益經湯對環磷酰胺所致卵巢早衰小鼠的治療作用研究

牛逸琳，陳爍，陳雨詩，何冬梅，尹永芹

（1.廣東藥科大學，廣東 廣州 510006；2.惠州市中醫醫院，廣東 惠州 516001）

卵巢早衰（premature ovarian failure, POF）指女性40 歲前由于性激素水平紊亂而導致的卵巢功能障礙，臨床表現為月經稀發、閉經及潮熱、焦慮、抑郁等圍絕經期癥狀，常伴有促卵泡激素（follicle stimulating hormone,FSH）和促黃體生成素（luteinizing hormone，LH）水平升高，雌激素（estradiol, E2）水平降低[1]，是早發性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）的終末階段[2]。POF 的發病機制復雜，中醫認為其與腎虛、沖任虛衰有關，研究表明自身免疫性因素、遺傳、代謝、藥物和感染等均可導致本病發生[3]。現代醫學主要以激素代替療法進行治療，雖可改善患者臨床表現，但停藥后易復發且可能提高乳腺癌的發生率[4]。

益經湯出自《傅青主女科》，其藥物包括熟地黃、白術、山藥、當歸、白芍、酸棗仁、牡丹皮、北沙參、柴胡、杜仲、人參，主要治療“年未老經水斷”。傅氏認為：“經原非血也……出自腎中”，“女子年未七七而經水先斷者，人以為血枯經閉也，誰知是心肝脾之氣郁乎！”方中以熟地黃滋補腎陰，杜仲溫補肝腎，白術、山藥補脾益氣，人參大補元氣，當歸、白芍養肝活血，酸棗仁養心安神，柴胡疏肝解郁，北沙參養陰生津，牡丹皮清熱涼血。余卉嬌[5]使用益經湯對POF 患者進行治療，顯著改善月經周期，降低血清中FSH 及E2水平。陶莉莉等[6]發現卵泡細胞的過快凋亡導致卵巢功能減退，加減益經湯可增加卵巢Bcl-2 表達，減少Bax 表達，抑制卵泡細胞凋亡。萬云慧[7]發現使用加減益經湯治療后的POF 患者血清FSH、LH 水平明顯降低，竇狀卵泡數量增加。益經湯在調經促孕方面療效較好，臨床常用其加減方治療卵巢早衰等婦科疾病，但其發揮作用的機制尚不清楚。課題組前期通過網絡藥理學研究益經湯對POF 的作用通路主要為PI3K-AKT（PI3K-AKT signaling pathway）、癌癥中的蛋白多糖（proteoglycans in cancer）等。PI3K-AKT 信號通路參與細胞活化凋亡，調控卵泡的發育和閉鎖，同時FOXO3A 作為該通路下游轉錄因子之一，在細胞增殖、分化和凋亡中發揮重要作用。因此本文通過觀察益經湯對POF 小鼠治療作用及PI3K/AKT/FOXO3A 的影響，探討其治療POF的作用機制。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

SPF 級C57BL/6 小鼠40 只，5～6 周齡，雌性，體質量15～25 g，購自廣東省醫學實驗動物中心，生產許可證號：SCXK（粵）2022-0002。動物實驗操作經廣東藥科大學實驗動物倫理委員會批準（gdpu‐lacspf2022034）。

1.2 主要試劑耗材和儀器

注射用環磷酰胺（H2124176，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；戊酸雌二醇片（補佳樂，H20160679，拜爾醫藥保健有限公司廣州分公司）；蘇木素伊紅（HE）染液（G1120，北京索萊寶科技有限公司）；小鼠雌E2、FSH、LH、抗繆勒氏管激素（AMH）、孕酮（PROG）酶聯反應吸附試驗ELISA試劑盒（MM-0566M1、MM-0555M1、MM-44039M1、MM-44202M1、MM-0568M1，廣州研賽生物制品有限公司）；PI3K、AKT、FOXO3A 蛋白單克隆抗體（AF6241、AF6261、AF6020，Affinity Biosciences）。氯化鈉注射液（H22070710，廣東科倫藥業有限公司）；異氟烷（H20020267，魯南貝特制藥有限公司）；4%多聚甲醛通用型組織固定液（22291398，廣州碩譜生物科技有限公司）。

