外源鈣緩解小麥幼苗鹽脅迫的作用機制

焦進蘭 王文文 介欣芮 王華忠 岳潔瑜

（天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 天津市動植物抗性重點實驗室，天津 300387）

小麥作為第二大糧食作物，約占我國居民口糧消費總量的43%，在糧食安全中占有重要的地位。然而，小麥在生長發(fā)育過程中經(jīng)常受到各種逆境脅迫而導(dǎo)致減產(chǎn)，鹽脅迫就是其中之一［1］。近年來，土壤鹽漬化問題在世界范圍內(nèi)廣泛存在且日趨嚴重，提高鹽漬化土地內(nèi)糧食作物的耐性已迫在眉睫。鹽脅迫會引起離子毒害、滲透脅迫、氧化損傷等［2］。滲透和離子脅迫會導(dǎo)致葉片生長緩慢并導(dǎo)致葉片過早衰老，從而導(dǎo)致植物光合作用受到抑制［3］。此外，鹽脅迫下，植物細胞產(chǎn)生過量的活性氧（reactive oxygen species, ROS）破壞細胞組分，導(dǎo)致氧化損傷，損傷嚴重時，甚至導(dǎo)致植株死亡［4］。因此，解析小麥耐鹽機制具有重要的現(xiàn)實意義。

植物在受到外界脅迫時，其自身會發(fā)生一系列反應(yīng)來抵御脅迫，包括活性氧清除與降解、細胞凋亡與自噬等［5-6］。自噬是真核細胞內(nèi)一種進化保守的自我消化機制，是負責(zé)將受損的細胞器、錯誤折疊的蛋白及其他大分子物質(zhì)等運送至液泡（植物）或溶酶體（動物）降解并再利用的過程［7］。已有研究表明，自噬是鹽脅迫下植物細胞維持細胞穩(wěn)態(tài)的主要途徑之一。正常水平的自噬是一種通過降解細胞內(nèi)異常組分以維持細胞穩(wěn)態(tài)的過程，但自噬過度上調(diào)則會引起自噬性細胞死亡（autophagic cell death），即II型細胞程序性死亡（programmed cell death, PCD）［8］。對植株來說，適度的細胞自噬可為其他細胞提供所需營養(yǎng)物質(zhì)，幫助其他細胞維持正常的生理機能，或者用來修復(fù)逆境脅迫所帶來的傷害等［9］。在煙草、擬南芥、水稻、小麥等植物上自噬相關(guān)基因（autophagy related gene, ATG）的鑒定和分析相繼被報道，揭示自噬在植物應(yīng)答逆境脅迫過程中發(fā)揮非常關(guān)鍵的作用，ROS的產(chǎn)生是植株抵御脅迫共有的關(guān)鍵過程［10-11］。但關(guān)于自噬與自噬性細胞死亡之間的相互轉(zhuǎn)換關(guān)系，相關(guān)的調(diào)控信號途徑等問題尚不清晰。

鈣離子（Ca2+）作為植物體內(nèi)的第二信使，在植物的生長發(fā)育和響應(yīng)逆境脅迫中發(fā)揮重要的作用。非生物脅迫下，外源Ca2+的施用可改善脅迫環(huán)境對細胞生長發(fā)育的抑制，維持細胞功能和結(jié)構(gòu)的完整性［12］。如CaCl2處理通過改善細胞膜的結(jié)構(gòu)完整性來限制梨上褐斑的發(fā)展［13］。外源Ca2+處理增加了西蘭花微綠葉菜的生物量，并延緩了其衰老［14］。在鹽脅迫條件下，Ca2+誘導(dǎo)Ca2+通道阻礙Na+的吸收，維持植物的生長，同時還作為一種信號分子參與鹽脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達，從而提高植物耐鹽性［15］。Ca2+通過降低植物根系對Na+的吸收量和向地上部的運輸量，增加對K+、Mg2+、Ca2+的吸收量和運輸量，降低鹽脅迫下各器官Na+/Ca2+值、Na+/K+值［16］。在植物體內(nèi)，Ca2+主要通過Ca2+信號感受蛋白傳遞脅迫信號，如鈣調(diào)素（calmodulins,CaM）、鈣依賴蛋白激酶（Ca2+-dependent protein kinases, CDPK）等，這些Ca2+感受器被復(fù)雜的基因家族編碼，構(gòu)成了復(fù)雜的信號傳遞網(wǎng)絡(luò)［17］。當(dāng)植物處于鹽脅迫環(huán)境中，Ca2+通道蛋白作為重要的鹽信號受體能迅速感知并使胞內(nèi)Ca2+濃度急劇上升［18］。CDPK可直接被Ca2+信號激活，通過感知Ca2+濃度的變化向下游傳遞信號，誘導(dǎo)下游基因的表達，從而改變植株的理化性質(zhì)，同時調(diào)節(jié)細胞自噬與凋亡，使植物對逆境脅迫進行適應(yīng)和抵御［19］。研究表明，OsCPK12可以通過減少水稻ROS的積累來增加對脫落酸（abscisic acid, ABA）的敏感性并提高植株的耐鹽性［20］。過表達VaCDPK20提高了擬南芥在冷凍和干旱處理條件下的耐性［21］。已有研究表明Ca2+信號對自噬發(fā)生過程的重要調(diào)控作用［22］。在一些生理和病理條件下，Ca2+誘導(dǎo)哺乳動物細胞自噬增加［23］。外源Ca2+通過提高梨的自噬活性和水楊酸水平，提高梨對多刺葡萄孢菌的抗性［24］。

