受益于2018年到2022年珠海水庫PO4-P濃度的顯著上升, 擬柱孢藻快速增殖而導(dǎo)致其豐度增加近10倍。作為一種固氮藍(lán)藻, 擬柱孢藻可在水體氮不足的條件下形成異形胞固氮, 從而為其生長提供氮源[33,34]。因此相對(duì)于微囊藻等非固氮藍(lán)藻, 珠海水庫氮濃度的下降會(huì)更有利于固氮擬柱孢藻的優(yōu)勢形成[15,35], 使得擬柱孢藻總豐度與NO3-N 濃度呈顯著負(fù)相關(guān), 這樣的相關(guān)性在其他水庫的研究中也有觀測到[33—36]。基于顯微觀測的結(jié)果, 浮游植物群落中擬柱孢藻在大鏡山、鳳凰山等水庫的相對(duì)豐度最高可達(dá)99.7%(未發(fā)表的數(shù)據(jù)),是Chl.a濃度的主要貢獻(xiàn)者, 調(diào)查期間水庫較高的水溫(＞30℃)和其他環(huán)境條件都有利于擬柱孢藻生長,導(dǎo)致在Spearson相關(guān)性分析中其豐度與pH呈極顯著正相關(guān), 也有研究發(fā)現(xiàn)擬柱胞藻偏好高pH的生長環(huán)境[5,36]。

我們的結(jié)果表明擬柱孢藻種群內(nèi)的產(chǎn)毒和非產(chǎn)毒基因型對(duì)PO4-P和NO3-N的響應(yīng)不同: 由線性回歸模型可知非產(chǎn)毒擬柱孢藻豐度與上述兩種營養(yǎng)鹽分別呈正相關(guān)和負(fù)相關(guān), 產(chǎn)毒擬柱孢藻則與它們沒有明顯的關(guān)系, 這意味著高磷低氮的條件更有利于非產(chǎn)毒擬柱孢藻獲得競爭優(yōu)勢。這與前期的研究不一致, Zhang等[22]發(fā)現(xiàn)澳門水庫中產(chǎn)毒細(xì)胞豐度與氨氮濃度顯著正相關(guān), Burford等[5]的中宇宙實(shí)驗(yàn)則顯示無機(jī)磷升高顯著促進(jìn)產(chǎn)毒擬柱孢藻生長。比較基因組分析表明產(chǎn)毒和非產(chǎn)毒藍(lán)藻的本質(zhì)區(qū)別在于毒素合成酶基因簇的有無, 而產(chǎn)毒一直被認(rèn)為能增加藍(lán)藻自身的競爭優(yōu)勢[17,37], 產(chǎn)毒擬柱孢藻對(duì)鐵限制、高光、氮限制等脅迫條件的適應(yīng)要高于非產(chǎn)毒藻株[38—40]。然而, 近期不少學(xué)者提出常見的藍(lán)藻毒素如微囊藻毒素和CYN均是富氮毒素, 由于毒素的合成需要碳、氮等物質(zhì)構(gòu)建毒素分子[15,41], 氮磷營養(yǎng)的單限制和共限制下都將使產(chǎn)毒藻的競爭優(yōu)勢降低和毒素產(chǎn)量下降[15,30,42,43], 這可能是珠海市水庫中產(chǎn)毒擬柱孢藻比例和CYN濃度進(jìn)一步下降的原因, 最終使得非產(chǎn)毒擬柱孢藻在珠海水庫氮濃度下降的情況下占據(jù)優(yōu)勢。

