山楂復(fù)方中草藥對大口黑鱸生長、消化及健康的影響

孫洪慶， 王 洋， 李佳昕， 朱國霞， 楊 廣， 白東清

（天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384）

中草藥來源廣泛， 副作用小， 能促進動物生長、 提高水產(chǎn)品品質(zhì)、 增強機體免疫力和抗病力（Chinese Pharmacopoeia Commission，2020；Zhong等，2019；Jiang 等，2019；Feng 等，2018；Zhang 等，2012；Liu 等，2007 ）。山楂具有抗氧化、降血脂、降血糖、消炎和促進胃腸蠕動等多種藥理作用，可促進鯽的消化和生長（向梟等，2009）。神曲主要成分為酵母菌、酶類、維生素B 復(fù)合物、苷類和揮發(fā)油等，屬于復(fù)合酶類制劑，其復(fù)方中草藥可促進肉雞的生長（楊桂梅等，2020；楊斌等，2017）。半夏具有抗?jié)儯龠M膽汁分泌、腸道蠕動和減少胃液分泌等功效， 以半夏為主的復(fù)方中草藥可治療馬屬動物消化系統(tǒng)疾病（劉春元，2011）。

大口黑鱸（Micropterus salmoides） 又名加州鱸，有“淡水石斑魚”的美名，因肉質(zhì)好、口感好、生長快、無肌間刺、方便加工、烹飪方法多樣，適合各類人群食用。 作為肉食性魚類，攝食兇猛，幼魚階段攝食人工配合飼料因消化問題、 肝胰臟病變導(dǎo)致生長停滯或死亡，成活率降低現(xiàn)象。 基于此，本試驗選用山楂、神曲和半夏組成復(fù)方中草藥，研究其不同添加量對大口黑鱸幼魚生長、 消化及健康的影響， 以期為大口黑鱸幼魚階段助消化添加劑的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗用魚 試驗用2000 尾健康大口黑鱸仔魚取自天津藍科水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司， 經(jīng)過開口馴化， 暫養(yǎng)2 周后， 對幼魚隨機分組， 初始體重（5.9±0.6）g，初始體長（6.3±0.3）cm。

1.1.2 飼料配制 飼料原料來自天津現(xiàn)代天驕水產(chǎn)飼料股份有限公司，中草藥購自九州大藥房。飼料原料和中草藥用Y-3000S 粉碎機進行粉碎，過80 目篩，復(fù)方中草藥配方按照山楂：神曲：半夏=6：2：2 的比例混勻， 按質(zhì)量比2.5‰、5‰、7.5‰和10‰分別添加到飼料中， 用MB-22S 制粒機制作飼料，孔徑2 mm，存放于避光通風(fēng)處，使用前進行破碎過篩。 飼料組成及飼料常規(guī)營養(yǎng)水平見表1。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設(shè)計及養(yǎng)殖管理 試驗魚隨機分成5組，分別投喂0、2.5‰、5‰、7.5‰和10‰復(fù)方中草藥飼料，每組設(shè)3 個重復(fù)，每缸50 尾魚。采用表觀飽食投喂法，每次投喂時間30 min 左右，投喂結(jié)束后吸殘餌、除糞便。 試驗期間，用廈門利洋水產(chǎn)科技有限公司生產(chǎn)的水質(zhì)快速檢測盒監(jiān)測水質(zhì)，水溫保持在26 ～28 ℃，溶氧≥6.0 mg/L，氨氮＜0.05 mg/L， 亞硝酸鹽＜0.05 mg/L，pH 為6.5 ～7.6。 試驗周期為4 周。

1.2.2 樣品采集 試驗結(jié)束后采集樣品， 空腹24 h后，隨機在每個重復(fù)組采集30 尾魚，用丁香酚快速麻醉， 用直尺和電子游標(biāo)卡尺進行形態(tài)指數(shù)測量，使用1 mL 針頭抽取血液，放入5 mL 離心管中，于4 ℃條件下，2500 r/min，離心15 min 后取上清液冷凍保存。 大口黑鱸幼魚解剖在化學(xué)冰袋上進行，取出頭腎、腦、脾、鰓和肝胰臟，清理后迅速放入-80 ℃冰箱保存，用于消化酶活性測定。 同時每個重復(fù)組隨機取3 尾魚，快速麻醉，冰袋上解剖，取出胃、幽門盲囊、腸道和肝胰臟，用4 ℃生理鹽水沖洗掉胃腸內(nèi)容物， 迅速放入中性甲醛中進行固定，用于組織生理學(xué)切片觀察。