Ca2+作為一種幫助植物更好適應(yīng)鹽脅迫的效應(yīng)分子，目前，其對植物耐鹽性調(diào)控作用的研究主要集中在生理學(xué)研究，Ca2+調(diào)控植物耐鹽的作用機制還需要進一步研究。

本研究以河農(nóng)6425品種小麥為材料，解析Ca2+在小麥幼苗響應(yīng)鹽脅迫中的作用及Ca2+在鹽脅迫誘導(dǎo)的自噬中的調(diào)控作用，為進一步揭示植物鹽脅迫應(yīng)答機制提供分子證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

以小麥品種河農(nóng)6425作為試驗材料，該品種屬于中早熟冬性小麥，生育期為249 d，有較強的抗倒伏性。在小麥生長至苗期的兩葉一心時，對其進行處理。用150 mmol/L NaCl處理以創(chuàng)造小麥幼苗鹽脅迫環(huán)境，NaCl處理濃度以50 mmol/L逐天遞增至150 mmol/L，每天NaCl遞增的濃度為50 mmol/L。以避免鹽激效應(yīng)對小麥幼苗生長造成影響。以CaCl2和LaCl3分別作為外源Ca2+和Ca2+抑制劑，對小麥幼苗進行處理。

1.2 方法

1.2.1 Ca2+及其抑制劑的濃度篩選 選取顆粒飽滿、大小均勻的小麥種子，用蒸餾水浸種24 h，置于鋪有兩層紗布的培養(yǎng)盆中培養(yǎng)，期間定時澆水以確保種子能正常發(fā)芽生長。待小麥幼苗生長至一葉一心期，將其轉(zhuǎn)移至1/10 Hoagland營養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)（表1）［1］，至兩葉一心期時，選取生長一致的小麥幼苗進行Ca2+及其抑制劑處理。設(shè)置0、1、5、10和20 mmol/L CaCl2濃度梯度，分別對正常生長小麥幼苗和鹽脅迫小麥幼苗進行處理。基于前期試驗，選用5 mmol/L LaCl3作為Ca2+抑制劑對正常生長小麥幼苗和鹽脅迫小麥幼苗進行處理。

表1 營養(yǎng)液配置表Table 1 Nutrient solution formula

1.2.2 小麥幼苗形態(tài)觀察及生長參數(shù)測定 觀察小麥幼苗生長狀況，待不同處理組小麥幼苗形態(tài)有明顯差異時，用直尺測量小麥幼苗根長、葉長、葉寬、株高等生長參數(shù)，每組至少測量5株，并對不同處理組小麥幼苗進行取樣拍照［1］。

1.2.3 葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定 使用雙通道調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨x測量不同處理組中小麥幼苗第三葉的葉綠素?zé)晒鈪?shù)，每組至少測量5株。葉片暗適應(yīng)20 min后測量暗適應(yīng)后的最小熒光值F0、光系統(tǒng)II（photosystem II, PSII）的最大光化學(xué)效率Fv/Fm、PSII的實際光能轉(zhuǎn)化效率Y（II）、光合電子相對傳遞速率ETR、光化學(xué)淬滅值qP及非光化學(xué)淬滅值NPQ［1］。

1.2.4 二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine, DAB）染色 參考實驗室之前建立的方法［1］。取小麥幼苗第三葉葉片3-4 cm，去掉發(fā)黃葉尖，每組至少3個重復(fù)，置于1 mg/mL DAB染液中，抽真空20 min后，25℃避光染色13 h，然后，將葉片放進卡諾試劑（無水乙醇∶冰醋酸=3∶1）固定7 h。85%酒精60℃水浴脫色，直至葉片無色后放進葉保存液（75%乙醇+5%甘油+ddH2O）中4℃保存。取小麥幼苗根尖1-2 cm置于1 mg/mL DAB染液，25℃避光染色30 min，用ddH2O沖洗染液，結(jié)束染色，將其放進根保存液（50%乙醇+5%甘油+ddH2O）4℃保存。用體式顯微鏡（Nikon C-fled2, 日本）觀察拍照。

1.2.5 氯化硝基四氮唑藍（nitrotetrazolium blue chloride, NBT）染色 方法同1.2.4，將材料置于0.5 mg/mL NBT染液中，抽真空20 min，25℃避光染色10 h，置于卡諾試劑固定7 h，85%酒精60℃水浴脫色，至葉片無色，置于葉保存液，4℃保存。取小麥幼苗根尖1-2 cm置于0.5 mg/mL NBT染液25℃避光染色5-8 min，用ddH2O將染液沖洗干凈，并置于根保存液，4℃保存。用體式顯微鏡（Nikon C-fled2，日本）觀察拍照。

