西瓜ClPP2C3克隆及表達(dá)分析

朱毅 柳唐鏡 宮國(guó)義 張潔 王晉芳 張海英

（1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，北京 100193；2. 北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究所，北京 100097；3. 廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，南寧 530007）

脫落酸（abscisic acid, ABA）是一種重要的植物激素，已被證實(shí)參與植物響應(yīng)環(huán)境脅迫及多種植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，如胚胎和種子發(fā)育、種子休眠和萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)器官發(fā)育等［1-2］。外源施加ABA，能夠促進(jìn)番茄［3］、葡萄［4］、西瓜［5］等作物果實(shí)的糖酸比提高、可溶性固形物積累、果實(shí)軟化、果實(shí)色澤形成等，顯示ABA在果實(shí)成熟和品質(zhì)形成中發(fā)揮重要調(diào)控作用［2］。目前，眾多學(xué)者對(duì)ABA響應(yīng)逆境脅迫、調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育等分子機(jī)制進(jìn)行深入研究，但關(guān)于ABA調(diào)控果實(shí)成熟（尤其是呼吸非躍變型果實(shí)成熟）機(jī)制研究還相對(duì)缺乏［2］。2C型蛋白磷酸酶（protein phosphatase 2C, PP2C）是ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的重要成員，參與ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［6］。ABA能夠誘導(dǎo)編碼PP2C基因表達(dá)，PP2C蛋白活性降低會(huì)增強(qiáng)植物對(duì)ABA的響應(yīng)能力。目前，已在擬南芥、草莓、番茄、棉花、小麥、油菜和水稻等多種植物中鑒定出PP2C成員，如編碼草莓PP2C的FaABI1表達(dá)水平在草莓果實(shí)發(fā)育過(guò)程中迅速下降，過(guò)表達(dá)FaABI1抑制草莓果實(shí)成熟［7-8］。干擾編碼番茄PP2C家族成員的SlPP2C1可以促進(jìn)番茄果實(shí)成熟，表明PP2C蛋白負(fù)調(diào)控ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［9］。

西瓜［Citrullus lanatus（Thunb.）Matsum. et Nakai］是一年生草本園藝作物，屬非呼吸躍變型果實(shí)，揭示其果實(shí)成熟及品質(zhì)形成機(jī)理是目前研究熱點(diǎn)，但PP2C基因家族成員在西瓜果實(shí)成熟中的作用尚不明確。

前期通過(guò)生物信息學(xué)手段結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，在西瓜基因組中共鑒定出5個(gè)PP2C基因家族成員［10］。隨著果實(shí)成熟，Cla021986、Cla012597、Cla006546、Cla006233的表達(dá)量顯著降低，而Cla-008212的表達(dá)量卻逐漸提高，且在栽培品種和野生品種中表達(dá)差異較大［11］。結(jié)合重測(cè)序數(shù)據(jù)分析，Cla008212在西瓜基因組馴化階段受到選擇［11-12］。因此，推測(cè)Cla008212對(duì)西瓜果實(shí)成熟及品質(zhì)形成起重要作用。

本研究以‘97103’西瓜果實(shí)為材料，克隆獲得Cla008212（ClPP2C3），對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析、不同果實(shí)發(fā)育階段和組織中表達(dá)分析和亞細(xì)胞定位，為進(jìn)一步研究ClPP2C3的生物學(xué)功能和對(duì)非呼吸躍變型果實(shí)成熟及品質(zhì)進(jìn)化機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料包括栽培西瓜類型CL（C. lanatus.cultivar）6種：‘97103’‘WDM’‘ZZJM’‘JMT’‘MG72 8’‘JX1M’；半野生西瓜類型CM（C. mucosospermus）3種：‘PI595203’‘PI248178’‘PI254740’；野生西瓜類型CC（C. colocvynthis）5種：‘PI220778’‘PI63 2755’‘PI549161’‘PI296337’‘PI296341-FR’。均由北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究所西瓜遺傳育種課題組保存并提供。篩選上述14份西瓜種質(zhì)用于分析不同含糖量品種中ClPP2C3的相對(duì)表達(dá)量，其中，選取‘ZZJM’授粉10 d果實(shí)作為對(duì)照。

