掌葉大黃（Rheum palmatum L.）WRKY基因家族鑒定與分析

吳圳 張明英 閆鋒 李依民 高靜 顏永剛張崗

（1. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 陜西省秦嶺中草藥應(yīng)用開(kāi)發(fā)工程技術(shù)研究中心，西安 712046；2. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)省部共建特色秦藥資源研究開(kāi)發(fā)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室［培育］，咸陽(yáng) 712083；3. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)陜西省中醫(yī)藥管理局“秦藥”研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西安 712046）

大黃，別名將軍、黃良等，是我國(guó)傳統(tǒng)大宗中藥材，其功效為瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)、利濕退黃［1］，其3個(gè)基源分別為蓼科植物掌葉大黃（Rheum palmatum L.）、唐古特大黃（R.tanguticum Maxim.ex Bal）和藥用大黃（R. officinale Baill.），入藥部位為干燥根及根莖。掌葉大黃應(yīng)用歷史悠久，主要分布于甘肅東部及東南部、青海東部、四川西部及西北，多生于林緣、灌叢、草地［2］。大黃的主要生物活性成分是蒽醌類成分，研究發(fā)現(xiàn)其有抗腫瘤，抗炎，保護(hù)心血管等藥理作用［3］。

轉(zhuǎn)錄因子是可以與基因順式作用元件發(fā)生特異性相互作用，并激活或抑制基因轉(zhuǎn)錄的一種DNA結(jié)合蛋白。植物在高度可變的環(huán)境中，轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)調(diào)控下游靶基因表達(dá)直接或間接地參與調(diào)節(jié)植物對(duì)環(huán)境的生理適應(yīng)［4］。目前植物中發(fā)現(xiàn)了相當(dāng)多的轉(zhuǎn)錄因子家族，如MYB、bZIP、bHLH、WRKY。其中很多家族，如MYB、bHLH和WRKY，被證實(shí)參與了植物生長(zhǎng)發(fā)育和次生代謝的轉(zhuǎn)錄調(diào)控［5］。WRKY是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一。WRKY結(jié)構(gòu)由兩部分組成：N端包含一個(gè)保守的WRKYGQK基序，C端包含一個(gè)60氨基酸長(zhǎng)鋅指基序，二者對(duì)于WRKY轉(zhuǎn)錄因子與靶基因啟動(dòng)子的結(jié)合至關(guān)重要［6］。WRKY蛋白按其WRKY domain的數(shù)目及鋅指基因的種類可劃分為三類［7］。I族成員有兩個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域和C2H2型鋅指。II族成員只有一個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域和一個(gè)C2H2鋅指基序，根據(jù)其WRKY結(jié)構(gòu)域可進(jìn)一步分為5個(gè)亞組（IIa、IIb、Ic、IId和IIe）。III族成員有一個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域和一個(gè)C2HC型鋅指。

第一個(gè)WRKY基因SPF1于1994年在甘薯中被克隆［8］，自此之后WRKY家族被報(bào)道廣泛參與植物對(duì)非生物脅迫和激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。如SbWRKY30參與了高粱對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)［9］，過(guò)表達(dá)馬鞭草VbWRKY32基因轉(zhuǎn)基因植株耐寒性顯著增強(qiáng)［10］。在南非醉茄中鑒定的一個(gè)WsWRKY1，能通過(guò)調(diào)節(jié)烷基內(nèi)酯的積累而參與防御反應(yīng)［11］。WRKY基因家族還通過(guò)激素信號(hào)分子廣泛參與了植物種子萌發(fā)和生長(zhǎng)發(fā)育。研究表明，AtWRKY44和AtWRKY75在擬南芥中調(diào)節(jié)根毛的發(fā)育［12］。生長(zhǎng)素誘導(dǎo)AtWRKY23的表達(dá)從而調(diào)節(jié)植物根系的正常生長(zhǎng)和類黃酮的局部合成［13］。WRKY57作為MeJA誘導(dǎo)葉片衰老的抑制因子，參與了MeJA和生長(zhǎng)素介導(dǎo)的信號(hào)通路［14］。敲除了AtWRKY2的擬南芥突變體在種子萌發(fā)和萌發(fā)后早期生長(zhǎng)期間對(duì)ABA的反應(yīng)更敏感［15］。