1.2.6 伊文思藍染色 方法同1.2.4，將材料置于0.25%伊文思藍染液25℃避光染色24 h，用ddH2O沖洗，放進煮沸的脫色液（無水乙醇∶甘油=9∶1）水浴脫色，至葉片底色變?yōu)榘咨糜谌~保存液4℃保存。取小麥幼苗根尖1-2 cm置于0.25%伊文思藍染液中，25℃避光染色5-10 min，用ddH2O快速沖洗，并靜置1 h去掉浮色后放進根保存液中4℃保存。用體式顯微鏡（Nikon C-fled2，日本）觀察拍照。

1.2.7 過氧化物酶（peroxidase, POD）活性檢測 采用POD活性檢測試劑盒測定小麥幼苗中POD活力，參考過氧化氫氧化法，使用紫外分光光度計（UVmini-1240, 島津）測定反應(yīng)混合液在470 nm處的吸光值，計算POD活力。3次重復(fù)試驗。

1.2.8 超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）活性檢測 采用SOD活性檢測試劑盒測定小麥幼苗中SOD活力，參考還原氮藍四唑法，用紫外分光光度計測定反應(yīng)混合液在560 nm處的吸光值，計算得出SOD活力。3次重復(fù)試驗。

1.2.9 過氧化氫酶（catalase, CAT）活性檢測 采用CAT活性檢測試劑盒測定小麥幼苗中CAT活性，用紫外分光光度計測定反應(yīng)混合液在240 nm處的吸光值，計算得出CAT活力。3次重復(fù)試驗。

1.2.10 超氧陰離子（O2·-）含量檢測 采用O2·-含量檢測試劑盒測定小麥幼苗中O·-含量，利用O·-22與鹽酸羥胺反應(yīng)生成NO2-，NO2-在對氨基苯磺酰胺和萘乙二胺鹽酸鹽的作用下，生成紫紅色的偶氮化合物，在530 nm有特征吸收峰，通過酶標儀（Infinite M200 Pro，瑞士）測定A530即可計算得出O2·-含量。3次重復(fù)試驗。

1.2.11 過氧化氫（H2O2）含量檢測 采用H2O2含量檢測試劑盒檢測小麥幼苗中H2O2含量，利用酶標儀（Infinite M200 Pro，瑞士）測定反應(yīng)混合液在波長415 nm處的吸光值，計算H2O2含量。3次重復(fù)試驗。

1.2.12 葉綠素含量測定 采用95%乙醇提取法測定小麥幼苗中葉綠素含量［25］。稱取小麥幼苗第三葉葉片0.2 g，加液氮研磨后放入10 mL離心管中，加入8 mL 95%乙醇于25℃避光放置12 h以充分提取葉綠素，之后4 500 r/min離心10 min，取上清，用紫外分光光度計分別測定波長663和645 nm時的吸光值，計算葉綠素含量。3次重復(fù)試驗。

1.2.13 TUNEL染色檢測小麥幼苗凋亡細胞 采用DeadEndTMFluorometric TUNEL System（Promega，美國）試劑盒檢測小麥幼苗中凋亡細胞，分別用DAPI和PI染液對小麥幼苗葉片和根部組織進行復(fù)染后，使用正置熒光顯微鏡觀察植物組織中細胞凋亡情況，并拍照進行計數(shù)統(tǒng)計。

1.2.14 MDC（monodansylcadaverine）染色檢測小麥幼苗自噬活性 運用MDC染色檢測小麥幼苗自噬活性［26］。取小麥幼苗根和葉片1-2 cm，蒸餾水洗凈，浸沒于染色液中，抽真空15 min后置于冰上黑暗染色30 min，用1×PBS清洗多余染色液結(jié)束染色。用共聚焦顯微鏡觀察植物組織中自噬活性變化。

1.2.15 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測 運用RT-qPCR檢測小麥幼苗中各基因的表達量［6］，提取小麥幼苗組織RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR擴增程序為95℃ 2 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個循環(huán)，以Tublin作為內(nèi)參基因進行數(shù)據(jù)分析。各處理組進行3次重復(fù)試驗。所用引物如表2。

表2 RT-qPCR引物Table 2 Primers used for RT-qPCR

2 結(jié)果

2.1 Ca2+緩解NaCl脅迫下小麥幼苗生長的濃度篩選

外源施加不同濃度CaCl2處理144 h后，與NaCl處理組相比，1、5、10和20 mmol/L CaCl2處理均顯著提高小麥幼苗的耐鹽性，其根長和葉寬均顯著增加（圖1-A-B）。其中10 mmol/L CaCl2處理緩解小麥幼苗耐鹽性的效果最顯著，根長、葉寬均顯著增多，小麥幼苗長勢最好（圖1-C-D）。

圖1 不同濃度CaCl2對NaCl脅迫下小麥幼苗生長影響Fig. 1 Effects of different concentrations of CaCl2 on wheat seedling growth under NaCl stress

為了探究不同濃度CaCl2處理對小麥幼苗葉片組織中ROS的影響，分別用DAB和NBT染色檢測H2O2和O2·-在小麥葉片中的累積情況。NaCl脅迫導(dǎo)致葉片組織中H2O2和O2·-積累量增多。不同濃度CaCl2處理后，NaCl脅迫導(dǎo)致的H2O2和O2·-積累量均有所減少，其中10 mmol/L CaCl2處理組中H2O2和O2·-積累量最少（圖2-A-B）。

