空間分辨代謝組學在疾病診斷研究中的應用進展

何詩瑜 曾仲大 李博巖

（1. 貴州醫科大學公共衛生與健康學院，貴陽 550025； 2. 大連大學環境與化學工程學院，大連 116622）

代謝組學（metabolomics）是繼基因組學和蛋白質組學之后新近發展起來的一門學科。它是以組群指標分析為基礎，以高通量檢測和數據處理為手段，以信息建模與系統整合為目標的系統生物學的重要組成部分，盡可能對某一生物或細胞在特定生理時期內所有低分子量代謝產物進行定性和定量分析。與基因組學、蛋白質組學和轉錄組學相比，代謝組學最接近生物表型，更能直觀地反映生物或細胞的生理或病理狀態［1］。因此，代謝組學發展迅速并滲透到多項領域，比如疾病診斷、醫藥研發、營養食品科學、毒理學、環境學、植物學等與人類健康護理密切相關的領域［2-4］。然而，生物體內代謝物的產生、累積和消耗的全過程常伴隨著時空特征的變化，并影響著生物體的生理功能［5］。基于色譜-質譜聯用技術的傳統代謝組學，具有高敏感度、高選擇性、高分離效率、動態范圍寬、信息豐富等特點［6-7］，但往往不可避免地在樣本前處理過程中幾乎完全丟失了代謝物的空間分布信息，導致該技術在生物體的狀態及功能分析中存在一定的局限性。因此，如何獲取代謝物在時間和空間上的異質性是破譯生物體復雜的生理病理變化的關鍵。

2007年Watson等［8］首次提出基于激光切割顯微鏡技術的空間分辨代謝組學（spatially resolved metabolomics，SRM）。經過十幾年的快速發展和技術更新，越來越先進的成像技術使得SRM成為研究生命科學領域中植物、動物組織以及單細胞等結構和功能的強大工具［2,9-11］。圖1描繪了空間分辨代謝組學的發展歷程。簡單來說，空間分辨代謝組學是利用高靈敏度、高分辨率的質譜成像技術產生數據，以化學計量學、生物信息學和多組學等綜合方法為支撐，研究動物、腫瘤、植物等組織中各種代謝路徑的底物和產物的小分子代謝物，從高覆蓋度的數據中識別高特異性、高異質性信息，解析疾病分子機制、發育學、腫瘤代謝與免疫、分子病理診斷、腫瘤耐藥與精準用藥、環境毒理學、新藥藥理和毒理、基因調控機制、植物藥用成分定位，從而解決醫學、農林牧漁領域難題的新型分子成像組學技術［12-13］。空間分辨代謝組學在疾病診斷和尋找生物標志物等方面展現出較好的潛力，如輔助診斷結直腸癌［14］、乳腺癌［15］、前列腺癌［16］、非小細胞肺癌［17］及糖尿病腎病［18］等。本文總結了近年來代謝組學、質譜成像技術、空間分辨代謝組學的研究現狀及其在疾病診斷上的應用進展，并展望空間分辨代謝組學的應用前景，以期為空間分辨代謝組學在疾病診斷、疾病分子機制研究以及藥物研究開發等領域的應用提供參考。

圖1 空間分辨代謝組學發展歷程圖Fig. 1 Brief timeline of spatially resolved metabolomics

1 空間分辨代謝組學

1.1 代謝組學

代謝組學研究最早始于20世紀末，首次由Nicholson等［19］提出并將其定義為研究生物體、組織或細胞在一定條件下實施前后的低分子量代謝產物（100-1 500 Da）的定性及動態變化的定量測定［20］。該技術可對生物體生理病理改變與代謝產物間關系進行系統性分析［21］。代謝組學可通過對病理變化的生物體、組織或細胞中的代謝物譜、代謝表型、代謝變化、代謝途徑與正常個體間進行差異分析，從而發現具有特定識別作用的生物標志物，并將獲取的生物標志物作為疾病診斷或風險評估的指標［22］。代謝組學研究方法主要包括兩種。一種是采用液相色譜-質譜等技術的代謝物指紋分析（metabolomics fingerprinting），涉及比較不同個體中代謝產物的質譜峰，最終了解不同化合物的結構，建立特征化合物識別的分析方法。另一種是代謝輪廓分析（metabolomics profiling），通過假定特定的代謝途徑深入探討代謝機制問題。例如，Brindle等［23］利用核磁共振儀獲取冠心病患者血樣中的內源代謝物譜及數據，建立了高效準確的冠心病診斷模型，對冠心病進行了分期分類，為早期冠心病預防、發現，以及診斷提供了一定的參考。Denkert等［24］用GC-TOF-MS技術發現結腸癌組織代謝物的顯著差異性。Sreekumar等［25］利用LC-GC-MS技術檢測尿樣和血漿，通過得到的代謝物譜判斷前列腺癌的發生發展。越來越多的研究表明多種疾病與組織細胞所處的環境、營養狀態以及代謝活動息息相關，因此，從代謝物層面開展疾病診斷的組學研究具有廣泛的應用前景。