在藥用植物中，WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與次生代謝產(chǎn)物的生物合成調(diào)控。CjWRKY1的異位表達(dá)可顯著增加小檗堿生物合成相關(guān)基因的表達(dá)水平［16］。PgWRKY4X與角鯊烯環(huán)氧化酶啟動(dòng)子中的W-box結(jié)合上調(diào)人參皂苷生物合成基因［17］。紅豆杉TcWRKY8/20/26/47調(diào)控紫杉醇的生物合成［18］。過(guò)表達(dá)IiWRKY34顯著提高菘藍(lán)中6種木脂素類化合物的含量［19］。鑒于WRKY在藥用植物次生代謝調(diào)控中的潛在作用，其有可能作為中藥材質(zhì)量控制的關(guān)鍵因子。本研究以掌葉大黃為對(duì)象，利用全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)結(jié)合RNA-seq挖掘WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族基因及其差異表達(dá)特征，為后續(xù)深入研究其在掌葉大黃生長(zhǎng)發(fā)育及蒽醌類成分代謝調(diào)控中的作用機(jī)制提供科學(xué)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 NanoDropTM2000分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo-fisher公司）; PacBio Seque III測(cè)序儀（美國(guó)PacBio公司）; StepOnePlusTMReal-Time PCR（qPCR）儀（美國(guó)Applied Biosystems公司）; K5800自動(dòng)檢測(cè)超微量分光光度計(jì)（凱奧公司）。

1.1.2 試劑 茉莉酸甲酯（methyl jasmonate, MeJA）;Trizol試劑盒（Life technologies公司）; SMARTer PCR cDNA Synthesis Kit（美國(guó)Clontech公司）;RN38-EASYspin Plus植物RNA提取試劑盒（北京艾德萊公司）; PrimeScriptTMRT Master Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒; TB Green? Premix ExTaqTMII（TliRNaseH Plus）（TaKaRa公司）。

1.1.3 植物材料 2022年8月在甘肅省隴南市甘肅中醫(yī)藥大學(xué)和政藥用植物園分別采集掌葉大黃（R.palmatum L.）一年生植株和成熟種子，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)胡本祥教授鑒定。

選擇外觀一致且飽滿的種子點(diǎn)播于黑色塑料花盆中（直徑9 cm、高12.5 cm）, 每盆點(diǎn)播4顆種子，每盆用200 g泥炭土（klasmann）。培養(yǎng)溫度為23±2℃，在9 000 Lx光強(qiáng)下光周期為16 h/8 h。第一次澆水至盆底有水排出即可，每隔3 d補(bǔ)水50 mL。

1月后，選取長(zhǎng)勢(shì)一致、生命旺盛的掌葉大黃幼苗3株，將其根、葉等量混合用于全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。同時(shí)，對(duì)1月齡幼苗葉片噴施200 μmol/L MeJA為處理組、噴施溶劑為模擬對(duì)照組，以0 h為空白對(duì)照，所有樣品重復(fù)3次，分別于處理后3、6、12和24 h取樣，液氮速凍后于-80℃冰箱保存。

取200 μmol/L MeJA處理12 h即MeJA-12 h、Mock-12 h 葉片樣本，3次生物學(xué)重復(fù)，送廣州基迪奧生物科技有限公司進(jìn)行 RNA-seq 分析；取一年生植株3株，根、根莖、葉3個(gè)部位各等量混合后進(jìn)行RNA-Seq分析。

1.2 方法

1.2.1 全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及WRKY鑒定 利用Trizol試劑盒提取總RNA，采用NanoDropTM 2000分光光度計(jì)檢測(cè)RNA樣品的濃度，檢測(cè)合格后的總RNA使用SMARTer PCR cDNA Synthesis Kit及PCR擴(kuò)增合成全長(zhǎng)cDNA并進(jìn)行SMRT bell文庫(kù)構(gòu)建。上機(jī)測(cè)序采用PacBio Seque III，所得到的原始數(shù)據(jù)用SMRT Link V8.0.0進(jìn)行分析。先提取高質(zhì)量的環(huán)形一致性序列（circular consensus sequencing, CCS），聚類FLNC reads，得到完整的isoform。通過(guò)BlastX（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）將isoform比對(duì)到蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)SwissProt（http://www.expasy.ch/sprot）、Nr（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）和KEGG（http://www.genome.jp/kegg）進(jìn)行功能注釋。