圖2 NaCl脅迫對小麥幼苗葉片生長機理影響Fig. 2 Effects of NaCl stress on the growth mechanism of wheat seedling leaves

采用伊文思藍染色法探究不同濃度CaCl2對小麥幼苗葉片細胞活力的影響。NaCl脅迫會導(dǎo)致葉片中死亡細胞增多，使細胞活力降低，分別添加1、5、10和20 mmol/L CaCl2處理后，葉片死亡細胞減少，其中，施加10 mmol/L CaCl2后，死亡細胞最少，葉片細胞活力最高（圖2-C）。

綜上，外源施加CaCl2對NaCl脅迫下小麥幼苗生長有促進作用，10 mmol/L CaCl2對NaCl脅迫的緩解效果最好。因此，選用10 mmol/L CaCl2作為外源施加Ca2+濃度。基于前期試驗，選用5 mmol/L LaCl3作為Ca2+抑制劑。通過外源施加Ca2+及其抑制劑，以探究Ca2+調(diào)控小麥幼苗耐鹽的作用機制。

2.2 外源Ca2+對NaCl脅迫下小麥幼苗生長的影響

外源施加10 mmol/L CaCl2和5 mmol/L LaCl3分別對正常及NaCl脅迫下小麥幼苗進行處理，處理144 h后觀察到不同處理組間小麥幼苗生長狀況出現(xiàn)顯著差異（圖3）。與對照組（CK）相比，NaCl處理后小麥幼苗生長狀況較差，其生長指標葉長、葉寬、根長和株高均顯著降低。NaCl脅迫下，外源Ca2+處理有助于緩解NaCl脅迫對小麥幼苗的危害，其根長、株高、葉長和葉寬均顯著增加，但對正常生長小麥幼苗生長狀況及生長指標根長、株高、葉長和葉寬均無明顯影響；LaCl3處理后正常及NaCl脅迫下小麥幼苗生長狀況均顯著變差，其根長、株高、葉長和葉寬均顯著降低（表3）。

圖3 外源Ca2+對NaCl脅迫下小麥幼苗生長狀況的影響Fig. 3 Effects of exogenous Ca2+ on the growth of wheat seedlings under NaCl stress

表3 外源Ca2+ 對NaCl脅迫下小麥幼苗根長、株高、葉長、葉寬的影響Table 3 Effects of exogenous Ca2+ on the root length, plant height, leaf length and leaf width of wheat seedlings under NaCl stress cm

2.3 外源Ca2+對NaCl脅迫下小麥幼苗TaCDPK27表達量的影響

CDPK作為鈣依賴蛋白激酶，其基因表達量與植物體內(nèi)Ca2+濃度有密切聯(lián)系。外源施加CaCl2和LaCl3處理144 h后，通過RT-qPCR檢測正常生長及NaCl脅迫下小麥幼苗根和葉片中TaCDPK27表達情況。與對照組相比，NaCl處理后小麥幼苗根和葉片中TaCDPK27表達量均顯著上調(diào)；外源Ca2+處理促進NaCl脅迫下小麥幼苗根和葉片中TaCDPK27表達量顯著上調(diào)，但對正常生長小麥幼苗根和葉片中TaCDPK27表達量無顯著影響；外源施加LaCl3處理后，對照組和NaCl脅迫組小麥幼苗根和葉片中TaCDPK27表達量均顯著下調(diào)（圖4）。

圖4 外源Ca2+對NaCl脅迫下小麥幼苗根和葉片中TaCDPK27表達情況的影響Fig. 4 Effects of exogenous Ca2+ on TaCDPK27 expression in the roots and leaves of wheat seedlings under NaCl stress

2.4 外源Ca2+對NaCl脅迫下小麥幼苗細胞自噬活性的調(diào)控

2.4.1 MDC染色檢測小麥幼苗細胞自噬活性 為探究NaCl脅迫對小麥幼苗細胞自噬活性的調(diào)控，通過MDC染色對細胞自噬活性進行持續(xù)檢測。分別對NaCl處理0、3、6、12、24、48、72、96、120和144 h的小麥幼苗根進行自噬活性檢測，結(jié)果（圖5）顯示，NaCl處理3 h小麥幼苗根細胞有自噬現(xiàn)象發(fā)生，到6 h自噬小體顯著增多，NaCl持續(xù)處理12、24和48 h自噬小體無顯著變化，自噬活性處于穩(wěn)定狀態(tài)，72 h自噬小體開始減少，到120 h自噬小體最少，自噬活性最低。然而NaCl繼續(xù)處理144 h時，自噬小體顯著增多，細胞自噬活性再次升高。鑒于NaCl處理6和144 h，小麥根中自噬小體顯著增多，因此，選擇這兩個處理時間進一步檢測Ca2+對NaCl脅迫下小麥幼苗細胞自噬活性的影響。

