定點飽和突變提高赭曲霉11α羥化酶的催化性能

史京輝 陳文慧 陸坤 鄭婷婷 任志遠 鮑國慶 王敏 駱健美

（工業發酵微生物教育部重點實驗室（天津科技大學），天津市工業微生物重點實驗室 天津市微生物代謝與發酵過程控制技術工程中心，天津科技大學生物工程學院，天津 300457）

11α,17α-雙羥基黃體酮（11α,17α-dihydroxy progesterone）俗稱脫溴物，是許多重要甾體藥物合成過程中的中間體［1］，如潑尼松龍、醋酸潑尼松龍、可的松、氫化可的松等［2］。這些藥物具有提高免疫力、抗炎、抗凝血等作用［3-6］。與化學合成法相比，微生物轉化法不僅具有合成步驟少、生產周期短、副產物少、反應條件溫和、環境友好等特點，而且具有高度的立體選擇性和區域選擇性，能對甾體藥物母核上化學合成法難以或無法實現的位點引入特定官能團［7-10］。2022年，天津科技大學駱健美團隊［11］考察了不同微生物對17α-羥基黃體酮轉化生成11α，17α-雙羥基黃體酮能力的影響，結果表明赭曲霉（Aspergillus ochraceus）、雅致小克銀漢霉（Cunningpamycetes elegans）、藍色犁頭霉（Absidia coerulea）、球孢白僵菌（Beauveria bassiana）、金龜子綠僵菌（Metarhizium anisopliae）和黑曲霉（Aspergillus niger）均具有良好的轉化能力，其中，赭曲霉的轉化效果最好。

甾體11α羥化酶（11α-hydroxylase）屬于細胞色素P450酶（CYP）超家族［12-13］，主要包括胞質結構域、跨膜結構域和輔基血紅素（heme）。其中，heme堆疊在I和L螺旋之間，位于相對較大的口袋中，通過與近端半胱氨酸殘基結合的硫醇鐵（Fe-thiolate）的配位結合連接到蛋白質骨架上，周圍有疏水性氨基酸殘基以容納疏水性底物［14］。近年來，研究者將不同來源11α羥化酶基因在大腸桿菌（Escherichia coli）［15］、恥垢分枝桿菌（Mycolicibacterium smegmatis）［16］、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）［17］和畢赤酵母（Pichia pastoris）［18］中異源表達并進行功能驗證，但關于羥化酶關鍵氨基酸位點及其分子改造的報道較少。

大量研究表明，關鍵氨基酸位點對甾體羥化酶的選擇性和活性產生顯著的影響。2022年，天津科技大學劉曉光團隊［19］通過敲除實驗證明，赭曲霉CICC 41473的11α羥化酶CYP68J5是負責催化黃體酮和左旋乙基甾烯二酮發生11α羥化反應的關鍵酶。之后，基于CYP68J5與睡蓮炭疽病菌（Colletotrichum nymphaeae）和西蒙氏炭疽病菌（Colletotrichum simmondsii）來源的CYP的序列一致性比對（分別為52.01%和50.91%），對3個氨基酸保守位點V64、E65和N66進行定點飽和突變。結果表明，突變體V64K對黃體酮的11α羥基化選擇性達高達90.6%，而對左旋乙基甾烯二酮的11α羥基化選擇性幾乎完全喪失，說明CYP68J5的V64位點在兩種底物的11α羥基化反應選擇性上發揮著完全不同的作用［20］。2023年，沈陽藥科大學田威團隊［21］通過分子對接，確定了球黑孢霉（Nigrospora sphaerica）羥化酶CYP-N2中與底物結合的關鍵氨基酸位點分別為F120、A124、T128、S140、V312和T316，對其進行丙氨酸掃描發現，突變體T316A對甲地孕酮、黃體酮、可的松和去氫表雄酮幾乎沒有活性，說明T316位點是CYP-N2催化4種底物的關鍵位點。而突變體T128A對甲地孕酮和可的松的活性分別提升了19.3%和10.4%，對去氫表雄酮的活性幾乎不變，對黃體酮的活性降低了15.1%，突變體F120A、S140A和V312A對上述4種底物的活性均有不同程度的改變。這些結果說明，對于CYP-N2，同一個位點對不同底物表現出不同的活性。