試驗(yàn)材料種植于北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究所四季青農(nóng)場(chǎng)。授粉26 d采集西瓜果肉，取樣后立即用液氮冷凍，置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 西瓜總RNA提取和cDNA合成及熒光定量PCR 使用快速通用植物RNA提取試劑盒3.0（北京華越洋生物科技有限公司）提取西瓜果肉組織總RNA。采用北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司（GenStar）StarScript III All-in-one RT Mix with gDNA Remove試劑盒進(jìn)行cDNA合成。將cDNA鏈作為模板，西瓜Cla007792作為內(nèi)參基因［5］，利用LightCycler 480型熒光定量PCR儀（Roche）進(jìn)行定量PCR分析。PCR反應(yīng)體系為2×Mix 10 μL（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）、cDNA模板1 μL、上下游引物（10 μmol/L）各1 μL和ddH2O 7 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5℃ 30 s；95℃ 30 s，55℃ 20 s，72℃ 2 min，45個(gè)循環(huán)。比較C-T法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。利用Primer Premier 6軟件設(shè)計(jì)特異性引物（表1），引物合成和測(cè)序均在北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司完成。

表1 引物序列信息Table 1 Primer sequence information

1.2.2 ClPP2C3克隆 根據(jù)ClPP2C3（Gene ID: Cla-008212）基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系為2×Phanta Flash Master Mix 10 μL（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）、葉片模板cDNA 1 μL、上下游引物（10 μmol/L）各1 μL和ddH2O 7 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?5℃ 5 min；95℃ 15 s，55℃ 15 s，72℃ 1 min 30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳并回收目的條帶。

1.2.3 ClPP2C3生物信息學(xué)分析 運(yùn)用DNAMAN 1.0軟件對(duì)不同序列進(jìn)行多重比對(duì)分析。使用ExPASy軟件（https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/Protparam）進(jìn)行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預(yù)測(cè)分析。用MEGA7.0軟件，采用鄰接法（neighbor-joining, NJ）將西瓜和其他植物PP2C蛋白氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（1 000次重復(fù)）。

1.2.4 ClPP2C3亞細(xì)胞定位 構(gòu)建pMDC87d-GFP克隆載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α對(duì)陽(yáng)性克隆菌液進(jìn)行測(cè)序并提取質(zhì)粒。將GFP和ClPP2C3重組載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3103，涂板，48-72 h培養(yǎng)后，篩選陽(yáng)性菌在液體培養(yǎng)基（含Kan和Rif抗性）中進(jìn)行擴(kuò)繁，28℃搖床培養(yǎng)至OD600為1.0。于4 000 r/min 5 min收集菌體，用終體積為2-3 mL的懸浮液進(jìn)行懸浮，至OD600為0.6。黑暗孵育3 h，用1 mL無(wú)針頭注射器侵染煙草葉片，暗培養(yǎng)、光照培養(yǎng)各1 d后，用激光掃描共聚焦顯微鏡（蔡司LSM710）對(duì)煙草葉下表皮進(jìn)行熒光信號(hào)檢測(cè)。

1.2.5 ClPP2C3啟動(dòng)子活性比較 利用DNAMAN對(duì)西瓜栽培品種和野生品種的啟動(dòng)子序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，SNP主要集中在啟動(dòng)子序列1-2 kb范圍。為了探究SNP是否影響啟動(dòng)子活性，將栽培品種和野生品種ClPP2C3的啟動(dòng)子分成3個(gè)片段擴(kuò)增，分別是0.5、1.0和2.0 kb，其中0.5 kb啟動(dòng)子為對(duì)照。構(gòu)建pGreenII 0800-LUC重組載體，轉(zhuǎn)化DH5α菌株，測(cè)序比對(duì)正確后提取質(zhì)粒。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中并配制煙草注射緩沖液重懸菌體至OD值為0.6。使用注射器將菌液注射至煙草葉片中，溫室正常光照培養(yǎng)48-60 h。隨后取樣和標(biāo)號(hào)，液氮速凍，進(jìn)行熒光素酶互補(bǔ)試驗(yàn)。通過(guò)生物化學(xué)發(fā)光分析設(shè)備定性定量檢測(cè)熒光強(qiáng)度，分析不同片段長(zhǎng)度的啟動(dòng)子活性。

2 結(jié)果

2.1 ClPP2C3 CDS克隆

以‘97103’西瓜果肉cDNA為模板，通過(guò)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得ClPP2C3的CDS序列（圖1）。ClPP2C3的cDNA序列長(zhǎng)度為1 317 bp，編碼438個(gè)氨基酸，分子量大小為47.81 kD，蛋白質(zhì)等電點(diǎn)為5.12。

