高效液相色譜-熒光法測(cè)定飼料中維生素B1 和維生素B2

唐 雯， 黃 媛

（福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，福建 福州 350015）

作為飼料添加劑， 維生素B1和維生素B2對(duì)養(yǎng)殖業(yè)具有至關(guān)重要的作用。 維生素B1參與營(yíng)養(yǎng)代謝，影響動(dòng)物心腦功能，同時(shí)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)也有重要作用（王仁華等，2016；王寶維等，2014）。維生素B2是促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育， 維持機(jī)體健康的必需微量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)禽類(lèi)產(chǎn)蛋性能等具有很大影響（徐蕾蕾等，2019；張海濤等，2017）。因此，飼料中維生素B1和維生素B2含量的測(cè)定，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)投料多寡具有極大參考價(jià)值。 目前，對(duì)其分析測(cè)定的方法主要有分光光度法（江蔓等，2016；郭亞?wèn)|等，2004；李松青等，2001）、微生物法（Salvetti等，2003）、高效液相色譜法（嚴(yán)華等，2022；索德成等，2015；崔容等，2005）等。 分光光度法、微生物法都存在操作復(fù)雜，檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)的缺點(diǎn)。 而高效液相色譜法具有高效、快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，尤為適用于對(duì)飼料中維生素B1、維生素B2的測(cè)定。運(yùn)用高效液相色譜法測(cè)定飼料中維生素B1、維生素B2的研究較多，但對(duì)其二者的測(cè)定方法多為紫外檢測(cè) （張憬等，2018； 梁琳等，2016； 吳淑君，2002），且樣品前處理多采用提取液超聲提?。ǚ鹑A等，2017；邢磊等，2016）。 維生素B1的紫外吸收較弱，紫外響應(yīng)小，干擾大，對(duì)儀器的性能要求高， 且對(duì)含量較低的樣品測(cè)定準(zhǔn)確度降低；維生素B1和維生素B2的提取液不同（國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局，2019； 國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局，2018）， 導(dǎo)致同一樣品需要分批處理， 工作量增大，不利于工作的開(kāi)展。 本方法利用高溫高壓法對(duì)飼料進(jìn)行提取， 隨后對(duì)維生素B1進(jìn)行衍生化操作，統(tǒng)一兩者流動(dòng)相，運(yùn)用熒光法測(cè)定維生素B1和維生素B2， 旨在為飼料中維生素B1和維生素B2含量監(jiān)控測(cè)定提供有效保障。

1 材料與方法

1.1 儀器超高效液相色譜儀Waters ARC HPLC（配熒光檢測(cè)器），美國(guó)Waters 公司；壓力蒸汽滅菌鍋，上海東亞壓力容器制造有限公司；Sartorius BSA 224S 電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；高速臺(tái)式離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；IKA MS 3 basic 單發(fā)渦旋振蕩器，上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試劑 維生素B1（99.09%， 斯坦福分析化學(xué)）、維生素B2（97.36%，德國(guó)DR）；甲醇、乙酸鈉、鹽酸、正丁醇、鐵氰化鉀（分析純，上海滬試化工有限公司）；氫氧化鉀（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。 實(shí)驗(yàn)用水為一級(jí)水。

1.3 色譜條件 色譜柱：中譜紅RD-C18 （150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.05 mol/L 乙酸鈉-甲醇=65∶35（V/V）；流速：1.0 mL/min；柱溫： 35 ℃；檢測(cè)器：熒光檢測(cè)器；進(jìn)樣量： 10 μL；波長(zhǎng)：維生素B1（激發(fā)波長(zhǎng)375 nm、發(fā)射波長(zhǎng)435 nm）；維生素B2（激發(fā)波長(zhǎng)462 nm、發(fā)射波長(zhǎng)522 nm）。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及測(cè)定 維生素B1儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱(chēng)取維生素B1標(biāo)準(zhǔn)品0.02 g， 用0.01 mol/mL鹽酸溶液定容至25 mL。 維生素B2儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱(chēng)取維生素B2標(biāo)準(zhǔn)品0.01 g， 用0.01 mol/mL 鹽酸溶液定容至100 mL。維生素B1、維生素B2混合中間液： 準(zhǔn)確移取維生素B1儲(chǔ)備液1.00 mL，維生素B2儲(chǔ)備液10.00 mL，用0.01 mol/mL 鹽酸溶液定容至100 mL。維生素B1、維生素B2標(biāo)準(zhǔn)溶液圖譜見(jiàn)圖1 和圖2。

圖1 0.30 μg/mL 維生素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液（衍生后）色譜圖

圖2 0.50 μg/mL 維生素B2 標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

1.5 樣品制備及測(cè)定 前處理：稱(chēng)取適量樣品置于150 mL 錐形瓶中， 加入1 mL 50% 鹽酸溶液，加入80 mL 水， 搖晃錐形瓶使樣品與水混合均勻。 將混合后的樣品置于高溫滅菌鍋中121 ℃高溫提取30 min。待樣品徹底冷卻后，用150 g/L 氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)樣品pH 為5 ～6。 用水將樣品轉(zhuǎn)移并定容至250 mL 容量瓶，作為備用液。

維生素B1測(cè)定：取備用液2.0 mL 于試管中，加入1.0 mL 2 mg/mL 堿性鐵氰化鉀溶液，渦旋混合10 s，加入5 mL 正丁醇萃取，渦旋混合10 s，靜置5 min。 取上層溶液1000 r/min 離心3 min 后，吸取上層清液上機(jī)測(cè)定。 另取標(biāo)準(zhǔn)溶液同法衍生后上機(jī)。

