苯扎貝特通過AKT/mTOR 通路抑制肺腺癌糖酵解機制研究

李智斌，葉錦霞，巫艷，王桂平

（廣州衛生職業技術學院，廣東 廣州 510450）

肺癌是我國以及全球范圍內發病率和病死率最高的惡性腫瘤之一，嚴重威脅人類健康和生命[1-2]，其中肺腺癌是主要肺癌病理類型，發病率約占肺癌的30%～50%。目前，臨床普遍采用外科治療、放射治療和化學治療等多學科綜合治療方法對肺癌進行治療，而對于腫瘤已經轉移不能進行手術切除的患者，化學治療仍是最主要的治療手段。當前，肺腺癌的治療藥物主要涉及鉑類、第三代細胞毒藥物（吉西他濱、紫杉醇、培美曲塞等）、EGFR-TK抑制劑、EGFR 單抗等[3]。然而，絕大多數肺癌患者的預后仍然十分不理想，總體5年生存率僅為10%～15%左右。

苯扎貝特（bezafibrate）是臨床常用的一種貝特類降脂藥。本團隊前期研究發現，苯扎貝特可有效抑制肺腺癌細胞生長。體外實驗發現苯扎貝特可有效抑制肺腺癌細胞生長，荷人肺腺癌細胞裸鼠體內實驗也顯示苯扎貝特可抑制移植瘤生長[4-5]。前期工作還證實了苯扎貝特或聯合順鉑可有效抑制HIF-1α的表達，從而抑制肺腺癌的生長[6]。而前期生物信息預測揭示，該藥可能通過調控PI3K/AKT/mTOR 信號通路，發揮抗肺腺癌作用。HIF-1α是PI3K/AKT/mTOR 下游重要因子，mTOR 活化后可上調HIF-1α表達，從而調控糖酵解過程。苯扎貝特可能是通過激動PPARα 受體通路，抑制PI3K/AKT/mTOR 途徑功能，逆轉肺腺癌瓦博格效應（Warburg effect），糾正腫瘤組織異常的物質代謝，發揮抗肺腺癌作用。目前關于苯扎貝特的抗腫瘤機制尚不清楚，本文通過細胞功能、代謝、蛋白水平，利用細胞活性檢測、WB 等技術觀察苯扎貝特對肺腺癌細胞的作用，探討該藥治療肺腺癌的分子機制，為發現新的肺腺癌治療藥物提供依據。

1 材料與辦法

1.1 細胞

人非小細胞肺癌細胞A549 株購自中國科學院細胞庫，解凍復蘇、重懸后接種在RPMI Medium1640培養基（含10%胎牛血清、100 U/mL 的青霉素和鏈霉素）中，置細胞培養箱進行培養，取對數生長期細胞進行實驗。

1.2 主要儀器與試劑

TD5K-Ⅱ臺式低速離心機（長沙東旺實驗儀器有限公司）；BDS400 倒置生物顯微鏡（奧特光學儀器有限責任公司）；SW-CJ-1FD 潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；3111 型CO2培養箱[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；液氮生物容器（四川亞西機器有限公司）；Multiskan FC 型酶標儀[賽默飛世界爾（上海）儀器有限公司]；BG-Power 600i 電泳儀（北京百晶生物技術有限公司）；JY92-IIN 超聲儀細胞破碎儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

苯扎貝特（質量分數≥98%）、二甲基亞砜（質量分數≥99%）[西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司]；RPMI Medium1640 培養基、DMEM 培養基、胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；葡萄糖（GLU）試劑盒、乳酸（LD）測試盒（南京建成生物工程研究所）；胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司）；磷酸酶抑制劑、BCA 法蛋白含量檢測試劑盒（南京凱基生物發展有限公司）；RIPA 裂解液、一抗稀釋液（碧云天生物）；AKT、mTOR 和PKM2 一抗（美國Proteintech Group）；GAPDH二抗（美國Proteintech Group）。