圖1 西瓜ClPP2C3的CDS序列Fig. 1 CDS sequence of ClPP2C3 in watermelon

2.2 ClPP2C3同源性分析

使用NCBI網(wǎng)站BLAST工具搜索與ClPP2C3同源性較高的氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，西瓜ClPP2C3與擬南芥AtAHG3和番茄SlPP2C3蛋白序列同源性達(dá)35.79%。DNAMAN軟件多序列比對(duì)結(jié)果（圖2）顯示，這些蛋白均具有PP2C基因家族中PP2C轉(zhuǎn)錄因子的典型特征，序列中均含有PP2C蛋白結(jié)構(gòu)域，且在PP2C結(jié)構(gòu)域保守性較高。使用MEGA 7.0中鄰接（neighbor-joining）法對(duì)篩選出的蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建，結(jié)果（圖3）顯示，ClPP2C3與擬南芥AtAHG3、番茄SlPP2C3蛋白具有較高的一致性，其親緣關(guān)系最近，ClPP2C3可能同這些蛋白具有相似的功能。

2.3 ClPP2C3亞細(xì)胞定位分析

通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察ClPP2C3蛋白在煙草葉片中亞細(xì)胞定位情況，結(jié)果（圖4）顯示，重組載體GFP熒光信號(hào)主要集中在細(xì)胞核中，而對(duì)照空載體GFP熒光信號(hào)分布于整個(gè)細(xì)胞，說(shuō)明ClPP2C3蛋白均在細(xì)胞核中表達(dá)并發(fā)揮功能。

圖4 ClPP2C3亞細(xì)胞定位分析Fig. 4 Subcellular localization analysis of ClPP2C3

2.4 ClPP2C3表達(dá)量分析

對(duì)不同品種西瓜熒光定量PCR分析（表2），ClPP2C3在含糖量9-12的栽培型類型CL（C.lanatus. cultivar）中的表達(dá)量分別是含糖量為2-3的半野生類型CM（C. mucosospermus）、含糖量為1-2的野生類型CC（C. colocvynthis）的4倍和9倍，顯著高于半野生類型CM（C. mucosospermus）和野生類型CC（C. colocvynthis）（圖5）。表明ClPP2C3在含糖量高的類型中表達(dá)量高于含糖量低的類型，二者呈正相關(guān)關(guān)系。

圖5 西瓜ClPP2C3在不同含糖量品種中的表達(dá)量分析Fig. 5 Expressions of ClPP2C3 in watermelon varieties with different sugar contents

表2 西瓜ClPP2C3在不同含糖量品種中的表達(dá)量分析Table 2 Expressions of ClPP2C3 in watermelon varieties with different sugar contents

2.5 ClPP2C3啟動(dòng)子活性差異分析

西瓜栽培品種和野生品種ClPP2C3表達(dá)量存在差異，推測(cè)可能是啟動(dòng)子活性對(duì)其產(chǎn)生影響。對(duì)啟動(dòng)子序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，SNP主要集中在1-2 kb范圍。將啟動(dòng)子分成3段：0.5、1.0和2.0 kb，分別構(gòu)建融合表達(dá)載體，進(jìn)行熒光素酶互補(bǔ)試驗(yàn)，并通過(guò)生物化學(xué)發(fā)光分析設(shè)備定性定量檢測(cè)熒光強(qiáng)度。結(jié)果顯示，西瓜栽培品種2 kb長(zhǎng)度啟動(dòng)子活性是野生品種2 kb長(zhǎng)度啟動(dòng)子活性的1.3倍，顯著強(qiáng)于野生品種2 kb長(zhǎng)度啟動(dòng)子活性，但二者1 kb長(zhǎng)度啟動(dòng)子活性以及0.5 kb長(zhǎng)度啟動(dòng)子活性無(wú)明顯差異。證明栽培品種和野生品種啟動(dòng)子活性差異是由啟動(dòng)子序列1-2 kb間SNP導(dǎo)致的，可能造成表達(dá)差異（圖6）。通過(guò)啟動(dòng)子序列分析發(fā)現(xiàn)，栽培品種ClPP2C3啟動(dòng)子序列上缺少了1個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件（圖7），可能影響了啟動(dòng)子活性。

圖6 栽培和野生品種中西瓜ClPP2C3的3個(gè)片段長(zhǎng)度啟動(dòng)子活性差異分析Fig. 6 Difference analysis of promoter activities at three fragment lengths of ClPP2C3 between cultivated and wild watermelon

圖7 不同品種西瓜ClPP2C3的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模型Fig. 7 Transcription regulation models of ClPP2C3 in different watermelon varieties