圖5 MDC染色檢測NaCl脅迫下小麥幼苗根中自噬小體（標尺=100 μm）Fig. 5 Autophagy activity of wheat seedling roots under NaCl stress detected by MDC staining（Bar=100μm）

為探究外源Ca2+對NaCl脅迫下小麥幼苗細胞自噬活性的調(diào)控，外源施加CaCl2和LaCl3對正常生長及NaCl脅迫下小麥幼苗處理6和144 h后，對小麥幼苗根進行MDC染色。NaCl處理6 h時，與對照組相比，NaCl脅迫下小麥幼苗自噬小體增多，自噬活性增強；外源施加CaCl2和LaCl3對正常生長小麥幼苗自噬活性無顯著影響；對NaCl脅迫下小麥幼苗進行CaCl2處理后自噬小體顯著增多，進行LaCl3處理后，自噬小體顯著減少。說明外源Ca2+促進NaCl脅迫6 h小麥幼苗適度自噬，有助于細胞修復(fù)NaCl脅迫危害（圖6-A）。NaCl處理144 h時，與對照組相比，NaCl脅迫下小麥幼苗根細胞自噬小體增多，自噬活性增強；外源施加CaCl2和LaCl3對正常生長小麥幼苗自噬活性無顯著影響；對NaCl脅迫下小麥幼苗進行CaCl2處理后根自噬小體顯著減少，進行LaCl3處理后，自噬小體顯著增多（圖6-B）。為進一步驗證此結(jié)果，對處理144 h小麥幼苗葉片細胞進行自噬活性檢測，不同處理組細胞自噬活性變化與根細胞變化趨勢保持一致（圖7）。即外源Ca2+處理減弱小麥幼苗根和葉片細胞由于NaCl脅迫導(dǎo)致的自噬活性異常升高。

圖6 MDC染色檢測外源Ca2+ 對NaCl脅迫下小麥幼苗根自噬活性影響（標尺=100 μm）Fig. 6 Effects of exogenous Ca2+ on the autophagy activities of wheat seedling roots under NaCl stress by MDC staining（Bar=100 μm）

圖7 MDC染色檢測外源Ca2+ 對NaCl脅迫144 h小麥幼苗葉片自噬活性的影響（標尺=100 μm）Fig. 7 Effects of exogenous Ca2+ on the autophagy activities of wheat seedling leaves under NaCl stress at 144 h by MDC staining（Bar=100 μm）

2.4.2 RT-qPCR檢測外源Ca2+對NaCl脅迫下小麥幼苗根和葉片TaATGs表達量變化 與對照組相比，NaCl處理導(dǎo)致小麥幼苗根和葉片中，TaATG2、TaATG7、TaATG5、TaATG8和TaATG10表達量均顯著上調(diào)。外源Ca2+處理導(dǎo)致NaCl脅迫下小麥幼苗TaATG2、TaATG7、TaATG5、TaATG8和TaATG10表達量均顯著下調(diào)，但對正常生長小麥幼苗TaATG2、TaATG7、TaATG5、TaATG8和TaATG10表達量無顯著影響；外源施加LaCl3處理后，對照組和NaCl脅迫組中小麥幼苗TaATG2、TaATG7、TaATG5、TaATG8和TaATG10表達量均顯著上調(diào)（圖8）。結(jié)果表明，外源Ca2+能抑制NaCl脅迫下小麥幼苗TaATGs的過量表達。

圖8 RT-qPCR檢測外源Ca2+對NaCl脅迫下小麥幼苗根和葉片中TaATGs表達的影響Fig. 8 Effects of exogenous Ca2+ on TaATGs expression in the roots and leaves of wheat seedlings under NaCl stress by RT-qPCR

2.5 外源Ca2+對NaCl脅迫下小麥幼苗根和葉片細胞活力的影響

2.5.1 伊文思藍染色檢測小麥幼苗根和葉片細胞活力 外源施加CaCl2和LaCl3對正常生長及NaCl脅迫下小麥幼苗處理144 h，利用伊文思藍染色檢測小麥幼苗根和葉片細胞死亡情況。小麥幼苗根和葉片中細胞死亡變化趨勢一致。與對照組相比，NaCl脅迫下小麥幼苗根和葉片死亡細胞增多；外源Ca2+處理顯著減少NaCl脅迫下小麥幼苗根和葉片死細胞數(shù)量，但對正常生長小麥幼苗根和葉片細胞活力無顯著影響；外源施加LaCl3處理后，對照組和NaCl脅迫組小麥幼苗根和葉片中藍色區(qū)域變大，死亡細胞明顯增多（圖9）。

圖9 伊文思藍染色檢測外源Ca2+對NaCl脅迫下小麥幼苗根和葉片細胞活力的影響（標尺=1 000 μm）Fig. 9 Effects of exogenous Ca2+ on cell viability in the roots and leaves of wheat seedlings under NaCl stress by Evans Blue staining（Bar=1 000 μm）