課題組前期通過結構預測、分子對接以及丙氨酸掃描等手段，確定了赭曲霉CICC 41473的11α羥化酶CYP68J5的關鍵氨基酸位點為D118、F216、M488［11］。本研究在此基礎上對3個關鍵位點進行定點飽和突變，篩選出催化性能優良的突變體，并通過分子對接和分子動力學模擬闡明其活性提高的分子機制。研究結果對羥化酶CYP68J5的遺傳改造和11α,17α-雙羥基黃體酮的生產具有重要的理論意義和應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質粒 菌株：赭曲霉CICC 41473、大腸桿菌DH5α、釀酒酵母INVSc1。質粒：pYES2-cyp68j5。以上材料均由實驗室自主保藏。

1.1.2 培養基 LB培養基（g/L）：胰蛋白胨10，酵母提取物5，氯化鈉10，pH 7.5，ddH2O定容至1 L。固體培養基加入瓊脂粉20。YEPD培養基（g/L）：蛋白胨20，酵母提取物10，ddH2O定容至900 mL。121℃，20 min滅菌后補加20%葡萄糖100 mL，固體培養基加入瓊脂粉20。Ura營養缺陷型培養基（g/L）：YNB 6.7，加入ddH2O定容至900 mL。121℃，20 min滅菌后補加20%葡萄糖100 mL、DO Supplement-Ura 1.29，固體培養基加入瓊脂粉20。

1.1.3 主要實驗材料 本實驗所用引物（表1），蘇州金唯智生物科技有限公司。DNA瓊脂糖凝膠回試劑盒、細菌質粒提取試劑盒、酵母質粒提取試劑盒，天根（北京）生化科技有限公司。核酸限制性內切酶、T4連接酶，大連TaKaRa公司。KOD-Plus-Neo突變試劑盒，東洋紡（上海）生物科技有限公司。17α-羥基黃體酮、11α，17α-雙羥基黃體酮，天津市津津藥業有限公司（中國）。一次性無菌接種環，湖南比曼克生物科技有限公司。

表1 飽和突變的PCR引物Table 1 PCR primers for the saturated mutation

1.1.4 主要儀器設備 PCR基因擴增儀、小型臺式高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司。電泳儀，北京市六一儀器廠。紫外可見分光光度計，島津儀器（蘇州）有限公司。電熱恒溫水浴桶，河北黃華市航空儀器廠。Agilent高效液相色譜儀，美國Agilent公司。

1.2 方法

1.2.1 釀酒酵母的培養 單菌落培養：用一次性無菌接種環從YEPD平板上長出的單菌落上挑取少量菌體，將其在新的YEPD固體平板上均勻涂成約1 cm2的方塊（patch），30℃恒溫培養箱倒置培養1-2 d，觀察方塊范圍內涂抹的菌體生長情況。過夜培養：用一次性無菌接種環從任意一個目的patch上挑取大頭針頭大小的菌體，將其接種在裝有5 mL的YEPD液體培養基的試管中，在30℃恒溫搖床中220 r/min培養12-16 h。

1.2.2 羥化酶CYP68J5的飽和突變

1.2.2.1 重組質粒的構建 以課題組前期構建的pYES2-cyp68j5質粒為模板，采用反向PCR進行擴增。采用簡并密碼子NNK設計簡并引物，如表1所示。所有引物均由金唯智生物技術服務公司合成并使用tPAGE純化方式純化。

反向PCR擴增條件：94℃ 2 min，98℃ 10 s，Tm-5℃ 30 s，68℃ 7.4 min，共20個循環，4℃保溫。

PCR產物用Dpn I限制性內切酶在37℃下酶切4 h以去除未突變的模板質粒，參考KOD-Plus突變試劑盒說明書，使用T4多聚核苷酸激酶和連接酶對酶切產物進行自身環化連接反應（16℃，16 h）。連接后的質粒轉入大腸桿菌DH5α感受態細胞，復蘇后的菌液均勻涂布于含有氨芐青霉素的LB固體培養基上，37℃過夜培養，挑選轉化子進行菌落PCR驗證，驗證正確的陽性轉化子提取質粒送樣測序，將突變正確的質粒保存并進行后續實驗。