1.2.3 酶活性的測定 脂肪酶、α-淀粉酶、 蛋白酶活性測定均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)試劑盒進行，方法參考試劑盒說明書。

1.2.4 肝胰臟和消化道組織切片的制作 組織切片的制作使用常規(guī)的石蠟切片法 （Ozawa 和Sakaue，2020）。

1.2.5 飼料和肌肉常規(guī)成分的測定 采用國標(biāo)方法測定飼料中水分含量 （常壓恒溫烘干法，GB/T6435），粗灰分含量（550 ℃灼燒法，GB/T6438）；利用凱氏定氮法測量飼料中粗蛋白質(zhì)含量（GB/T6432，采用FOSS（KT 200 Kjeltec））；使用魯氏殘渣法測量飼料中粗脂肪含量（GB/T 6433，葉列敏柯脂肪浸提器）。

1.2.6 生長指標(biāo)測量 生長指標(biāo)計算公式如下：

特定生長率=100×（lnW2-lnW0）/T；

增重率=100×（W2-W0）/W0；

攝食率=W1×100/T×（W2+W0）/2；

飼料系數(shù)=W1/（W2-W0）；

蛋白質(zhì)效率=（W2-W0）/（W1×CP）；

肥滿度=W2×100/L3；

臟體比=W4×100/W5；

式中：W0為大口黑鱸初始體質(zhì)量，W1為攝食飼料總質(zhì)量，W2為大口黑鱸最終體質(zhì)量，W4為內(nèi)臟團重，W5為大口黑鱸體質(zhì)量，T 為養(yǎng)殖天數(shù)，L為大口黑鱸最終體長，CP 為飼料中所有含氮物質(zhì)。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 20.0 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。首先對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，數(shù)據(jù)差異顯著在進行LSD 和Tukey 氏法多重比較。 數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)方中草藥對大口黑鱸生長的影響 表2顯示， 中草藥不同添加量對大口黑鱸幼魚特定生長率、增重率、攝食率、飼料系數(shù)和蛋白質(zhì)效率有顯著影響（P＜0.05），而對大口黑鱸的肥滿度和臟體比影響不大（P＞0.05）。 其中7.5‰組特定生長率比2.5‰組提高了8.3%（P＜0.05）。7.5%組增重率比2.5‰組提高了13.7%（P＜0.05）。 2.5‰組攝食率比10‰組提高了14.0%（P＜0.05）。 2.5‰組蛋白質(zhì)效率比7.5‰和10‰組分別降低了15.3%和16.2%（P＜0.05）。 2.5‰組飼料系數(shù)比7.5‰和10‰組分別提高了18.5%和19.5%（P＜0.05）。

表2 復(fù)方中草藥對大口黑鱸生長和飼料效率的影響

2.2 復(fù)方中草藥對大口黑鱸肌肉成分的影響由表3 可得，中草藥不同添加量可顯著影響大口黑鱸幼魚肌肉中粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、粗灰分、鈣和磷含量（P＜0.05）。其中7.5‰組肌肉粗蛋白質(zhì)含量比對照組和5‰組分別提高了3.8%和4.0%（P＜0.05）。7.5‰組肌肉粗脂肪含量比5‰和10‰組分別降低了4.3%和7.5%（P＜0.05）。 5‰組肌肉粗灰分含量比其余各組分別提高了8.6%、18.7%、13.8%和7.8%（P＜0.05）。 5‰組肌肉鈣含量比對照組、2.5‰和7.5‰組分別提高了26.7%、18.8%和11.8%（P＜0.05）。 7.5‰組肌肉磷含量比其余各組分別降低了25.0%、45.5%、25.0%和36.8%（P＜0.05）。