1.3 細胞毒性試驗

取對數生長期的A549細胞，用0.25%的胰蛋白酶消化成單細胞懸液，調整細胞濃度至4×104/mL，以100 μL/孔接種到96 孔培養板中，置于37 ℃、5%（φ）CO2的培養箱中培養24 h。設苯扎貝特組（25、50、100、200、400μmol/L）、陰性對照組（加入完全培養基）、空白對照組（不加入細胞），每組設5個復孔。分別于加藥48 h 和72 h 后，取出培養板，每孔加入CCK-8 溶液各10 μL，繼續培養1 h，在酶標儀450 nm處檢測各孔的吸光度值（A）。

1.4 葡萄糖含量測定試驗

按“1.3”細胞毒性實驗中的細胞分組，取經藥物作用72 h后的細胞懸液，1 000 r/min離心10 min后，棄上清液，留細胞沉淀，用等滲緩沖液清洗，1 000 r/min離心10 min，棄上清，留細胞沉淀；加入適量勻漿介質進行勻漿，冰水浴條件下超聲粉碎，按試劑盒操作順序加入相應試劑，用酶標儀測定各孔于波長340 nm 處的吸光度值；按試劑盒計算公式計算得到各樣品對應的葡萄糖含量[7]。

1.5 乳酸含量測定試驗

按“1.3”細胞毒性實驗中的細胞分組，取經藥物作用24 h 后的細胞液，稀釋后，按乳酸測試盒說明書配制酶工作液，并準備空白管（蒸餾水20μL+ 酶工作液1 mL + 顯色劑200 μL）、標準管（3 mmol/L標準品20μL+酶工作液1 mL+顯色劑200μL）和測定管（待測樣品20μL+酶工作液1 mL+顯色劑200 μL），混勻，37 ℃水浴準確反應10 min 后，每管加入終止液2 mL。在酶標儀530 nm 處檢測各孔的吸光度值，用空白管調零，測定各管的吸光度值。按試劑盒計算公式計算各管乳酸含量。

1.6 Western blot檢測蛋白表達

取對數生長期的A549細胞，用0.25%的胰蛋白酶消化成單細胞懸液，調整細胞濃度至4×104/mL，以100 μL/孔接種到96 孔培養板中，置于37 ℃、5%CO2的培養箱中培養24 h。加入苯扎貝特試液（100、200、400 μmol/L），對照組加入不含藥物的培養基，培養48 h。以PBS 洗滌2 次，每孔加入100 μL含1% PMSF（100 mmol/L）和1% Cocktail 的RIPA裂解液，于冰上裂解30 min；裂解完后于4 ℃下14 000 r/min 離心5 min，收集上清液；采用BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白質量濃度，于95 ℃煮沸10 min 進行蛋白變性。蛋白樣品經凝膠電泳分離，電轉至PVDF 膜。加入5% 脫脂奶粉溶液于室溫封閉2 h，TBST洗膜8 min，1次；分別加入AKT、mTOR和PKM2 抗體于4 ℃孵育過夜；TBST 洗滌3 次，加入Rabbit Anti-Mouse IgG（H+L）-HRP（1∶10 000），于室溫孵育50 min～3 h；TBST 洗滌3 次，按試劑盒說明書進行顯影曝光。采用Image J 軟件對蛋白灰度值進行分析。

1.7 統計學處理

2 結果

2.1 苯扎貝特對肺癌A549細胞的體外抑制作用

結果見表1。苯扎貝特對肺癌A549 細胞有明顯抑制作用，在相同時間組內，隨著苯扎貝特用藥濃度的升高，細胞抑制率也逐步增加，由此可得，苯扎貝特對A549 細胞的抑制作用隨濃度增大而增大，48 h 的IC50值為453.30 μmol/L，72 h 的IC50值為439.67 μmol/L；而在相同用藥劑量組內，72 h 給藥組較48 h 給藥組細胞抑制率稍高，但差異無統計學意義。