2.5.2 TUNEL染色檢測外源Ca2+對NaCl脅迫下小麥幼苗根和葉片PCD的影響 外源施加CaCl2和LaCl3對正常生長及NaCl脅迫下小麥幼苗處理144 h后，通過TUNEL染色檢測小麥幼苗根和葉片PCD。小麥幼苗根和葉片PCD變化趨勢一致。與對照組相比，NaCl脅迫導(dǎo)致小麥幼苗根和葉片PCD顯著升高；外源Ca2+處理顯著降低NaCl脅迫下小麥幼苗根和葉片PCD，但對正常生長小麥幼苗根和葉片PCD無顯著影響；外源施加LaCl3處理后，對照組和NaCl脅迫組小麥幼苗根和葉片PCD均顯著升高（圖10）。

圖10 TUNEL染色檢測外源Ca2+ 對NaCl脅迫下小麥幼苗根和葉片PCD的影響Fig. 10 Effects of exogenous Ca2+ on PCD in the roots and leaves of wheat seedlings under NaCl stress by TUNEL staining

2.6 外源Ca2+對NaCl脅迫下小麥幼苗根和葉片ROS的影響

2.6.1 DAB與NBT染色檢測小麥幼苗根和葉片H2O2與O2·-積累 外源施加CaCl2和LaCl3對正常生長及NaCl脅迫下小麥幼苗處理144 h后，分別用DAB和NBT染色檢測H2O2和O2·-在小麥幼苗根和葉片中的累積情況。小麥幼苗根和葉片ROS累積變化趨勢一致。與對照組相比，NaCl脅迫導(dǎo)致小麥幼苗根和葉片H2O2與O2·-累積量升高（圖11）；外源Ca2+處理顯著降低NaCl脅迫下小麥幼苗根和葉片H2O2與O2·-的累積，但對正常生長小麥幼苗根和葉片H2O2與O2·-累積量無顯著影響；外源施加LaCl3處理導(dǎo)致對照組和NaCl脅迫組小麥幼苗根和葉片H2O2與O2·-累積量均顯著升高（圖11）。

圖11 DAB與NBT染色檢測外源Ca2+對NaCl脅迫下小麥幼苗H2O2與O2·-累積量的影響（標尺=1 000μm）Fig. 11 Effects of exogenous Ca2+ on H2O2 and O2·- accumulation in wheat seedlings under NaCl stress by DAB and NBT staining（Bar=1 000 μm）

2.6.2 外源Ca2+對NaCl脅迫下小麥幼苗根和葉片H2O2與O2·-含量的影響 外源施加CaCl2和LaCl3對正常生長及NaCl脅迫下小麥幼苗處理144 h后，對小麥幼苗根和葉片進行H2O2與O2·-含量檢測。小麥幼苗根和葉片中H2O2、O2·-含量變化趨勢一致。與對照組相比，NaCl脅迫導(dǎo)致小麥幼苗根和葉片H2O2與O2·-含量顯著升高；外源Ca2+處理顯著降低NaCl脅迫下小麥幼苗根和葉片H2O2與O2·-含量，但對正常生長小麥幼苗根和葉片H2O2與O2·-含量無顯著影響；無論是對照組還是NaCl脅迫組，外源施加LaCl3處理后小麥幼苗根和葉片H2O2與O2·-含量均顯著升高（圖12）。

圖12 外源Ca2+對NaCl脅迫下小麥幼苗根和葉片H2O2與O2·-含量的影響Fig. 12 Effects of exogenous Ca2+ on H2O2 and O2·- contents in the roots and leaves of wheat seedlings under NaCl stress

2.7 外源Ca2+對NaCl脅迫下小麥幼苗POD、SOD、CAT活性影響

外源施加CaCl2和LaCl3對正常生長及NaCl脅迫下小麥幼苗處理144 h后，檢測小麥幼苗根和葉片POD活性。小麥幼苗根與葉片中POD活性變化趨勢一致。與對照組相比，NaCl脅迫導(dǎo)致小麥幼苗根和葉片POD活性顯著升高；外源施加CaCl2和LaCl3處理對正常生長小麥幼苗根和葉片POD活性無顯著影響；外源Ca2+處理顯著增加NaCl脅迫下小麥幼苗根和葉片POD活性，外源施加LaCl3處理則顯著降低小麥幼苗根和葉片POD活性（圖13）。

圖13 外源Ca2+ 對NaCl脅迫下小麥幼苗根和葉片POD活性影響Fig. 13 Effects of exogenous Ca2+ on the POD activities of wheat seedlings under NaCl stress

小麥幼苗根與葉片中SOD、CAT活性變化趨勢一致。與對照組相比，NaCl脅迫下小麥幼苗根和葉片SOD與CAT活性顯著降低；外源Ca2+顯著增加NaCl脅迫下小麥幼苗根和葉片中SOD與CAT活性，但對正常生長小麥幼苗根和葉片SOD、CAT活性無顯著影響；外源施加LaCl3處理導(dǎo)致小麥幼苗根和葉片SOD、CAT活性顯著降低（圖14）。說明外源Ca2+處理增強NaCl脅迫下小麥幼苗抗氧化能力，減少NaCl脅迫對小麥幼苗的氧化損傷。

圖14 外源Ca2+ 對NaCl脅迫下小麥幼苗SOD、CAT活性的影響Fig. 14 Effects of exogenous Ca2+ on the SOD and CAT activities of wheat seedlings under NaCl stress