1.2 質譜成像技術

代謝組學研究最常用的分析技術是色譜-質譜聯用，其中極性代謝物在液相色譜-串聯質譜（LCMSn）中有較好的相容性，能夠在單次分析中獲得數千種代謝物信息，使得LC-MSn在血液、尿樣和細胞等生物樣本的代謝組學分析中占據重要地位。但是，該技術需要先從具有代表性的組織器官樣本勻漿中提取分子物質，經過液相分離、純化、富集過程，再進行定性定量檢測，最終得到代謝物平均水平。這些復雜的處理過程不僅破壞了樣品的原有組織結構，丟失了代謝物在組織中的空間分布信息，還會掩蓋相關代謝物的特異性或異質性。而質譜成像（mass spectrometry imaging, MSI）是一種以質譜為基礎的新型分子影像技術，能夠直接在組織或細胞水平獲得大量已知或未知的內源性代謝物和外源性藥物等分子的結構、含量和空間分布信息，具有高靈敏度、無需標記、可視化檢測、覆蓋范圍大、高特異性、高通量和空間信息保留等突出優點（表1），率先被運用于蛋白組學和脂質組學研究［26-27］。MSI技術結合生物信息學，發展成為空間代謝組學方法，突破了傳統代謝組研究損失空間信息的瓶頸，可實現生物組織中上千代謝物的定性、定量和定位分析［3］，從生物組織原位發現差異代謝物，并識別其生物學功能。例如，使用MSI技術研究脂類代謝物的含量變化與腫瘤疾病間的關聯性［28］發現，藥物作用靶點和生物標志物以及助力腦神經類疾病的診治等［29］。

表1 常用代謝組學檢測方法Table 1 Typical metabonomic detection methods

根據離子源的不同，MSI技術可分為基質輔助激光解吸電離質譜成像（matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging, MALDI-MSI）、二次（次級）離子質譜成像（secondary ion mass spectrometry imaging, SIMS imaging）、激光濺射電噴霧電離質譜成像（laser ablation electrospray ionization mass spectrometry imaging, LAESI-MSI）、解吸電噴霧電離質譜成像（desorption electrospray ionization mass spectrometry imaging, DESI-MSI）、空氣動力輔助解吸電噴霧電離質譜成像（airflow-assisted desorption electrospray ionization mass spectrometry imaging, AFADESI-MSI）等（表2）。MSI離子源的工作原理如圖2所示。其中，MALDI-MSI具有穩定性好、靈敏度高、受干擾小、空間分辨率可達1.4 μm的特點，是目前主流且應用最廣泛的質譜成像技術［30-31］。MALDI-MSI的原理是基質分子能從波長為337 nm或355 nm的紫外激光中吸收能量，與樣品成為共晶體或成為附著樣品的薄膜，樣品由基質提供的能量發生電離，通過檢測不同質荷比的樣品碎片而獲取樣品物質的分子量信息。對于含水量大的樣本可采用LAESI-MSI技術，其利用樣本中所含的水作為基質，避免了復雜基質的干擾，并采用電噴霧（ESI）促進電離，降低了對樣本制備的需要，提升了樣本檢測效率且其空間分辨率達100 μm［32］。SIMS-MSI技術的空間分辨率最高，其中動態SIMS能達到20-50 nm的超高空間分辨率。但因其使用的高能濺射離子束束流極大，易將分子破壞為原子離子，無法獲取完整的分子信息，故在代謝物成像上的應用并不廣泛。靜態SIMS能夠獲取部分小分子物質，一般分子量不超過1 000 Da，如代謝物、脂質類等化合物信息，其在多數情況下以飛行時間二次離子質譜成像（timeof-flight SIMS imaging, TOF-SIMS imaging）廣泛應用在生命科學領域［33］。DESI-MSI與前二者不同，可在常壓下完成待測物的離子化與成像。然而，其空間分辨率約為200 μm，限制了DESI-MSI技術在實際的空間分辨代謝組學中的應用［34］。再帕爾·阿不力孜等在DESI-MSI的基礎上升級并研發了新型常壓敞開離子化質譜成像技術AFADESI-MSI［35-36］。該方法具有高靈敏度、高特異度、高覆蓋度以及普適無針對性等優點，能可視化分析多種代謝物的原始空間分布，極大地有助于開展分子組織學與分子病理學研究。