IMS-70 型全自動雪花制冰機（常熟市雪科電器有限公司）；BX51 型光學顯微鏡（日本Olympus 公司）；?80 ℃超低溫冰箱（青島海爾股份有限公司）；FA2104型電子天平（上海舜宇恒平科技儀器有限公司）；RM2016 病理切片機（上海徠卡儀器有限公司）；H1650-W 臺式微量高速離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）；DK-8D 型三孔電熱恒溫水槽（上海一恒科技有限公司）；Spectra MAX Plus384 型酶標儀（美谷分子儀器有限公司）。

2 方法

2.1 益經湯的制備

益經湯使用處方顆粒，由海東市平安正陽互聯網中醫醫院有限公司提供，全方與益經湯原方一致。生藥由熟地黃30 g、麩炒白術30 g、北柴胡3 g、鹽杜仲3 g、酒當歸15 g、麩炒山藥15 g、人參6 g、牡丹皮6 g、北沙參9 g、酸棗仁9 g、炒白芍9 g 組成，生藥量135 g，顆粒劑1劑36 g，1 g相當于生藥量3.75 g。將益經湯顆粒加蒸餾水調配成質量濃度為0.32 g/mL和0.96 g/mL的藥液，低溫儲藏備用。

2.2 POF模型構建及分組給藥

參考文獻[8]方法建立卵巢早衰模型，造模小鼠腹腔注射CTX 溶液。因CTX 具有自限性，采用首日腹腔注射60 mg/kg，2～15 日腹腔注射8 mg/kg，建立POF 小鼠模型，注射體積為10 mL/kg。空白組腹腔注射與模型組等量的生理鹽水，1 次/d，共15 d。注射結束24 h 后每日進行陰道涂片，移液槍吸取生理鹽水沖洗小鼠陰道2～3 次后進行涂片，自然風干進行HE 染色。觀察小鼠陰道涂片，若出現動情周期紊亂則視為造模成功[9]。

選取動情周期規律的小鼠，隨機抽取6 只作為空白組，其余小鼠造模成功后，采用隨機數字表法將小鼠隨機均分為4 組，分別為模型組、陽性對照組、益經湯低劑量組、益經湯高劑量組，每組6 只。根據體表面積比換算，以小鼠與人體藥物等效劑量倍數為12.33，分別計算各組給藥劑量。各組給藥方法如下：益經湯低、高劑量組分別以益經湯顆粒6.34、19.02 g/（kg·d）進行灌胃；陽性對照組以戊酸雌二醇片0.18 mg/（kg·d）灌胃；空白組和模型組給予蒸餾水灌胃。各組灌胃體積均為20 mL/kg，1 次/d，共30 d。

2.3 取材

益經湯干預30 d 后，各組小鼠均需禁食不禁水12 h，稱取小鼠體質量。用異氟烷進行麻醉，眼球取血法取血放置EP 管中，靜置分層后，在4 ℃下以3 000 r/min 離心10 min，提取血清置于?20 ℃冰箱保存備用。分別摘取雙側卵巢、腎臟及子宮，去除附著在表面的筋膜及脂肪等，精密稱重，部分組織放入4%（φ）多聚甲醛固定液中；其余組織?80 ℃冰箱冷凍保存。動物尸體進行無害化處理。

2.4 檢測體質量及臟器指數變化

實驗期間，每周觀察小鼠毛發、精神狀態及活動情況。小鼠造模及給藥期間每隔一天稱質量，實驗開始及實驗結束當天稱體質量，取各臟器稱重并計算臟器指數。根據各臟器濕質量，卵巢、子宮指數計算公式分別為：卵巢指數＝卵巢濕質量（g）／體質量（g）×100%；子宮指數＝子宮濕質量（g）／體質量（g）×100%。