2.8 外源Ca2+對NaCl脅迫下小麥幼苗PSII的影響

2.8.1 外源Ca2+對NaCl脅迫下小麥幼苗葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響 外源施加CaCl2和LaCl3對正常生長及NaCl脅迫下小麥幼苗進行處理。在處理第5天和第10天（表4）分別測定不同處理組葉綠素?zé)晒鈪?shù)。不同處理組各項葉綠素?zé)晒鈪?shù)在處理第5天和第10天時變化趨勢一致。與對照組相比，NaCl脅迫導(dǎo)致小麥幼苗葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm、Y（II）、qP、F0以及ETR均顯著降低，使葉綠素?zé)晒鈪?shù)NPQ顯著升高；外源Ca2+處理促進NaCl脅迫下小麥幼苗Fv/Fm、Y（II）、qP、F0以及ETR顯著升高，導(dǎo)致葉綠素?zé)晒鈪?shù)NPQ顯著降低，但對正常生長小麥幼苗葉綠素?zé)晒鈪?shù)無顯著影響；外源施加LaCl3處理后，對照組和NaCl脅迫組小麥幼苗各項葉綠素?zé)晒鈪?shù)變化與NaCl脅迫下各項參數(shù)變化趨勢一致，即Fv/Fm、Y（II）、qP、F0和ETR均顯著降低，葉綠素?zé)晒鈪?shù)NPQ顯著升高。說明NaCl脅迫與LaCl3處理均降低小麥幼苗PSII活力，外源Ca2+處理能減弱NaCl脅迫對小麥幼苗PSII損傷。

表4 外源Ca2+對NaCl脅迫5 d和10 d小麥幼苗葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響Table 4 Effects of exogenous Ca2+ on the chlorophyll fluorescence parameters of wheat seedlings after 5 d and 10 d of NaCl stress

2.8.2 外源Ca2+對NaCl脅迫下小麥幼苗葉綠素含量的影響 外源施加CaCl2和LaCl3對正常生長及NaCl脅迫下小麥幼苗進行處理，在處理5和10 d分別取小麥幼苗進行葉綠素含量測定。結(jié)果（表5）顯示，與對照組相比，NaCl脅迫后小麥幼苗葉綠素含量均顯著降低；外源Ca2+處理顯著增加NaCl脅迫下小麥幼苗葉綠素含量，但對正常生長小麥幼苗葉綠素含量無顯著影響；外源施加LaCl3處理后，對照組和NaCl脅迫組中小麥幼苗的葉綠素含量均顯著降低。

表5 外源Ca2+對NaCl脅迫下小麥幼苗葉綠素含量的影響Table 5 Effects of exogenous Ca2+ on the chlorophyll contents of wheat seedlings under NaCl stress

3 討論

3.1 小麥幼苗對NaCl脅迫的生理響應(yīng)及Ca2+緩解NaCl脅迫的生理機制

鹽脅迫是嚴重影響作物生長及生產(chǎn)的主要非生物脅迫之一。當(dāng)植物遭受鹽脅迫時，其體內(nèi)滲透壓會產(chǎn)生變化，導(dǎo)致根吸水能力降低［27］。長時間的鹽脅迫會抑制植物的離子轉(zhuǎn)運和光合作用，最終造成葉片的衰老及死亡［28］。Ca2+作為植物體內(nèi)第二大信使，廣泛參與植物在各種生物脅迫和非生物脅迫下的信號傳遞，調(diào)控植物多種生理代謝過程［29］。NaCl脅迫能引起擬南芥幼苗體內(nèi)胞質(zhì)Ca2+濃度升高，Ca2+通道抑制劑LaCl3和Ca2+螯合劑EGTA均能抑制這種升高［30］。Ca2+信號被感受器感知后參與ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，調(diào)節(jié)氣孔運動以及NaCl脅迫相關(guān)基因的表達［31］。CDPK作為Ca2+感受器，可以直接被Ca2+激活，其表達量的變化可反映植物體內(nèi)Ca2+濃度對脅迫的響應(yīng)［32］。本研究結(jié)果顯示，外源Ca2+可以緩解NaCl脅迫對小麥幼苗生長的抑制作用。NaCl脅迫下小麥幼苗根和葉片TaCDPK27表達量顯著升高，且經(jīng)CaCl2處理后其表達量同樣具有上調(diào)趨勢，而外源施加LaCl3處理后根和葉片TaCDPK27表達量顯著下調(diào)。這些結(jié)果證明TaCDPK27參與調(diào)控外源Ca2+促進NaCl脅迫下小麥幼苗生長的過程。