3 討論

PP2C是ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中重要的負(fù)調(diào)節(jié)因子，參與調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育，以及抵御逆境脅迫反應(yīng)的生物學(xué)過(guò)程［13-15］。近年來(lái)，PP2C被報(bào)道負(fù)調(diào)控果實(shí)成熟，多集中在呼吸躍變果實(shí)番茄上，但PP2C多個(gè)家族成員調(diào)控果實(shí)成熟的分子機(jī)制仍不明確，需要進(jìn)一步挖掘［13］。

由于大多數(shù)非呼吸躍變果實(shí)缺乏穩(wěn)定高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系，PP2C調(diào)控非呼吸躍變果實(shí)成熟機(jī)制一直未能有效探明。僅有研究發(fā)現(xiàn)在草莓瞬時(shí)沉默PP2C促進(jìn)果實(shí)著色，但調(diào)控機(jī)制未得到深入挖掘［8］。西瓜作為重要的非呼吸躍變果實(shí)，ABA被證明是主導(dǎo)其果實(shí)成熟的關(guān)鍵激素，但ABA信號(hào)如何參與西瓜果實(shí)成熟調(diào)控仍不清晰［5］。本研究前期以能夠正常成熟的栽培西瓜和不能正常成熟的野生西瓜為研究對(duì)象，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，ClPP2C3在栽培品種和野生品種中的表達(dá)存在較大差異［12］。在此基礎(chǔ)上，本研究通過(guò)在14個(gè)代表性品種中分析ClPP2C3的表達(dá)，明確ClPP2C3表達(dá)量與果實(shí)含糖量呈正相關(guān)。然而，PP2C作為ABA信號(hào)途徑中的負(fù)調(diào)控因子，其表達(dá)卻隨著西瓜果實(shí)ABA和含糖量的積累逐漸提高，其作用機(jī)制仍不明確。前人研究顯示，ABA處理后，擬南芥中的ABRE類轉(zhuǎn)錄因子能夠激活PP2C表達(dá)，反饋調(diào)節(jié)ABA信號(hào)［16］。借鑒前人研究發(fā)現(xiàn)，ClPP2C3啟動(dòng)子上確實(shí)存在ABRE結(jié)合元件。因此，推測(cè)在西瓜果實(shí)成熟過(guò)程中也存在關(guān)鍵ABRE轉(zhuǎn)錄因子激活ClPP2C3的表達(dá)，但其基因功能和作用機(jī)制亟待深入研究。

西瓜果實(shí)由不能正常成熟的野生西瓜進(jìn)化為可以食用的栽培西瓜，經(jīng)過(guò)了3個(gè)進(jìn)化階段。Cla008212位于第2進(jìn)化階段，即馴化階段，西瓜果實(shí)由完全不能成熟的野生西瓜進(jìn)化為半野生西瓜［5,12］。通過(guò)單倍型分析，ClPP2C3的啟動(dòng)子序列上具有8個(gè)SNP。結(jié)合啟動(dòng)子活性分析推測(cè)，位于1-2 kb區(qū)間的（-1 216，A/G）變異位點(diǎn)可能是影響啟動(dòng)子活性的關(guān)鍵SNP。通過(guò)啟動(dòng)子結(jié)合元件分析發(fā)現(xiàn)，該位點(diǎn)變異導(dǎo)致栽培品種中WRKY轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)TGAC缺失。因此，推測(cè)野生品種中可能存在一個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制的WRKY轉(zhuǎn)錄因子抑制ClPP2C3表達(dá)，而栽培品種中該轉(zhuǎn)錄因子不能結(jié)合ClPP2C3啟動(dòng)子，緩解了其對(duì)ClPP2C3表達(dá)的抑制。WRKY轉(zhuǎn)錄因子可能介導(dǎo)ClPP2C3調(diào)控西瓜成熟及果實(shí)含糖量，但該假設(shè)仍需下一步研究確認(rèn)。

4 結(jié)論

西瓜ClPP2C3編碼蛋白定位于細(xì)胞核，其基因表達(dá)與西瓜果實(shí)含糖量呈正相關(guān)，含糖量高的品種中表達(dá)高于含糖量低的品種。該基因可能是調(diào)控西瓜果實(shí)含糖量的關(guān)鍵候選基因。由1-2 kb區(qū)間SNP導(dǎo)致的啟動(dòng)子活性差異對(duì)不同含糖量品種中ClPP2C3表達(dá)量存在影響。