作為熱帶特征性種類, 擬柱孢藻被認(rèn)為會(huì)更加受益于水溫的升高[44], 但統(tǒng)計(jì)分析沒有發(fā)現(xiàn)兩者間存在顯著關(guān)系, 這可能是兩次采樣主要在水溫較高的7—8月進(jìn)行, 溫度波動(dòng)很小所致。本研究發(fā)現(xiàn)溫度的升高會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)毒基因型比例增加, 即擬柱孢藻種群內(nèi)會(huì)發(fā)生非產(chǎn)毒基因型向產(chǎn)毒基因型的轉(zhuǎn)變,這與很多在微囊藻中觀測到的結(jié)果相一致, 推測隨著全球氣候變暖, 與微囊藻水華類似, 擬柱孢藻水華也將趨于具更高的毒性[31,45]。Spearson相關(guān)分析還發(fā)現(xiàn)溫度與CYN濃度呈顯著正相關(guān), 與前期我國東莞市的水體和巢湖及埃及、波蘭等水體中的觀測結(jié)果一致[3,9,24], 這表明珠海市水庫的CYN風(fēng)險(xiǎn)主要出現(xiàn)在夏季高溫時(shí)期。

2018年和2022年CYN在珠海市20座水庫的檢出率分別為95%和70%, 我國巢湖在6—7月夏季水華期的CYN檢出率達(dá)100%[24], 結(jié)合前期東莞市和廣東省其他水庫的研究[9,21], 可以推斷CYN在廣東省發(fā)生頻率極高[8], 該毒素可能也已廣泛分布在全國的水體中, 但監(jiān)測數(shù)據(jù)極為匱乏。與東莞市水庫中最高濃度8.25 ng/mL相比[9], 本次調(diào)查的珠海市水庫CYN濃度明顯很低, 尤其是2022年僅月坑水庫超過WHO的安全限值0.7 μg/L, 最高濃度(0.784 μg/L)較東莞市低10倍。2022年珠海市水庫中微囊藻毒素的檢出率和濃度均顯著低于CYN, 與東莞市和廣東省其他水庫的研究結(jié)果一致[9,29], 表明我國熱帶水庫中CYN的發(fā)生較微囊藻毒素更為普遍, 需在該地區(qū)關(guān)注其對(duì)水庫供水安全的威脅。一般認(rèn)為藍(lán)藻毒素濃度與其產(chǎn)生者的豐度間會(huì)呈正相關(guān)[9,24,29],然而本研究發(fā)現(xiàn)擬柱孢藻豐度與CYN無相關(guān)性, 這可能是因?yàn)閿M柱孢藻并非是CYN的產(chǎn)生者, 如歐洲水體可檢到該毒素, 但其產(chǎn)生者主要為束絲藻[5,46]。然而, 我們?cè)谥楹Ｊ兴畮熘袕V泛檢到產(chǎn)CYN的擬柱孢藻, CYN濃度與產(chǎn)毒擬柱孢藻豐度和比例呈正相關(guān), 這與前人的觀點(diǎn)相一致, 即產(chǎn)毒基因型的豐度和比例更適合用來指征藍(lán)藻水華毒性[14,47]。因此在評(píng)估擬柱孢藻水華的潛在健康風(fēng)險(xiǎn)時(shí), 對(duì)產(chǎn)毒細(xì)胞進(jìn)行定量分析將更具指導(dǎo)意義。

4 結(jié)論

(1)本研究進(jìn)一步證實(shí)了產(chǎn)毒擬柱孢藻和CYN在我國熱帶水庫中廣泛分布, 非產(chǎn)毒擬柱孢藻在種群中占據(jù)優(yōu)勢; (2)對(duì)比2018年的監(jiān)測, 2022年擬柱孢藻在熱帶水庫呈大幅度增加趨勢, 但其產(chǎn)毒基因型豐度基本穩(wěn)定, 這使得產(chǎn)毒擬柱孢的相對(duì)優(yōu)勢進(jìn)一步下降, 也降低了水體CYN超標(biāo)概率; (3)無機(jī)磷濃度的顯著升高及硝氮濃度的下降可能是導(dǎo)致熱帶水庫非產(chǎn)毒擬柱孢藻優(yōu)勢形成的主要原因; 水溫升高則使產(chǎn)毒擬柱孢藻比例增加。