表2 常用質譜成像技術Table 2 Typical mass spectrometry imaging techniques

圖2 常見MSI離子源示意圖Fig. 2 Schematic diagram of typical mass spectrometry imaging ion sources

1.3 空間分辨代謝組學

代謝組學的迅速發展讓人們對其充滿期待：尋找新的生物標志物，發現新的代謝途徑，或者更加深入地了解已知的代謝途徑。然而，識別代謝產物并進一步確認所有代謝物的功能卻是代謝組學研究的最大挑戰。主要原因是傳統代謝組學側重于相關特定代謝產物的共性研究，組織樣本中各組分的同質性和均勻性與最終要涉及研究的各個代謝組分的共性、特性和規律的目標相距甚遠。于是，研究人員嘗試從代謝物的時間和空間含量變化著手，將高分辨成像技術引入代謝組學［9］，闡述代謝物的時空分布特征，進而反映生物體生理病理變化。例如，Sun等［11］利用MSI技術可視化癌組織中差異代謝物在空間上的區域特異性分布，使研究對象從組織、器官水平向單細胞水平拓展，從點到面地獲取多維度代謝物信息［37］。由此出現了空間分辨代謝組學或稱為空間代謝組學，并逐漸成為當前研究的熱點之一［38-39］。空間代謝組學的關注點是：（1）內源性代謝物和外源性物質，（2）結構復雜和高異質性的生物組織或器官中小分子代謝產物的定性、定量、定位分析，（3）各種代謝物在不同時間點的原位分析，（4）差異性代謝物結構、含量、動態變化及空間分布特征，（5）代謝物的上調或下調指示與疾病、毒性、基因修飾或環境因子的影響，（6）生物標志物用于疾病的診斷和藥物的篩選。空間分辨代謝組學憑借全景描繪生物體系中代謝相關分子時間動態變化和空間分布特征的能力，與生理學的聯系更為緊密。疾病導致機體病理生理過程變化，最終引起代謝產物發生相應的改變，通過分析某些代謝產物，尋找疾病的生物標志物，可以提供一種較好的疾病診斷方法。圖3概括了空間分辨代謝組學研究的基本工作流程。空間分辨代謝組學有助于解決疾病分子機制、腫瘤代謝、免疫及分子病理診斷等有關的生物學問題，在臨床疾病診斷應用中備受關注，為組織代謝異質性識別和細胞分子可視化分析提供了新視角和創新手段。