NaCl脅迫下小麥的根和葉片中均產(chǎn)生過量ROS。其中H2O2和O2·-可以調(diào)節(jié)自噬和PCD［6］。H2O2和O2·-通過誘導(dǎo)自噬來緩解氧化脅迫。而植物體內(nèi)的ROS產(chǎn)生的途徑包括：來源于細胞膜結(jié)合的NADPH氧化酶和葉綠體［33］。Ca2+通過增強細胞膜通透性，加強細胞膜對離子的選擇吸收能力，提高植物的抗氧化酶活性，降低ROS等有害物質(zhì)對植物的傷害［34］。本研究也顯示了相似的結(jié)論。外源Ca2+處理顯著提高了NaCl脅迫下小麥幼苗中葉綠素含量以及促進光合作用的各種葉綠素?zé)晒鈪?shù)，增強其光合作用。同時，外源施加Ca2+導(dǎo)致NaCl脅迫下小麥幼苗中抗氧化酶SOD、CAT活性均顯著升高，有效清除由于NaCl脅迫造成的ROS積累，降低NaCl對小麥幼苗的損害。這些結(jié)果暗示，Ca2+、NaCl脅迫引起的ROS積累，自噬、PCD和葉綠素?zé)晒鈪?shù)間存在復(fù)雜的內(nèi)在聯(lián)系。

3.2 外源Ca2+通過調(diào)控細胞自噬與PCD緩解NaCl脅迫對小麥幼苗的危害

細胞自噬是真核生物中高度保守的過程，通過該過程將細胞質(zhì)中的異常細胞器或蛋白質(zhì)隔離到雙層膜的囊泡中，并傳遞到降解這些物質(zhì)的細胞器中，從而達到回收大分子和確保細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的目的［35］。逆境脅迫下，植物為維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)便會發(fā)生細胞自噬［36］，但自噬活性異常升高會導(dǎo)致細胞死亡，降低植物體內(nèi)細胞活力，增加PCD［37］。ATG在調(diào)控細胞自噬中具有重要作用。ATG能從自噬小體的形成、自噬活性監(jiān)測等方面調(diào)控自噬活性。ATG2為定位于自噬前體液泡周圍的點狀蛋白，具有促進自噬小體延伸和閉合的作用；ATG7是自噬結(jié)合系統(tǒng)和自噬體形成所必需的蛋白，ATG10與ATG5同樣作為參與自噬小體形成的關(guān)鍵因子之一，其表達量上調(diào)有助于促進細胞自噬［38］；ATG8定位于自噬結(jié)構(gòu)膜上，由于其特征性的自噬膜定位而成為監(jiān)測自噬活性的重要靶標［39］。本研究中，NaCl脅迫導(dǎo)致小麥幼苗根細胞自噬，外源Ca2+處理能促進自噬以修復(fù)NaCl脅迫危害，維持細胞穩(wěn)態(tài)；而長時間NaCl脅迫會導(dǎo)致小麥幼苗自噬活性異常升高，外源Ca2+通過抑制自噬活性異常升高以調(diào)控NaCl脅迫對小麥幼苗的危害。這一結(jié)果也通過小麥幼苗根和葉片關(guān)鍵TaATGs表達情況進行了驗證，外源Ca2+處理能有效抑制由于NaCl脅迫144 h導(dǎo)致的小麥幼苗根和葉片中TaATG2、TaATG7、TaATG5、TaATG8和TaATG10表達量上調(diào)，從而降低細胞自噬活性，減少細胞凋亡。細胞中自噬活性升高會導(dǎo)致細胞凋亡［40］。

細胞凋亡是PCD的一種典型機制，在功能上與自噬不同［40］。在許多細胞類型和疾病條件下，激活自噬會抑制細胞凋亡，而抑制自噬則會激活凋亡過程［41］。在某些生理條件下，原本參與調(diào)節(jié)自噬的蛋白也可能誘導(dǎo)細胞凋亡。許多最終導(dǎo)致細胞凋亡的刺激也會在同一細胞中觸發(fā)自噬。自噬首先發(fā)生，隨著脅迫因子的持續(xù)存在，可能會導(dǎo)致細胞凋亡［35］。此結(jié)論在本研究中得到驗證，當(dāng)小麥幼苗持續(xù)遭受NaCl脅迫144 h時，根和葉片自噬活性異常升高導(dǎo)致細胞死亡，同時PCD也顯著升高，細胞活力下降。外源Ca2+處理顯著降低NaCl脅迫下小麥幼苗根和葉片死亡細胞及PCD。由于NaCl脅迫下小麥幼苗根和葉片細胞內(nèi)Ca2+與Na+濃度增加，導(dǎo)致植株啟動自身防御機制，發(fā)生細胞自噬，當(dāng)NaCl脅迫持續(xù)144 h后，細胞內(nèi)Na+持續(xù)積累，自噬活性異常升高，造成細胞死亡，且PCD升高，使小麥幼苗生長受到抑制；外源Ca2+對NaCl脅迫下小麥幼苗處理后，胞內(nèi)Ca2+濃度升高導(dǎo)致其Na+濃度降低，NaCl對小麥幼苗的脅迫作用減輕，細胞內(nèi)自噬小體適量減少，自噬活性降低，死亡細胞減少同時PCD下降，從而減弱NaCl脅迫對小麥幼苗的傷害。

4 結(jié)論

Ca2+通過調(diào)控小麥幼苗根和葉片的自噬水平限制PCD的規(guī)模，緩解NaCl脅迫對小麥幼苗的損傷。NaCl脅迫誘導(dǎo)小麥根和葉片自噬與Ca2+信號、氧化應(yīng)激、光合反應(yīng)之間存在著密切關(guān)系。