2.5 觀察小鼠動情周期

在造模及給藥期間每日進行陰道脫落細胞檢查，移液槍吸取生理鹽水沖洗小鼠陰道2～3 次，將脫落細胞均勻涂抹在載玻片上，自然風干后，95%乙醇固定3 min，蘇木精染液染色5 min，沖洗后鹽酸乙醇分色數秒，自來水沖洗反藍5 min，伊紅染色2 min，沖洗后干燥，封片判斷動情周期，連續45 d。正常小鼠動情周期多為4～5 d，其余則視為動情周期紊亂。各組小鼠動情周期紊亂率=動情周期紊亂小鼠只數/各組小鼠總只數×100%。

2.6 HE染色法觀察小鼠卵巢、子宮組織變化

卵巢、子宮組織放置于4%多聚甲醛溶液中固定48 h 后，經過石蠟包埋后，切片，脫蠟，蘇木素染液浸泡10 min，純水清洗15 s，分化液5 s，純水清洗15 s 后放入純水浸泡5 min 返藍，伊紅染液浸泡3 min 后脫水，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察卵巢、子宮的組織學變化。

2.7 ELISA 法檢測血清E2、FSH、LH、AMH、PROG表達

通過ELISA 法檢測各組小鼠血清E2、FSH、LH、AMH、PROG 水平，根據試劑盒說明書操作，使用酶標儀在450 nm 波長下檢測吸光度（A），建立標準曲線，按曲線方程計算E2、FSH、LH、AMH、PROG濃度。

2.8 卵巢中PI3K、AKT、FOXO3A蛋白表達水平

取卵巢組織經梯度乙醇脫水固定、包埋切片等處理之后，采用免疫組織化學檢測蛋白表達水平：經過脫蠟，采用內源性過氧化物酶阻斷劑進行阻斷，抗原修復，洗滌后加入封閉液，室溫60 min；加入一抗4 ℃孵育過夜，洗滌后加入相應二抗37 ℃孵育30 min，洗滌后加入DAB 顯色劑顯色，蘇木素復染30 s 后封片，400 倍的顯微鏡下觀察拍照。用Image Pro Plus軟件分析。

2.9 統計學分析

使用SPSS 17.0 統計軟件進行統計分析，實驗數據以表示，使用t檢驗，采用單因素方差分析進行組間分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 動情周期變化

通過對陰道脫落細胞涂片分析小鼠造模情況。正常小鼠動情周期多為4～5 d，分為動情前期、動情期、動情后期和動情間期。若小鼠的動情周期表現為混亂無序、持續時間超過6 d，或長期停滯在某個時期，則認為小鼠出現動情周期紊亂，代表POF 模型構建成功，見圖1。實驗結束時，空白組小鼠表現出規律的動情周期；模型組有83.33%的小鼠動情周期紊亂，益經湯低、高劑量組分別有33.33% 和16.67%的小鼠動情周期紊亂，提示益經湯可以改善由CTX造成的動情周期紊亂。

3.2 益經湯對各組小鼠體質量以及卵巢、子宮指數的影響

體質量變化情況見表1。造模結束后，相較于空白組，模型組小鼠體質量顯著降低（P＜0.05）；相較于模型組，陽性組和益經湯高劑量組小鼠體質量明顯升高（P＜0.05）。益經湯低劑量組體質量也呈升高趨勢。

表1 各組小鼠體質量變化情況Table 1 Changes in body weight of mice in each group(,n=6)m/g

表1 各組小鼠體質量變化情況Table 1 Changes in body weight of mice in each group(,n=6)m/g

與空白組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05。

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卵巢指數如表2所示，與空白組比較，模型組的卵巢指數顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，益經湯高劑量組卵巢指數顯著性升高（P＜0.05），其余給藥組也呈現升高趨勢。

表2 各組小鼠卵巢、子宮指數比較Table 2 Comparison of ovarian and uterine indices among different groups of mice(,n=6)

表2 各組小鼠卵巢、子宮指數比較Table 2 Comparison of ovarian and uterine indices among different groups of mice(,n=6)