圖3 空間分辨代謝組學工作流程圖Fig. 3 Workflow of spatially resolved metabolomics

2 空間分辨代謝組學研究現狀及其在疾病診斷中的應用

2.1 空間分辨代謝組學在腫瘤診斷上的應用

與腫瘤相關的疾病已經成為重大的公共衛生與健康問題，給患者、家屬以及社會都造成持續的巨大經濟負擔。代謝組學通過運用現代儀器技術獲取高通量數據，定性定量分析代謝物信息，在高特異性的生物標志物的篩選方面發揮著重要的作用，有效地輔助腫瘤相關疾病的快速診斷和治療。空間分辨代謝組學可以直接定位代謝物的空間分布，對代謝物進行可視化檢測。尤其是空間分辨代謝組學的“下游代謝物與上游代謝酶關聯”策略的提出，使得腫瘤代謝信息改變表征可視化成為可能，因而發現了與腫瘤細胞相關的小分子差異代謝物，了解到癌癥的分子分型和腫瘤異質性［11,13］。異質性甲狀腺乳頭狀癌的空間代謝組學研究表明腫瘤組織與其相鄰的正常組織之間的代謝產物中氨基酸和肌酐的表達存在差異［40］。食管鱗癌中與腫瘤密切相關表達異常的6種代謝酶中的吡咯啉-5-羧酸還原酶家族成員2（PYCR2）和尿苷磷酸化酶1（UPase1）在癌組織中存在差異性表達［11］，預示可通過下游代謝物來獲取上游代謝酶的變化，從而了解疾病的代謝途徑。Andersen團隊借助MALDI-TOF MSI檢測前列腺癌冷凍組織核心樣本，觀察到樣本的不同組織區域具有不同的代謝特征與代謝物水平，用MSI在人體前列腺癌組織中檢測到精胺減少，將發現的差異代謝物與脂質（溶血卵磷脂LPC）用作診斷前列腺癌和判斷預后的生物標志物［16］，證明了MSI空間代謝組學能夠提供病理組織和正常組織間代謝物的水平差異和空間信息，是臨床上診斷疾病潛在有力的創新工具。Sun等［41］利用空間分辨代謝重新編碼，對乳腺癌中肉堿的新陳代謝進行了可視化分析發現，肉堿棕櫚基轉移酶spa1A（CPT 1A）、肉堿棕櫚基轉移酶2（CPT 2）和肉堿乙酰轉移酶（CRAT）表達異常，為腫瘤的早診斷提供了新思路。Chen等［14］利用AFADESI-MSI技術對9對人類結直腸腺瘤/腫瘤和癌旁活檢組織樣本進行空間代謝組學分析發現，腺瘤/腫瘤組織中的N,O-雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺豐度有所上調，并在結直腸異常的患者血清中觀察到該代謝物的變化。非靶向與靶向代謝組學分析結果發現結直腸異常與代謝特征存在關聯性，可用于診斷結直腸腺瘤及結直腸癌。

很多腫瘤相關疾病的研究表明生物分子豐度的空間信息與變化能反映疾病的發生發展，例如可作為早期癌癥診斷的生物標志物的脂質類化合物［42］，其組成的復雜性和多樣性致使在檢測與定量分析方面存在困難。然而，MSI通過可視化癌癥組織中的脂質分布與豐度變化，在很大程度上能夠克服這樣的困難［43］，深入了解癌癥的發展與診斷。DESI-MSI用于區分胰腺癌和正常胰腺組織發現，癌組織中多不飽和脂肪酸的相對豐度較高，如花生四烯酸（m/z 303.3）和腎上腺素酸（m/z 331.2）［44］。通過檢測脂質相對豐度的差異結合組織病理診斷學快速鑒別胰腺癌組織，指導胰腺癌診斷和治療。利用DESI-MSI在200 μm的空間分辨率下原位觀察人類黑色素細胞瘤組織內大量極性和非極性脂質的特異性分布，與免疫組化技術和多元統計分析相結合，確定膽固醇為診斷黑色素細胞瘤的潛在生物標志物［45］。此外，研究發現在人類腎臟的近端小管區域及皮質、髓質等組織中的N-聚糖與腎透明細胞癌（clear cell renal cell carcinoma, ccRCC）的發展密切相關［46］，可特異性地判別腫瘤，揭示了MSI具有被應用在鑒別和診斷腫瘤上的可能性。

2.2 空間分辨代謝組學在神經精神疾病上的應用

近年來有關神經精神疾病早期診斷的研究表明空間分辨代謝組學可辨別不同疾病間的差異性代謝物，發現了用于輔助疾病診斷的生物標志物［47-48］。Pang等［49］利用AFADESI-MSI技術映射正常大鼠、阿爾茲海默病（Alzheimer’s disease, AD）大鼠及東莨菪堿給藥治療的AD大鼠腦組織中的代謝網絡，鑒定出腺嘌呤、透明質酸、磷酸乙醇胺等20余種異常代謝產物，了解到這些代謝產物的含量變化與其在大腦微區中的分布有關［50-51］，為神經退行性疾病診斷提供了新的可能性。癲癇是一種腦部慢性非傳染疾病，影響全球眾多人口健康，其中尤以顳葉癲癇（temporal lobe epilepsy, TLE）最為普遍。利用DESI-MSI空間分辨代謝組學分析患者大腦海馬體中的代謝物質，了解到造成癲癇疾病的可能原因是Kennedy代謝途徑失調導致磷脂酰膽堿（PC）和磷脂酰乙醇胺（PE）的表達降低［52］。在空間分辨代謝組學探討多發性硬化癥發生機制研究中發現，多發性硬化中再髓鞘化形成的新髓鞘與正常髓鞘間存在不同的脂質結構和成分［53］，這些物質可以輔助疾病診治。Vendramini等［54］通過DESI-MSI技術驗證了精神分裂癥患者腦中的磷脂酰膽堿含量差異與膜磷脂分解導致該物質含量降低的一致性。精神分裂癥患者對抗精神病藥物的耐藥性的MSI研究［55］說明SRM具有用于精神疾病臨床診斷的可能性。應用MSI檢測創傷性腦損傷（traumatic brain injury, TBI）前后脂質表達發現，傷后不同時期的小膠質細胞分泌酰基肉堿在同側黑質中的豐度上調，而黑質是帕金森病（Parkinson’s disease, PD）主要的受累區域［56］，表明借助空間分辨代謝組學開展TBI和PD的診治研究是很有前途的策略。