1.2.2.2 重組菌株的構建 將驗證正確的重組質粒通過醋酸鋰法導入釀酒酵母感受態細胞，具體構建過程參照Invitrogen公司操作手冊。

1.2.3 底物轉化實驗 用一次性無菌接種環從做patch的YEPD平板上刮取一環菌體至裝有50 mL YEPD液體培養基的250 mL三角瓶中，在30℃，200 r/min條件下振蕩培養24 h后分別加入0.5 g/L和2.0 g/L的底物17α-羥基黃體酮（甲醇助溶，底物∶甲醇=1∶20（mg∶μL）），并投加3.75 mL濃度為20%半乳糖溶液進行誘導（終濃度為1.5%），每24 h補加1次。在30℃，220 r/min條件下轉化84 h，每12 h取樣檢測。取樣時，將1.0 mL的發酵液加至2 mL離心管中，加入1.0 mL乙酸乙酯終止轉化反應。用超聲清洗儀超聲萃取20 min，吸取萃取后的上層溶液200 μL于1.5 mL離心管中，13 000 r/min離心10 min后的上清液用于后續定量檢測。

1.2.4 甾體化合物的檢測

1.2.4.1 薄層色譜法（TLC） 使用移液槍將上清液點在薄層硅膠GF254板上，點樣量為2 μL，點樣的直徑不能大于2 mm，點樣樣品間隔至少為0.6 cm，樣點與硅膠板邊沿間隔至少1 cm；再將硅膠板樣品放到盛有展開劑的層析缸中進行層析，展開劑的配比為：正己烷∶丙酮∶乙酸乙酯=1.4∶1∶0.5（V/V/V）。待溶劑前沿與硅膠薄板上邊緣的距離約為1 cm時層析完畢，取出硅膠板揮干。最后將硅膠板放在254 nm紫外燈下觀察斑點。

1.2.4.2 高效液相色譜法（HPLC） 吸取200 μL上清液于離心管中，放在通風櫥中自然揮干，然后加入1 mL流動相進行復溶［22］。超聲清洗儀超聲20 min，13 000 r/min離心10 min后取上清液300 μL用于HPLC檢測。具體條件為：Agela C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為甲醇∶水=80∶20（V/V），流速為1 mL/min。檢測波長為254 nm。柱溫為35℃。通過比較標準品和樣品中底物和目標產物的保留時間和峰面積進行定性和定量分析，根據標準曲線，利用峰面積計算樣品中底物和產物的濃度。

生產強度是指一定時間內單位發酵罐容積所產生的產物量。根據HPLC檢測結果，按照公式（式1和式2）計算摩爾產率和生產強度。

1.2.5 分子對接和分子動力學模擬

使用AlphaFold 2對CYP68J5進行結構預測，ChemDraw軟件畫出底物17α-羥基黃體酮的結構式，通過AutoDock Tools軟件（http://autodock.scripps.edu/resources/adt）對CYP68J5及其突變體與底物17α-羥基黃體酮進行分子對接。結合PyMOL（https://www.pymol.org）生成詳細的蛋白質結構圖。采用GROMACS 5.0.2軟件和AMBE99SB力場進行分子動力學模擬（molecular dynamic simulation，MD）。具體方法如下：將底物17α-羥基黃體酮與羥化酶CYP68J5和最優突變體的復合物分別放入一個10 nm3的立方體盒子中，采用TIP3P水模型，設置溶質-盒子的距離為10 ?，為了平衡系統中的電荷，一部分水分子被相同數量的負離子（Cl-）和正離子（Na+）取代，根據pH 7.0設置殘基的質子化狀態，使用最速下降算法執行10 000步的能量最小化步驟，通過指定模擬系統中每個原子的初始速度不同，在溫度（300 K）和大氣壓（1.01 bar）等參數下進行50 ns的分子動力學模擬，基于GROMACS的MM/PBSA算法對分子動力學模擬軌跡，按照公式（式3）［23］計算結合自由能，并進行能量拆解分析。

2 結果

2.1 優良突變體的篩選

課題組前期借助結構預測、分子對接和丙氨酸掃描等手段確定了CYP68J5的3個關鍵氨基酸位點分別是第118位的天冬氨酸、第216位的苯丙氨酸和第488位的甲硫氨酸（圖1）。因此，本文選擇上述3個位點進行定點飽和突變。