維生素B2測(cè)定： 取備用液過(guò)0.45 μm 濾膜后，上機(jī)測(cè)試。

2 結(jié)果與分析

2.1 線(xiàn)性關(guān)系及范圍 取混合中間液0.200、1.00、2.00、10.0、20.0 mL，分別用水定容至50 mL。配制為標(biāo)準(zhǔn)溶液工作曲線(xiàn)。 色譜結(jié)果以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），濃度為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算得到線(xiàn)性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)（表1）。

表1 維生素B1、維生素B2 回歸方程及線(xiàn)性范圍

2.2 方法檢出限及定量限 以3 倍信噪比（S/N）作為方法檢出限，以10 倍信噪比（S/N）作為方法定量限，維生素B1的檢出限為0.04 mg/kg，定量限為0.15 mg/kg；維生素B2的檢出限為0.06 mg/kg，定量限為0.18 mg/kg。

2.3 加標(biāo)回收 選取已知維生素B1、 維生素B2含量的飼料為基質(zhì)， 分別進(jìn)行不同水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，各加標(biāo)水平重復(fù)6 次實(shí)驗(yàn)，維生素B1、維生素B2的平均回收率均大于90%，RSD 均小于2.5%（表2）。

表2 飼料基質(zhì)中維生素B1、維生素B2加標(biāo)回收結(jié)果（n=6）

3 討論

本方法與國(guó)標(biāo)法的對(duì)比結(jié)果表明，國(guó)標(biāo)法測(cè)定維生素B1需要根據(jù)不同的飼料類(lèi)型選用不同的提取液，且配制步驟復(fù)雜，需進(jìn)行pH 調(diào)節(jié)，無(wú)疑增加前處理時(shí)間，增大測(cè)試工作量。 市面上，飼料多為同時(shí)添加維生素B1、維生素B2，而國(guó)標(biāo)法選用兩種方法對(duì)其進(jìn)行測(cè)定， 選用不同流動(dòng)相，進(jìn)一步增加測(cè)試時(shí)間。 本方法選用水作為提取液，同時(shí)提取維生素B1、維生素B2，用統(tǒng)一的流動(dòng)相， 統(tǒng)一的檢測(cè)方法， 大大縮短前處理時(shí)間，儀器準(zhǔn)備時(shí)間，簡(jiǎn)化色譜條件，從根本上提高檢測(cè)效率。

對(duì)低于15 mg/kg 的低含量飼料， 如配合飼料（梁玉樹(shù)等，2016；莫彩娜等，2015），國(guó)標(biāo)法無(wú)法得到準(zhǔn)確結(jié)果。 本方法因遠(yuǎn)低于國(guó)標(biāo)法的檢出限、定量限，可應(yīng)用于各水平含量的飼料測(cè)定工作。 國(guó)標(biāo)法因采用紫外檢測(cè)器分析，對(duì)上機(jī)工作液的純凈度有較高的要求， 需通過(guò)不同提取液來(lái)滿(mǎn)足絡(luò)合重金屬、沉淀蛋白質(zhì)等除雜要求，以期得到不受干擾的色譜結(jié)果。 特別要注意的是，維生素B1的紫外吸收響應(yīng)低，即使選用特定提取液提取， 對(duì)含量低的飼料依然無(wú)法完全消除雜質(zhì)對(duì)色譜結(jié)果的干擾， 給測(cè)定結(jié)果帶來(lái)不確定性（圖3、圖4）。 本方法則直接選用熒光檢測(cè)器，選擇性更強(qiáng)，靈敏度更高，所得色譜結(jié)果不受雜質(zhì)干擾，能夠得到更加準(zhǔn)確的測(cè)定結(jié)果。本方法與國(guó)標(biāo)法方法比對(duì)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 本方法與國(guó)標(biāo)法方法比對(duì)結(jié)果

圖3 低含量飼料維生素B1 紫外色譜圖

圖4 低含量飼料維生素B2 紫外色譜圖

為進(jìn)一步確定該方法結(jié)果是否符合要求，取6 份具有代表性的飼料，分別進(jìn)行本方法及國(guó)標(biāo)法測(cè)定，對(duì)兩者結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果見(jiàn)表4，本方法與國(guó)標(biāo)法維生素B1、 維生素B2測(cè)定值比較相對(duì)偏差均小于5%，符合國(guó)標(biāo)法規(guī)定的相對(duì)偏差不大于5% 的要求。

表4 本方法與國(guó)標(biāo)法比對(duì)結(jié)果及相對(duì)偏差

4 結(jié)論

本文建立了高效液相色譜-熒光法測(cè)定飼料中維生素B1、維生素B2的方法。 本方法采用高溫高壓法進(jìn)行樣品前處理，對(duì)維生素B1進(jìn)行衍生化處理，最終采用熒光法測(cè)定。 本方法無(wú)需配制特定提取液，使用統(tǒng)一的流動(dòng)相，在同臺(tái)儀器上測(cè)定，簡(jiǎn)化了樣品前處理過(guò)程，進(jìn)一步縮短了儀器準(zhǔn)備時(shí)間，優(yōu)化了色譜條件，提高了檢測(cè)效率。 熒光法因其更加靈敏的特點(diǎn)，擴(kuò)大了飼料含量測(cè)定范圍。 色譜結(jié)果表明，本方法回收率大于90%，能滿(mǎn)足分別在5、 7 min 內(nèi)完成對(duì)維生素B1、維生素B2的測(cè)定，適用于所有類(lèi)型的飼料檢測(cè)工作。 為測(cè)定維生素B1、維生素B2提供了一種簡(jiǎn)單、高效、準(zhǔn)確的方法，對(duì)國(guó)標(biāo)法進(jìn)一步擴(kuò)大檢測(cè)范圍，提高檢測(cè)效率具有現(xiàn)實(shí)意義。