2.3 空間分辨代謝組學在糖尿病及其并發癥上的應用

糖尿病（diabetes mellitus, DM）是一類以高血糖為特征的代謝性疾病，會導致失明、腎衰竭、心臟病發作、中風和下肢截肢等嚴重并發癥。糖尿病及其并發癥造成全球每年超過200萬人死亡。因此，早預防早發現早管理是預防或延緩糖尿病發病診治的關鍵。利用鏈脲佐菌素誘導大鼠發生I型糖尿病，干擾兩周后取早期糖尿病大鼠模型腎臟進行空間分辨代謝組學分析，結果顯示早期糖尿病大鼠多不飽和脂肪酸和單酰基甘油含量增加，部分短鏈和長鏈的酰基肉堿積累［57］。Miyamoto等［58］借助MALDI-MSI技術發現鞘磷脂大量積累促使ATP產生，導致糖尿病腎臟中腎小球三磷酸腺苷與單磷酸腺苷（ATP/AMP）比例增加，鞘磷脂可能是糖尿病診治的潛在靶點。Wang等［18］對糖尿病腎病（DN）組織代謝物進行重新編碼，利用AFADESI-MSI識別、可視化檢測由高脂飲食喂養的鏈脲霉素（STZ）處理的DN鼠模型。以小鼠腎臟整體的代謝變化為觀察指標，通過MALDI-MSI繪制出腎臟皮質中特異性代謝物的定位含量分布，觀察到DN組大鼠的腎皮質、外延髓、間延髓明顯不同于對照組大鼠的腎皮質、外延髓、間延髓，STZ誘導的糖尿病大鼠在這些區域發生了不同的代謝改變。Zhang等［59］通過比較不同方式誘導的DN大鼠模型，證實不同方式誘導下代謝物確實存在區域性差異。所以，利用空間分辨代謝組學可原位鑒別腎臟中病變組織與正常組織間的代謝異常及代謝紊亂的特點，為糖尿病腎病的診斷提供重要的輔助作用。Huo等［60］通過空間分辨代謝組學對糖尿病大鼠腦中的牛磺酸、抗壞血酸、組氨酸等代謝產物進行定位、定性和相對定量分析發現，糖尿病腦病（DE）大鼠的脂質代謝在特定區域發生紊亂以及存在差異代謝物。Meng等［61］利用AFADESIMSI技術檢測到DE大鼠大腦皮層、海馬體和杏仁核中的脂肪醛（FALs）存在特異性分布和富集情況，是導致DE認知功能缺陷的可能原因，為找到診斷糖尿病腦病的新型特異性生物標志物以及對厘清DE潛在發病機制提供了新見解。

2.4 空間分辨代謝組學在其他疾病上的應用

空間分辨代謝組學也被應用在其他疾病的診治中（表3）。例如，Tans綜述了質譜成像技術與高空間分辨率代謝組學研究傳染病的發病機制［62］，為高危人群傳染病的早期發現與診斷提供了新思路。Fincher等［63］基于硅納米柱陣列的激光解吸電離質譜成像平臺（NAPA-LDI-MSI）對化膿性汗腺炎（HS）病人的皮膚組織與健康人類皮膚組織進行原位檢測和無標記分子成像發現，HS病人皮膚組織中的中性脂質成分（如半乳糖基-/乳糖基神經酰胺、甘油三酯等）表達更為顯著，以此區分HS病患和健康人群。空間分辨代謝組學也為乙型肝炎感染發病機制研究提供了新方向，例如，Park等［64］利用MALDI-MSI技術建立乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）急性感染期的小鼠模型發現，HBV感染小鼠中磷脂酰膽堿（PC）組成和表達變化可作為乙肝感染早期診斷的潛在標志物。動脈粥樣硬化是由脂質和炎癥誘發的動脈疾病，其特征是血管壁中斑塊逐漸累積形成血栓致使心臟或大腦缺血。通過MALDI-MSI可視化人頸動脈斑塊脂質異質性，有助于預防和診治動脈粥樣硬化疾病。另外，非靶向空間分辨代謝組學用于分析人類口腔的唾液成分，繪制出唾液中代謝產物特定的空間分布網絡［65］，通過可視化檢測不同口腔疾病的代謝產物變化，關聯代謝產物與口腔疾病診斷。