圖1 CYP68J5與底物對接結構中D118V、F216和M488三個位點的分布情況Fig. 1 Distribution of the D118V, F216 and M488 in the docking structure of CYP68J5 with substrate

通過定點飽和突變共獲得54個CYP68J5的突變體。通過底物轉化實驗，考察不同突變體對17α-羥基黃體酮的轉化性能，由TLC結果可知，突變體D118V的轉化性能最好，M488W次之，而突變體F216W、M488L的轉化能力較弱，其余突變體的轉化性能顯著降低甚至完全喪失（圖2）。

對上述4個突變體D118V、F216W、M488L和M488W的轉化液進行HPLC分析。如圖3-A所示，底物濃度為0.5 g/L時，CYP68J5的產物濃度在72 h達到最大值，為434.50 mg/L。而突變體D118V的產物濃度在24 h達到最大值，為452.56 mg/L。該水平較野生型CYP68J5有所提升，且達到的時間縮短了66.70%。如圖3-B可知，突變體D118V的生產強度為431.66 mg/（L·d），較野生型CYP68J5（138.15 mg/（L·d））提高了2.12倍。而其他3個突變體M488W、F216W和M488L的產物濃度和生長強度均低于野生型CYP68J5。

圖3 表達CYP68J5及其突變體D118V、F216W、M488L和M488W的釀酒酵母在0.5 g/L底物濃度（A, B）和2.0 g/L底物濃度（C, D）的產物生成曲線和生產強度Fig. 3 S. cerevisiae expressing CYP68J5 and its mutants D118V, F216W, M488L, and M488W at 0.5 g/L substrate concentration product formation curves and production intensities（A, B）and 2.0 g/L substrate concentration（C, D）

對于在底物濃度為0.5 g/L時轉化性能最優的突變體，進一步探究其在底物濃度為2.0 g/L時的轉化性能。如圖3-C所示，底物濃度的增加使產物達到峰值的時間往后推遲了12 h，但產物的最大生成量提高了1.63倍。其中，突變體D118V產物濃度在36 h達到最大值，為1.19 g/L，而野生型CYP68J5的產物濃度在84 h達到最大值，為1.02 g/L。突變體D118V的生產強度（758.15 mg/（L·d））比野生型CYP68J5（277.94 mg/（L·d））提高了1.72倍（圖3-D）。

2.2 CYP68J5及突變體與底物的分子對接分析

使用AutoDock對CYP68J5及突變體D118V、F216W、M488L和M488W與底物進行分子對接，并通過Discovery Studio軟件展示了分子對接獲得的復合物的分子間相互作用力。

如圖4所示，CYP68J5和最優突變體D118V的V304位點與底物之間具有C-H鍵，R223位點和heme與底物之間形成氫鍵，W89、F111、L368和heme與底物之間具有疏水作用力。但值得注意的是，D118V還存在V118與底物之間的疏水作用，這是由于第118位的極性的天冬氨酸突變為非極性的疏水性纈氨酸，使得底物結合口袋的整體疏水作用增強，可以更好地結合和穩定疏水性的底物，導致酶的催化性能顯著提高。

圖4 使用Discovery Studio繪制的CYP68J5及其突變體D118V、F216W、M488L和M488W殘基和血紅素（heme）與底物的分子間相互作用2D圖Fig. 4 2D plot of the intermolecular interactions of CYP68J5 and its the mutant D118V, F216W, M488L,and M488W residues and heme with substrates using Discovery Studio

與CYP68J5相比，突變體M488W和M488L的活性下降，這可能是因為二者只存在heme與底物之間的疏水作用，而heme與底物之間的氫鍵作用力消失。突變體M488L的V304位點與底物之間沒有形成C-H鍵，這可能是其催化性能更低的主要原因。相較于CYP68J5和其他突變體，突變體F216W的heme與底物之間沒有任何作用力，且V304位點與底物之間也沒有形成C-H鍵，推測這些分子間作用力的消失是F216W轉化性能最低的主要原因。

綜上所述，V118位點與底物之間形成新的疏水作用力，導致了酶的底物結合口袋的整體疏水性增強，有利于底物的結合，是該突變體催化性能提升的主要原因。對于突變體M488W、M488L和F216W，分子間相互作用力的減少（如heme與底物之間的氫鍵和疏水作用力；V304位點與底物之間的C-H鍵）是酶催化性能降低的主要原因。