使用轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)plant TFdb（http://planttfdb.gao-lab.org/index.php）在蛋白序列中找到有已知轉(zhuǎn)錄因子的motif，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子家族歸類。挑選WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族基因，再次進(jìn)行BlastX比對(duì)，候選基因包含起始密碼子和終止密碼子的完整開(kāi)放閱讀框（open reading frame, ORF）利用ORFfinder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）在線網(wǎng)站進(jìn)行預(yù)測(cè)，使用標(biāo)準(zhǔn)密碼子翻譯表將其中最長(zhǎng)的ORF翻譯成全長(zhǎng)蛋白序列。用ExPASy（https://prosite.expasy.org/prosite.html）分析基因編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域，同時(shí)用CDD（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.2 蛋白序列分析 采用ExPASy ProtParam（http://cn.expasy.org/tools）和SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）在線網(wǎng)站進(jìn)行蛋白一級(jí)、二級(jí)結(jié)構(gòu)理化性質(zhì)分析。亞細(xì)胞定位使用WoLF PSORT（http://www.genscript.com/psort/wolf_psort.html）預(yù)測(cè)。

根據(jù)WRKY保守結(jié)構(gòu)域來(lái)分類RpWRKYs，該結(jié)構(gòu)域在Jalview軟件中進(jìn)行可視化分析。使用MEGA 11軟件中鄰接法（neighbor-joining, NJ）進(jìn)行RpWRKYs系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建分析，Bootstrap為1 000次，再利用itol在線網(wǎng)站進(jìn)行發(fā)育樹(shù)修飾和標(biāo)注。保守氨基酸基序的分析使用在線保守基序預(yù)測(cè)網(wǎng)站MEME（https://meme-suite.org/meme/tools/streme）完成。利用TBtools可視化分析RpWRKYs蛋白保守基序。

1.2.3 基因組織表達(dá)分析 基于RNA-Seq轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，篩選出RpWRKYs在掌葉大黃根、根莖和葉中的表達(dá)數(shù)據(jù)，以FPKM值表示豐度，經(jīng)log2標(biāo)準(zhǔn)化后運(yùn)用TBtools繪制RpWRKYs在不同組織中的相對(duì)表達(dá)量熱圖，分析其在不同組織部位的表達(dá)模式。

1.2.4 候選基因qPCR驗(yàn)證 參照RN38-EASYspin Plus植物RNA提取試劑盒提取掌葉大黃各樣品總RNA，1.0%瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)完整性，經(jīng)K5800自動(dòng)檢測(cè)超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度和純度合格之后用PrimeScriptTMRT Master Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)RpWRKYs在大黃不同樣品中基因表達(dá)，以β-actin為內(nèi)參基因。使用TB Green?Premix ExTaqTMII（TliRNaseH Plus）進(jìn)行qPCR。20 μL反應(yīng)體系：2×TB Green?Premix ExTaqTMII（TliRNaseH Plus）10 μL、forward/reverse primer各0.4 μL、cDNA模板1 μL、50×ROX Reference Dye 0.2 μL、ddH2O 7 μL。反應(yīng)程序：預(yù)變性95℃ 30 s；變性95℃ 5 s，退火60℃ 30 s，延伸60℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后于95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s條件下繪制熔解曲線。包括不加模板的對(duì)照在內(nèi)，所有qPCR反應(yīng)技術(shù)重復(fù)和實(shí)驗(yàn)重復(fù)各3次，應(yīng)用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 蒽醌合成關(guān)鍵酶基因與RpWRKYs蛋白相互作用分析 課題組前期根據(jù)二代轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)NR注釋結(jié)果篩選得到蒽醌類生物合成途徑的關(guān)鍵酶基因，并繪制蒽醌類生物合成代謝途徑［20］。蒽醌母核的生物合成主要涉及莽草酸（shikimic acid）和聚酮（polyketide）途徑，由于中間產(chǎn)物共用，甲基赤蘚糖醇（methylerythritol 4-phosphate, MEP）、甲羥戊酸（mevalonic acid, MVA）途徑也參與其中（圖1）。使用string 11.5（http://string-db.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)RpWRKYs蛋白與蒽醌類物質(zhì)合成關(guān)鍵酶基因的相互作用網(wǎng)絡(luò)，選定模式植物擬南芥為物種參數(shù)，去除不成簇和單個(gè)節(jié)點(diǎn)的蛋白得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖。

圖1 大黃蒽醌類生物合成途徑Fig. 1 Anthraquinone biosynthesis pathway in R. officinale Baill

2 結(jié)果

2.1 RpWRKYs序列分析

掌葉大黃全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組中有106條Isoform編碼WRKY蛋白，其中，包含完整ORF的Isoform有62個(gè)。整理ORF差異位點(diǎn)并合并重復(fù)，最終獲得53個(gè)全長(zhǎng)RpWRKYs，編號(hào)RpWRKY1-RpWRKY53（表1）。序列最長(zhǎng)的是RpWRKY1，由748個(gè)氨基酸編碼，最短的是RpWRKY53，由192個(gè)氨基酸編碼。