表3 空間分辨代謝組學在疾病診斷中的應用Table 3 Applications of spatially resolved metabolomics in disease diagnosis

3 空間分辨代謝組學應用的挑戰

基于質譜成像技術的空間分辨代謝組學，通過高空間分辨率定性定量分析組織或器官中代謝物的分布，得到疾病相關的分子數據，并根據代謝物含量和特征分布，分析疾病分類分型、診治及制定預后策略。但該技術在很大程度上受樣品收集、制備、存儲，空間分辨率，儀器靈敏度，以及數據統籌處理的影響，因此限制甚至阻礙了其在臨床上的推廣應用。

3.1 樣品收集、制備與保存

利用MSI技術的空間分辨代謝組學研究實驗中，樣品的收集與制備至關重要［86］，是實現高分辨成像的關鍵。傳統代謝組學一般以血液、尿液、組織、糞便等為樣本，取樣后進行勻漿處理，幾乎完全掩蓋了樣本異質性的代謝物信息［87］。經過基質包埋處理的新鮮組織樣本切片或者冷凍組織切片采用拉伸法在兩個方向上均勻拉伸用封口膜固定在載玻片上［88］，然后直接進行組織切片的質譜成像掃描。樣本收集、制備過程的最大挑戰之一是確保經MSI映射的分子空間位置與生物組織的結構區域和功能區域的特異性分布一致［89］。即要求樣品收集、制備、處理過程必需足夠快，防止生物分子降解和離域，保證樣品中物質的完整性、不丟失其空間信息［90］。因此，生物樣品采集后須及時制成基質包埋的新鮮組織切片，在冷凍條件下存儲，以保持樣品的原組織形態，降低生物分子內源性酶蛋白的水解，減緩生物分子氧化以及防止細胞、組織或器官中代謝物變化或離域。一般取到組織后，從開始包埋到放入-80℃冰箱的時間，需要控制在5 min內。盡量避免樣品破裂，或由于組織中不同部分以不同的速度冷卻，形成冰晶而使樣品損壞。福爾馬林浸泡、石蠟包埋、HE染色、熒光標記等處理過的樣本不適合空間分辨代謝組學分析，也不建議用PBS或者生理鹽水浸泡樣本［91］，因為基質的添加容易造成被測物質空間位移、低分子量代謝物受干擾和重復性差等問題，同時阻礙MSI中分子解吸和電離。此外，制備過程中因樣本類型不同和采用檢測離子源不同，在收集、制備和存儲環節的復雜性也各不相同。因此，選取合適的方法才能使樣品更好地滿足MSI技術分析。

3.2 空間分辨率、檢測靈敏度和成像速率

空間分辨率越高，成像譜圖越精細，更易發現差異代謝物，更好揭示組織代謝的異質性。因此，提高空間分辨率是實現高分辨質譜分析和得到精細準確的代謝物信息的關鍵。空間分辨率與離子源檢測的單位離子化面積大小相關，電離面積越小，分辨率越高，故提高空間分辨率需要減小采樣的離子束或激光束直徑。但是隨著離子化面積的減小，離子產量也會下降，即可用分子量隨之減少，后果是造成檢測靈敏度降低和成像速率減慢。因此，靈敏度也是高分辨率成像的重要因素。開發新的超靈敏檢測器或提高離子產量是解決靈敏度問題的手段。Bookmeyer等［92］為改善量測脂質類代謝物時所產生的離子抑制效應，在MALDI-MSI的基礎上增加了單光子誘導化學電離（single-photon-induced chemical ionization, SPICI），能將代謝物的信號強度提高了3個數量級，并且降低了正離子模式下的背景干擾，是高效準確代謝物的低成本檢測的新方法。俘獲離子遷移譜（TIMS）與MALDI-MSI結合技術大大提升了脂質類代謝物檢測的信噪比［93］。Mou等［94］提出的基于納米分辨質譜顯微成像技術，清晰區分細胞中細胞膜、細胞質和細胞核中的物質分布，捕捉單細胞中的差異性代謝物，有期望成為空間單細胞代謝組學分析的實用工具。另一方面，成像時間隨著高分辨率呈指數增長。TOF-SIMS imaging是目前成像最快的技術，每秒可達50 000像素，而MALDIMSI成像速度通常低于40像素/s。成像速率越慢，分析時間越長，樣品分析效率就越低［5］。現階段既要求MSI技術具有高空間分辨率又不損失靈敏度和成像速率，還能對低豐度的代謝產物進行高覆蓋成像分析，是存在一定難度的，也是該技術發展必需面對和改進的關鍵問題。