2.3 CYP68J5及突變體D118V的分子動力學模擬分析

對CYP68J5和優良突變體D118V分別進行分子動力學模擬，進一步分析催化性能提高的原因。均方根偏差（root-mean-square deviation，RMSD）是蛋白質構象與原始結構之間的平均偏差，RMSD值越低，說明MD模擬過程中，蛋白結構越穩定。由圖5-A可知，CYP68J5的RMSD在10 ns后基本趨于穩定，而突變體D118V的RMSD在15 ns后基本趨于穩定，二者的平均值分別為(0.74±0.02) nm和(0.60±0.01) nm。這說明D118突變為V118后，殘基的改變使整個11α羥化酶結構更加穩定。均方根波動（root-mean-square fluctuation，RMSF）可以反映模擬過程中每個殘基的波動情況，表征蛋白質的剛性和柔性，RMSF值越高，說明殘基的波動情況越大，蛋白質的柔性越強。如圖5-B所示，CYP68J5和突變體D118V的RMSF平均值分別為(0.27±0.01)nm和(0.18±0.01) nm，突變體D118V大部分殘基的RMSF值低于CYP68J5，表明突變體D118V整體區域的剛性增強，這與RMSD的結果是一致的。其中，氨基酸99-103（α螺旋）、115-118（α螺旋）、119-127（loop區）和251-264（α螺旋）等多處位置表現出更低的RMSF值，這種變化有利于酶和底物的穩定結合，降低底物“脫靶”的敏感性。回轉半徑（radius of gyration，Rg）反映分子中心與原子質量的關系，表征蛋白質結構的緊密性，Rg值越小說明蛋白結構越緊密，反之結構越疏松。如圖5-C所示，CYP68J5和D118V的Rg平均值分別為（2.60±0.01）nm和（2.47±0.01）nm，這表明D118突變為V118后，11α羥化酶整體構象更穩定，這與RMSD和RMSF的結果是一致的。溶劑可及表面積（solvent-accessible surface area，SASA）是溶劑可接觸的分子表面積，是描述蛋白質疏水性的重要參數，蛋白質折疊后SASA值變小，疏水作用增強。如圖5-D所示，CYP68J5和突變體D118V在MD模擬過程中的SASA平均值分別為（267.02±2.95）nm2和（256.51±2.27）nm2，且在整個模擬過程中，D118V的SASA值始終小于CYP68J5，這說明D118V比CYP68J5的疏水性更強，這與分子對接時發現突變后產生了新的疏水作用是一致的。氫鍵對于維持蛋白質的穩定具有重要作用，如圖5-E所示，突變體D118V氫鍵存在概率明顯大于CYP68J5。結合自由能（binding free energy）反映蛋白質的能量，能量越低，蛋白質越穩定。采用MM/PBSA方法對分子動力學模擬軌跡進行結合自由能計算。如圖5-F所示，突變體D118V的結合自由能（-24.42±1.18 kcal/mol）低于CYP68J5（-19.81±1.22 kcal/mol），說明突變體D118V和底物形成的復合物的結構更穩定。其中，范德華力、靜電作用和非極性溶劑化自由能可以促進酶和底物結合，極性溶劑化自由能對其具有抑制作用，范德華力、靜電作用和非極性溶劑化的總自由能可以抵消極性溶劑化自由能的不利影響，從而維持這些酶與底物的穩定結合。

圖5 CYP68J5和優良突變體D118V的分子動力學模擬Fig. 5 Molecular dynamics simulations of CYP68J5 and its elite mutant D118V

綜上所述，與野生型CYP68J5相比，突變體D118V的RMSD、RMSF和Rg值更低，氫鍵存在的概率增大，說明11α羥化酶結構更加穩定，整體結構的剛性增強，構象更加穩定，SASA值降低，說明突變體的疏水性增強，結合自由能降低，說明突變體與底物形成的復合物結構更穩定，這些變化是酶的催化性能顯著提升的重要原因。

3 討論

目前常見酶的改造方法有定點突變（包括飽和突變）和隨機突變。其中，基于關鍵氨基酸位點的定點飽和突變技術，可通過高質量突變體文庫的構建獲得優良的突變體。相比于易錯率高和突變位點不可控的隨機突變，具有成本低、效率高等優點［24-25］。2020年，南京工業大學陳可泉團隊［26］對赤紅球菌（Rhodococcus ruber）來源的羥化酶CYP116B3的關鍵氨基酸位點E88、N199和Q209進行定點飽和突變，篩選得到的優良突變體E88C、N199Q和Q209A，三者轉化萘生成α-萘酚的產量比野生型分別提高了2.0、13.0和3.7倍。