表1 掌葉大黃RpWRKY 轉(zhuǎn)錄因子的基本信息Table 1 Basic information of RpWRKY transcription factors in R. palmatum

蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，基因編碼蛋白的相對(duì)分子量在21.184（RpWRKY53）-80.746（RpWRKY1）kD之間，理論等電點(diǎn)介于5.40-9.92，包括37個(gè)堿性蛋白，16個(gè)酸性蛋白。所有RpWRKYs蛋白的平均親水性數(shù)值是負(fù)值，說(shuō)明其均為親水性蛋白；RpWRKY44/53的不穩(wěn)定系數(shù)＜40，推測(cè)其為穩(wěn)定蛋白，其余51個(gè)為不穩(wěn)定蛋白；脂肪系數(shù)為41.61-73.92，說(shuō)明RpWRKY轉(zhuǎn)錄因子基因編碼蛋白的熱穩(wěn)定性較好。

RpWRKYs家族蛋白均具有α螺旋、延伸鏈、β轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲，所占比例較大的是α螺旋和無(wú)規(guī)卷曲（所占比平均值分別為20.59%、64.56%），β-折疊和延伸鏈占比較小（所占比平均值分別為11.25%、3.57%），散布于整個(gè)蛋白中。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，53個(gè)RpWRKYs蛋白均定位于細(xì)胞核。

2.2 系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用MEGA11構(gòu)建掌葉大黃與擬南芥WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。圖2結(jié)果表明，53個(gè)RpWRKYs蛋白分為I、II、III 3個(gè)組，與擬南芥WRKY分類結(jié)果一致。I組的RpWRKY蛋白有16個(gè)，占30.18%，II組又分為II-a、II-b、II-c、II-d、II-e 5個(gè)亞組，含有RpWRKY家族成員31個(gè)，占58.49%，II-e（1個(gè)）和II-b（3個(gè)）兩亞組RpWRKY基因分布較少；其次是III組，含有6個(gè)RpWRKYs基因，占11.32%。

圖2 掌葉大黃和擬南芥中WRKYs成員的進(jìn)化樹(shù)Fig. 2 Evolutionary tree of WRKYs members in R. palmatum and Arabidopsis thaliana

2.3 保守基序分析

通過(guò)MEME在線工具對(duì)RpWRKYs分析，結(jié)果（圖3-A-B）表明，同組的RpWRKYs包含的保守元件數(shù)量和種類一致，而組間存在一定的差異性。53個(gè)RpWRKYs蛋白包含8個(gè)Motif保守基序，最短基序有29個(gè)氨基酸殘基，最長(zhǎng)的有50個(gè)氨基酸殘基。由圖3-C可知Motif1和Motif3為RpWRKYs蛋白的WRKYGQK七肽保守序列，Motif2和Motif5屬于鋅指結(jié)構(gòu)基序，RpWRKYs蛋白基序分布與基因分類結(jié)果一致。

圖3 RpWRKYs的進(jìn)化樹(shù)（A）、保守基序（B）和保守基序特征（C）Fig. 3 Evolution tree（A）, conserved motifs（B）and conserved motif signatures（C）of RpWRKYs

2.4 基因組織表達(dá)和響應(yīng)MeJA的表達(dá)分析

利用不同組織及MeJA組的RNA-seq數(shù)據(jù)分析掌葉大黃53個(gè)RpWRKYs基因的表達(dá)譜。結(jié)果顯示（圖4-A），同一基因在根、根莖、葉中表達(dá)差異較大，僅在根、根莖和葉中高表達(dá)的基因分別有21、11、10個(gè)。7個(gè)基因（RpWRKY5/12/25/28/30/42/47）在根和根莖中表達(dá)量均較高，葉中表達(dá)量最低。在MeJA處理下（圖4-B），53個(gè)RpWRKYs基因呈現(xiàn)差異表達(dá)，其中RpWRKY6/7/9/14/33/35/38/43/46/47被MeJA顯著誘導(dǎo)，RpWRKY5/18被顯著抑制。

圖4 掌葉大黃不同組織中RpWRKYs的表達(dá)模式（A）和MeJA處理下的響應(yīng)（B）Fig. 4 Expression patterns of RpWRKYs in different tissues of R. palmatum（A）and in response to MeJA treatment（B）