3.3 定量分析能力

雖然MSI技術擁有出色的代謝物定性能力，但由于存在離子抑制效應、基質效應、電離效率不均、缺乏標準、樣品異質性和表面形態起伏等問題，使得代謝物的準確定量并不容易。目前，MSI技術是通常采用樣本內標或參照選定的內源性分子的含量，通過MSI信號強度進行數學換算來獲取其他樣本分子的相對定量策略。該方法分析步驟復雜，也易受樣本自身差異的干擾，會影響定量結果的準確性和精確性。雖然采取總離子流歸一化處理方法以提高定量的準確性［95］，但并不能很好地降低基質效應帶來的偏差。Lewis等［96］利用同位素標記內標法在一定程度上規避了基質效應的影響，但很難確定樣本中的內標分布的均勻性。因此，發展絕對定量的MSI技術（QMSI）［97］是提升和推廣MSI技術應用的重要研究方向。

3.4 數據存儲、管理與分析處理

相較于傳統代謝組學方法，MSI在代謝物信息提取、整合、數據處理及精準定性分子類型等方面都取得了一定程度的提升和發展。但它不可避免地產生高度復雜的多維數據集，如數據量高達數TB，還要求對高分辨率數據進行高效快速處理和智能存儲，使得空間分辨代謝組學實際操作變得更加困難，需要更復雜的算法［98-99］。解決這些需求大大地超過了目前的技術能力。解讀高維數據、分析出所對應的空間異質性，還需要具備扎實的專業綜合知識，數據分析過程耗時耗力，所以，降維處理、分析數據是至關重要的［100］。同時，解釋樣本中檢測的差異和確定樣本間或樣本內空間分布是否存在差異性，需要對大型成像數據集進行統計分析，如主成分分析、層次聚類分析和偏最小二乘判別分析等，判斷結果是否具有實際意義，也尤為重要。最后，空間分辨代謝組學所面臨的一個巨大挑戰是需要選擇先進的方法有效整合不同模式的數據，消除使用不同平臺以及軟件處理分析數據時產生的差異性結果［101］，更好地服務于疾病的診斷治療應用。Rappez等［102］和Yuan等［103］分別建立了SpaceM、SEAM平臺，供以解決空間分辨代謝組學產生的數據分析難題。一些開源工具包的開發與應用，也為空間分辨代謝組學數據的深層解析提供了便利［39］。

4 總結與展望

空間分辨代謝組學不僅具有質譜成像技術高靈敏度、高分辨率、便于可視化表達等優點，還能夠對代謝物進行直接原位定性、定量、定位分析。通過代謝物在病理組織中的空間分布異質性，篩選出疾病相關的特異性生物標志物，為疾病的診療提供一定的輔助診斷作用。此外，空間分辨代謝組學技術的高靈敏度、高分辨率、高通量分析能力等特點使其在藥物篩選以及療效觀察等領域具有較好的應用前景。目前，空間分辨代謝組學仍處于早期發展階段，需要更貼合MSI的樣本收集、存儲與制備方法，空間分辨率和檢測靈敏度相制衡的技術以及優化的數據處理和存儲平臺，建立機體中的完整代謝途徑圖譜。相信隨著MSI技術的發展和代謝組學的不斷完善、優化，獲得的代謝物信息將具有更好的準確性、特異性和系統性，有助于加深理解代謝產物的含量、結構和空間分布以及其在疾病發生發展中的影響機制。空間代謝組學必將成為人類更高效、準確診斷疾病的一種有力手段，在推動精準醫學和個性化診療方面發揮更大的作用。