與空白組比較：**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01。

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子宮指數如表2所示，相較于空白組，模型組的子宮指數顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，陽性對照組和益經湯高劑量組子宮指數均顯著性升高，以陽性對照組最為顯著（P＜0.01）。

3.3 卵巢、子宮組織形態變化

HE 染色結果顯示，空白組小鼠卵巢形狀完整，可見較多不同發育階段卵泡，細胞間質及血管纖維較少。與空白組相比，模型組卵巢體積減小，可見少量次級卵泡，閉鎖卵泡增多，卵巢基質層結構紊亂，出現較大細胞間質和纖維化現象；與模型組相比，各給藥組卵巢體積增大，次級卵泡和初級卵泡數量較多，伴隨少量竇狀卵泡，卵巢基質層結構有所改善，細胞間質和纖維化現象減少，見圖2。

圖2 益經湯對各組小鼠卵巢組織病理形態的影響(HE,100×)Figure 2 Effect of Yijing decoction on the pathological morphology of ovarian tissue in mice of different groups(HE,100×)

空白組小鼠子宮結構完整，子宮腺上皮細胞形態正常，腺體分布密集，子宮肌層纖維排列緊密。與空白組比較，模型組小鼠子宮腺體明顯減少，結構不完整，腺體稀疏且排列不整齊；與模型組比較，各給藥組子宮內膜增厚，子宮腺上皮細胞排列較為整齊，腺體數量增加，見圖3。

3.4 血清性激素水平的影響

與空白組相比，模型組小鼠血清E2、AMH、PROG 水平顯著降低，FSH、LH 水平顯著性升高，差異具有統計學意義（P＜0.01）；與模型組相比，陽性對照組和益經湯低、高劑量組血清E2、AMH、PROG水平均升高（P＜0.05，P＜0.01），FSH、LH 水平顯著下降（P＜0.01）。結果見表3。

表3 益經湯對各組小鼠血清性激素水平的影響Table 3 Effect of Yijing decoction on serum sex hormone concentration in mice of different groups(,n=6)

表3 益經湯對各組小鼠血清性激素水平的影響Table 3 Effect of Yijing decoction on serum sex hormone concentration in mice of different groups(,n=6)

與空白組比較：**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01。

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3.5 益經湯對小鼠卵巢PI3K/AKT/ FOXO3A 通路蛋白表達水平的影響

通過免疫組化（IHC）對小鼠卵巢PI3K、AKT 和FOXO3A 表達進行檢測，并對吸光度（A）進行分析。與空白組相比，PI3K、AKT、FOXO3A 3 種蛋白在模型組表達皆顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，陽性對照組及益經湯低、高劑量組中蛋白表達均顯著降低（P＜0.01）。顯示陽性藥及益經湯對PI3K、AKT、FOXO3A 蛋白表達有抑制作用，結果見圖4－5。

圖4 各組小鼠卵巢PI3K、AKT、FOXO3A表達比較Figure 4 Comparison of ovarian PI3K,AKT,and FOXO3A expression in mice of different groups(,n=6)

圖5 IHC檢測卵巢PI3K、AKT、FOXO3A的表達Figure 5 IHC detection of ovarian PI3K，AKT，FOXO3A expression（200×）

4 討論

卵巢早衰發病機制復雜，臨床表現為持續性閉經、不孕和更年期綜合征等。隨著社會壓力不斷增大，卵巢早衰趨于年輕化，對于心血管系統、生殖系統、神經系統等均造成不同程度的危害。目前的臨床檢測手段主要包括內分泌激素測定、基礎卵巢體積、竇狀卵泡計數等[10]，治療則主要有雌孕激素補充治療、干細胞治療、卵巢移植、促排卵療法等。西醫治療方法產生的副作用不可忽視，中醫整體觀念、辨證論治的思想則具有明顯優勢。POF 臨床癥狀在中醫歸為月經過少、閉經、血枯、不孕癥等范圍，經典方益經湯重在心肝脾腎四經同治，強調“補以通之、散以開之”[11]，正如《傅青主女科》中所言：“散心肝脾之郁，而大補其腎水，仍大補其心肝脾之氣，則精溢而經水自通矣”，臨床已證實其功效。