2.5 RpWRKYs表達(dá)模式分析

qPCR分析檢測(cè)RpWRKY5/6/9/33響應(yīng)MeJA處理的表達(dá)結(jié)果見(jiàn)圖5。以0 h（CK）為空白對(duì)照，結(jié)果顯示4個(gè)基因于MeJA處理12 h的表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)基本一致。RpWRKY5在MeJA激素處理下4個(gè)時(shí)間段表達(dá)量均下降，且在12 h下調(diào)最明顯，為Mock的0.09倍。RpWRKY6/9/33在12 h上調(diào)表達(dá)，分別為Mock的58.19、2.67、10.66倍，且RpWRKY6于12 h達(dá)峰值。

圖5 RpWRKY5/6/9/33在MeJA處理下的表達(dá)模式Fig. 5 Expression pattern of RpWRKY5/6/9/33 in response to MeJA treatment

2.6 RpWRKYs蛋白的相互作用分析

使用STRING 11.5在線軟件構(gòu)建53個(gè)RpWRKY蛋白與蒽醌類生物合成關(guān)鍵酶蛋白的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（圖6），模式植物設(shè)置為擬南芥，去除不成簇和單個(gè)節(jié)點(diǎn)的蛋白。結(jié)果顯示，共有19個(gè)RpWRKY蛋白相互作用，其中AtWRKY40（RpWRKY28/33/35/38/43/46）屬于網(wǎng)絡(luò)中的中心節(jié)點(diǎn)，其余6個(gè)AtWRKY均與AtWRKY40有相互作用。5個(gè)RpWRKYs蛋白（RpWRKY2/16/20/22/23）通過(guò)CHS與其他蒽醌合成途徑關(guān)鍵酶基因連接成簇。

圖6 RpWRKY蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig. 6 Protein interactions of protein RpWRKYs

3 討論

WRKY基因家族是調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)和次生代謝的最大轉(zhuǎn)錄因子家族之一，廣泛參與植物對(duì)生物、非生物和激素脅迫的響應(yīng)，以及植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程［21］。WRKY家族已經(jīng)在模式植物擬南芥［22］、經(jīng)濟(jì)作物大豆［23］、馬鈴薯［24］和許多藥用植物如人參、丹參、板藍(lán)根［25］中進(jìn)行了研究。本研究利用第三代測(cè)序技術(shù)分析了掌葉大黃的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組，從掌葉大黃中鑒定到53個(gè)RpWRKYs全長(zhǎng)基因，和黃連（41）［26］、馬藍(lán)（65）［27］及杜仲（51）［28］等藥用植物中WRKY基因數(shù)量差距不大。但相對(duì)于大豆、擬南芥和馬鈴薯基因組的188、72、79個(gè)基因［29］，掌葉大黃RpWRKYs基因數(shù)量較少，說(shuō)明在藥用植物中WRKY基因家族的數(shù)量相較于模式植物和經(jīng)濟(jì)作物來(lái)說(shuō)發(fā)現(xiàn)的較少，隨著未來(lái)掌葉大黃基因組測(cè)序的深入研究，將會(huì)鑒定出更多未發(fā)現(xiàn)的RpWRKYs基因，進(jìn)一步豐富大黃WRKY基因家族。

系統(tǒng)發(fā)育分析顯示RpWRKYs基因被分為3大組（I、II和III），與擬南芥WRKY基因家族［21］分組一致。其中，II-e（1個(gè)）和II-b（3個(gè)）組RpWRKYs分布較少。研究發(fā)現(xiàn)II-e組AT1G30650.1（WRKY14）基因?yàn)閿M南芥熱形態(tài)發(fā)生的抑制因子［30］，RpWRKY47與其聚為一個(gè)分支，說(shuō)明RpWRKY47可能在掌葉大黃溫度脅迫機(jī)制中起重要作用。

基因結(jié)構(gòu)決定基因功能，對(duì)RpWRKYs的結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)其均為熱穩(wěn)定性良好的親水性蛋白，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)RpWRKYs均定位在細(xì)胞核中，說(shuō)明RpWRKYs的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過(guò)程主要在細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行。相同或相似的基序是維系蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)功能的重要前提。對(duì)53個(gè)RpWRKYs蛋白的保守基序分析發(fā)現(xiàn)，組內(nèi)Motif分布基本一致，組間存在差異且Motif在不同組的分布符合WRKY家族分類的特征。Motif1和Motif2存在于所有RpWRKYs序列中，說(shuō)明這兩個(gè)基序高度保守，為WRKY的特征基序［31］。