本文針對課題組前期鑒定的3個關鍵氨基酸位點進行了定點飽和突變，結果表明，118位點極性的親水性天冬氨酸突變為非極性的疏水性纈氨酸后，酶的催化性能顯著提升；216位點非極性的疏水性苯丙氨酸突變為非極性的疏水性色氨酸后，酶的催化性能顯著降低；488位點非極性的疏水性甲硫氨酸突變為非極性的疏水性色氨酸和異亮氨酸后，酶的催化性能發生不同程度的降低。而上述3個位點突變成極性氨基酸、酸性氨基酸和堿性氨基酸后，突變體的催化性能幾乎完全喪失。說明3個位點上非極性的疏水性氨基酸（纈氨酸、色氨酸和亮氨酸）對于酶的催化活性非常重要。

值得注意的是，隨著轉化時間的延長，表達CYP68J5及其突變體的釀酒酵母工程菌株轉化底物生成目標產物的濃度逐漸下降，推測可能是目標產物逐漸轉化為副產物或者分解。類似地，表達藍色犁頭霉（Absidia coerulea）來源的11β羥化酶CYP5311B2的釀酒酵母工程菌株，催化11-脫氧皮質醇發生11β-羥化反應的過程中，除了目標產物氫化可的松之外，還會產生11β-和11α-羥基化衍生物的立體異構體混合物，其比例達到20%［27］。

分子對接結果表明，D118V突變之后，疏水性的纈氨酸與底物之間產生疏水作用力，導致酶催化性能顯著提升。而突變體M488W、M488L和F216W的催化性能有不同程度的降低，原因可能是heme與底物之間的氫鍵、疏水作用力和V304位點與底物之間的C-H鍵等分子間相互作用力減少。類似的，古生菌酸熱硫化葉菌（Sulfolobus acidocaldarius）來源的羥化酶CYP119進行改造發現，5個突變體由于缺少了heme和T257之間的氫鍵，導致酶的活性顯著降低［28］。

與野生型相比，突變體D118V的115-118（α螺旋）和119-127（loop區）區域的剛性顯著提升，蛋白質整體結構剛性增強，穩定性提高，即纈氨酸可以降低主鏈的結合熵，導致酶的催化性能提升。2023年，浙江大學的王健波團隊［29］將巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）來源的羥化酶P450-BM3位于底物入口通道的D68位點進行定點飽和突變，當極性的天冬氨酸突變為非極性的疏水性纈氨酸后，底物入口通道的寬度由2.6 ?增大為5.3 ?，減小了底物進入的空間位阻，從而顯著提升了酶的催化性能顯著提升。2020年，天津科技大學秦慧明團隊［30］對賴氨酸羥化酶進行改造，獲得的優良突變體MT3催化性能顯著提升（kcat/Km值較WT提高了24.97倍），通過MD模擬發現，突變后的蛋白構象更為開放，在相同的模擬時間內，底物可以更深入到結合口袋中。因此，我們推測，本文獲得的優良突變體D118V催化性能提升也與突變后纈氨酸側鏈位阻較小，與底物能更深入酶的催化口袋有關。但是課題組前期研究［11］發現，突變體D118A不能轉化生成11α，17α-雙羥基黃體酮，這可能是突變后的丙氨酸的位阻更小，底物結合口袋過大，不能很好地與底物結合，造成了底物的“脫靶”現象，這些結果說明合適尺寸的底物結合口袋對酶的催化性能具有重要作用。

4 結論

通過對赭曲霉的羥化酶CYP68J5三個關鍵氨基酸位點的定點飽和突變，獲得了催化活性提高的優良突變體D118V。其在底物濃度為0.5 g/L和2.0 g/L時的生產強度較野生型分別提高了2.12和1.72倍。分子對接和分子動力模擬發現，V118位點突變之后與底物之間產生了新的疏水相互作用，酶的整體構象更穩定以及酶與底物的結合更緊密，這些變化共同作用提高了酶的催化性能。