李麗美等[12]通過構建卵巢儲備功能下降（DOR）大鼠模型研究加減益經湯對其影響，發現加減益經湯可以改善DOR 模型大鼠的性激素水平以及卵巢組織病理形態。DOR 會使血清中E2的水平下降，FSH、LH 水平明顯升高。E2主要由卵泡顆粒細胞分泌，可維持正常生殖功能，對于PROG合成亦存在促進作用，協同維持妊娠過程[13]；AMH 是糖蛋白家族中的一員，主要由卵巢竇前卵泡和小竇卵泡細胞分泌，通過調控起始和循環募集達到對卵巢儲備的影響，同時抑制卵泡的生長，與卵巢功能密切相關[14]。在卵泡生長發育過程中，LH可刺激卵泡內膜分泌睪酮，由FSH 刺激顆粒細胞對睪酮進行轉化為E2，二者協同作用可有效促進E2、PROG 的合成與釋放，同時受到E2、PROG 的負反饋調節[15]，反映卵巢功能。CTX 作為一種化療藥物，會使處于生殖期年輕患者的卵巢嚴重損傷，會導致卵巢顆粒細胞凋亡和大量卵泡停滯發育等，引起閉經、不育和POF。本實驗以CTX 所致POF 模型小鼠為對象，研究益經湯對其治療作用。實驗表明，小鼠造模后出現動情周期紊亂，卵巢及子宮指數明顯下降，組織形態也出現對應的變化，血清E2、AMH、PROG 水平表達降低，LH、FSH 水平表達上升，反映實驗造模成功。經藥物干預，與模型組相比，小鼠毛發光亮濃密，體質量有所上升，食欲和精神狀態均有改善；在卵巢組織切片中觀察到卵巢體積增大，次級和初級卵泡數量增多，細胞間質和纖維化現象減少，小鼠卵泡發育情況有所改善；子宮組織切片中，觀察到子宮內膜增厚，子宮腺上皮細胞排列變得整齊，腺體數量有所增加；血清激素水平結果顯示，陽性對照組和益經湯高劑量組血清E2、AMH、PROG 水平均升高，FSH、LH 水平顯著下降（P＜0.05，P＜0.01）。通過益經湯給藥治療，以上病理指標均有不同程度改善，結果表明益經湯在生活行為、卵泡發育和激素水平層面對CTX 誘導的POF 小鼠卵巢具有保護作用，根據子宮相關病理數據，提示益經湯在保護卵巢時可能對子宮也有一定影響。

PI3K/AKT 信號通路是調節自噬的經典傳導通路，可以調控卵巢顆粒細胞的增殖與分化、卵母細胞的減數分裂等，與卵泡發育和閉鎖有著密切的關系。FOXO3A是PI3K/AKT 通路下游重要轉錄因子之一，也參與了細胞的增殖、分化、凋亡以及衰老等。目前認為卵巢中多數原始卵泡都處于靜息休眠狀態，每個周期中只有極少數會被激活進入生長卵泡池，一旦過度激活進入生長卵泡池，會有大量生長卵泡發生異常閉鎖，導致DOR 的發生[16]，所以維持卵泡狀態的動態平衡尤為重要。本實驗結果顯示，模型組小鼠卵巢AKT、PI3K、FOXO3A蛋白表達顯著性升高，說明在CTX 作用下該通路被過度激活，卵泡發生異常閉鎖，導致卵巢早衰的發生。經過治療后，給藥組AKT、PI3K、FOXO3A蛋白表達較模型組顯著降低，差異具有統計學意義。

綜上所述，益經湯能夠有效改善POF 小鼠動情周期、卵巢與子宮指數和組織形態學變化，改善卵巢和子宮的功能，其機制可能與提高血清E2、AMH、PROG 和降低FSH、LH 的表達以及調控PI3K/AKT/FOXO3A 通路相關蛋白表達水平有關，達到維持正常卵巢儲備水平、預防卵巢早衰的作用。益經湯在治療卵巢方面的研究較多，應用于子宮較少，有待進一步探索。