RpWRKYs在掌葉大黃中有著明顯的組織表達(dá)特異性，僅在根中高表達(dá)的有21個(gè)，高表達(dá)基因數(shù)目明顯多于根莖（11）和葉（10），RpWRKY5/12/25/28/30/42/47等7個(gè)基因在根和根莖中表達(dá)量均較高，可能參與了掌葉大黃根及根莖的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。相較于RpWRKYs主要在根及根莖中有較高表達(dá)，馬藍(lán)中高表達(dá)WRKY則主要分布于根莖及葉片中，說(shuō)明WRKY在不同物種不同部位中的表達(dá)差異較大。Li等［32］檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PgWRKYs表達(dá)趨勢(shì)與桔梗皂苷含量變化一致，推測(cè)PgWRKYs可能調(diào)節(jié)桔梗皂苷的代謝。本課題組后續(xù)也會(huì)結(jié)合掌葉大黃全生育期活性成分含量變化及其與RpWRKYs表達(dá)量的關(guān)聯(lián)分析，進(jìn)一步明確可能參與大黃蒽醌類成分合成的關(guān)鍵WRKY基因。

MeJA參與了植物生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫反應(yīng)等多個(gè)生理過(guò)程，同時(shí)能夠調(diào)節(jié)植物的次生代謝［33］。為研究中藥活性成分生物合成途徑，通常在可控培養(yǎng)環(huán)境下，以MeJA等激素處理藥用植物，通過(guò)多組學(xué)分析，挖掘關(guān)鍵調(diào)控基因。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，外源MeJA處理可顯著誘導(dǎo)掌葉大黃蒽醌類成分積累，RNA-seq揭示MeJA信號(hào)通路、次生代謝通路、抗病防御通路均得到顯著富集，而我們關(guān)注的RpWRKYs基因家族成員呈現(xiàn)差異表達(dá)。10個(gè)RpWRKYs基因顯著誘導(dǎo)，只有RpWRKY5和RpWRKY18被MeJA抑制。掌葉大黃不同組織表達(dá)模式及其對(duì)MeJA的響應(yīng)表明，這些基因可能在掌葉大黃的生長(zhǎng)發(fā)育和次級(jí)代謝中發(fā)揮重要作用。本研究中RpWRKYs在MeJA處理下顯示出不同的響應(yīng)模式，RpWRKY6/9/33受MeJA顯著誘導(dǎo)，推測(cè)可能參與掌葉大黃對(duì)外界逆境的防御反應(yīng)。

蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)，有助于調(diào)節(jié)生物信號(hào)傳遞和相關(guān)基因表達(dá)。研究表明AtWRKY6和AtWRKY42相互作用，參與擬南芥對(duì)低Pi脅迫的響應(yīng)［34］。對(duì)于RpWRKY蛋白互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)分析表明，AtWRKY40（RpWRKY28/33/35/38/43/46）屬于網(wǎng)絡(luò)中的中心節(jié)點(diǎn)，可能在掌葉大黃生長(zhǎng)發(fā)育以及生物和非生物脅迫等應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮重要作用。CHS基因是聚酮代謝途徑的關(guān)鍵基因，在蒽醌類物質(zhì)合成中扮演著重要的角色，如決明CHS-L9參與蒽醌類物質(zhì)的生物合成［35］。蛋白互作預(yù)測(cè)AtWRKY44（RpWRKY2/16/20/22/23）與CHS關(guān)系密切，推測(cè)RpWRKY2/16/20/22/23可能參與了掌葉大黃蒽醌類物質(zhì)的生物合成過(guò)程。綜上所述，本研究為進(jìn)一步研究WRKY轉(zhuǎn)錄因子在大黃次生代謝調(diào)控及藥材品質(zhì)形成過(guò)程中作用機(jī)制提供依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究鑒定了掌葉大黃53個(gè)WRKY基因，并對(duì)其進(jìn)行理化性質(zhì)、遺傳進(jìn)化和表達(dá)模式分析，探究了不同RpWRKY對(duì)MeJA的響應(yīng)模式以及RpWRKY的組織表達(dá)特異性。研究結(jié)果顯示W(wǎng)RKY家族基因在掌葉大黃根及根莖中表達(dá)量較高，RpWRKY在不同時(shí)間MeJA處理下有著不同的響應(yīng)模式。蛋白互作結(jié)果表明有5個(gè)RpWRKY基因可能與大黃中蒽醌類物質(zhì)的合成有關(guān)。