表1 苯扎貝特干預后A549細胞抑制率Table 1 Inhibition rate of A549 cells after bezafibrate intervention()%

表1 苯扎貝特干預后A549細胞抑制率Table 1 Inhibition rate of A549 cells after bezafibrate intervention()%

與0μmol/L比較：**P＜0.01。

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2.2 苯扎貝特對肺癌A549 細胞有氧糖酵解水平的影響

由表2結果可知，隨著苯扎貝特濃度增大，細胞中葡萄糖含量不斷增加，乳酸含量不斷降低。由于各孔為平衡孔，即細胞初始數量、葡萄糖初始含量及乳酸初始含量一致，該結果表明，在用藥過程中，隨著苯扎貝特濃度升高，細胞內葡萄糖的消耗量不斷減少，乳酸產量不斷降低。

表2 苯扎貝特干預后A549細胞葡萄糖含量及乳酸含量Table 2 Glucose and lactic acid content in A549 cells after bezafibrate intervention()c/(mmol·L?1)

表2 苯扎貝特干預后A549細胞葡萄糖含量及乳酸含量Table 2 Glucose and lactic acid content in A549 cells after bezafibrate intervention()c/(mmol·L?1)

與0μmol/L比較：**P＜0.01。

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2.3 苯扎貝特對肺癌A549細胞蛋白表達量的影響

結果如圖1 及表3 所示。結果表明，苯扎貝特干預A549 細胞48 h 后，隨著藥物濃度的升高，AKT、mTOR和PKM2的表達均有不同程度的降低，其中mTOR 蛋白下降較為明顯，且均呈現濃度依賴性。

表3 苯扎貝特干預后A549細胞相關蛋白表達量Table 3 Expression of related proteins in A549 cells after bezafibrate intervention

3 討論

項目組前期基于基因表達譜藥物發現途徑，篩選到多種肺腺癌候選治療藥物，并通過體內體外實驗證實一種PPARα 受體激動劑——苯扎貝特具有較好的抗肺腺癌作用[8]。本文細胞毒性實驗結果與前期研究結果一致，證明了苯扎貝特可抑制肺腺癌細胞增殖。

正常細胞在常氧條件下，主要是通過氧化磷酸化的方式產生ATP，提供自身所需的能量，而在腫瘤細胞中，即使是常氧條件下，腫瘤細胞仍然優先利用糖酵解途徑提供能量，其典型特點就是葡萄糖的攝取增加以及乳酸生成增加，這就是著名的瓦博格效應[9]。苯扎貝特抗腫瘤作用的確切機制仍不清楚，而代謝異常是腫瘤發生的重要原因，逆轉“瓦博格效應”的藥物開發是當前腫瘤研究的焦點[10-11]。本研究考察了使用不同濃度的苯扎貝特對A549 細胞糖酵解的影響，結果顯示，苯扎貝特對A549 細胞的葡萄糖攝取及乳酸生成有明顯的抑制作用，且抑制作用隨給藥濃度升高而增強，苯扎貝特具有一定的抑制A549 細胞有氧糖酵解的效應，提示肺腺癌A549 細胞凋亡機制可能與苯扎貝特下調糖酵解途徑，逆轉瓦博格效應有關。

多篇文獻報道AKT/mTOR 信號通路[12]及丙酮酸激酶M2（pyruvate kinase M2，PKM2）[13]與腫瘤細胞的糖酵解進程有關。本研究發現，苯扎貝特處理A549 細胞會降低AKT、mTOR 和PKM2 的蛋白表達。由此，本研究推測苯扎貝特可能通過調控AKT/mTOR 信號通路及PKM2，抑制A549 的糖酵解途徑，逆轉瓦博格效應，從而產生抗腫瘤作用，但其對肺腺癌細胞的抑制機制還有待進一步研究。