表3 復(fù)方中草藥對大口黑鱸肌肉成分的影響 %

2.3 復(fù)方中草藥對大口黑鱸消化酶的影響 由表4 可得， 飼料中中草藥不同添加量可顯著影響大口黑鱸幼魚胃、幽門盲囊、腸和肝胰臟的消化酶活性（P＜0.05）。在胃中，10‰組α-淀粉酶活性比其余各組分別降低了27.5%、21.3%、27.1%和11.8%（P＜0.05）；2.5‰組脂肪酶活性比其余各組分別提高了239.4%、135.9%、425.9%和951.8%（P＜0.05）。 在幽門盲囊中， 對照組脂肪酶活性比2.5‰、7.5‰和10‰組分別提高了228.5%、268.1%和433.6%（P＜0.05）。 在腸道中，5‰組α-淀粉酶活性比對照組降低了35.5%（P＜0.05）； 對照組脂肪酶活性比2.5‰和5‰組分別提高了229.4%和320.0%（P＜0.05）。在肝胰臟中，10‰組脂肪酶活性比其余各組分別顯著提高了183.0%、109.4%、215.2%、135.1%（P＜0.05）。添加復(fù)方中草藥可顯著影響大口黑鱸幼魚腸和肝胰臟胰蛋白酶活性（P＜0.05），其中對照組腸胰蛋白酶活性比2.5‰、7.5‰和10‰組分別降低了71.4%、58.8%和54.2%（P＜0.05）。 對照組肝胰臟胰蛋白酶活性比7.5‰和10‰組分別降低了52.5%和63.4%（P＜0.05）。

表4 復(fù)方中草藥對大口黑鱸消化酶活性的影響 U/mg prot

2.4 復(fù)方中草藥對大口黑鱸消化器官健康的影響

2.4.1 腸道組織結(jié)構(gòu) 由表5 和圖1 可得， 飼料中復(fù)方中草藥添加量可顯著影響大口黑鱸腸道絨毛高度、寬度和肌層厚度（P＜0.05）。 在前腸中，2.5‰組絨毛高度比其余各組分別顯著提高了13.8%、5.4%、15.3%和24.2%（P＜0.05）。對照組絨毛寬度比其余各組分別顯著提高了18.9%、4.6%、7.9%和13.6%（P＜0.05）。對照組肌層厚度比其余各組分別提高了27.5%、4.3%、10.0%和42.4%（P＜0.05）。 在中腸中，對照組、2.5‰和5‰組絨毛高度顯著高于7.5‰和10‰組（P＜0.05）。10‰組絨毛寬度比其余各組分別提高了11.7%、19.8%、62.2%和13.0%（P＜0.05）。 7.5‰組肌層厚度比其余各組分別提高了9.7%、3.4%、38.5%和7.2%（P＜0.05）。 在后腸中，2.5‰組絨毛高度比其余各組分別提高了2.2% 、21.2% 、11.5% 和22.5% （P＜0.05）。 2.5‰組絨毛寬度比其余各組分別提高了30.7%、39.8%、51.9%和16.1%（P＜0.05）。2.5‰組肌層厚度比其余各組分別提高了129.4%、109.9%、214.8%和226.4%（P＜0.05）。

圖1 復(fù)方中草藥對大口黑鱸腸道組織結(jié)構(gòu)的影響

表5 復(fù)方中草藥對大口黑鱸腸道組織結(jié)構(gòu)的影響 μm

2.4.2 胃組織結(jié)構(gòu) 由表6 和圖2 可得， 飼料中中草藥不同添加量可顯著影響大口黑鱸幼魚胃肌層、黏膜下層和黏膜層（P＜0.05）。 其中5‰組肌層厚度顯著高于其余各組（P＜0.05），分別提高了17.3%、7.8%、5.2%和33.5%。 2.5‰組黏膜下層厚度顯著高于其余各組 （P＜0.05）， 分別提高了19.7%、4.7%、16.9%和14.3%。5‰組黏膜層厚度顯著高于其余各組（P＜0.05），分別提高了14.6%、11.0%、24.2%和21.7%。

圖2 復(fù)方中草藥對大口黑鱸胃組織結(jié)構(gòu)的影響

表6 復(fù)方中草藥對大口黑鱸胃組織結(jié)構(gòu)的影響 μm

2.4.3 盲囊組織結(jié)構(gòu) 由表7 和圖3 可得， 復(fù)方中草藥不同添加量可顯著影響大口黑鱸幼魚幽門盲囊的絨毛高度、 寬度和肌層厚度 （P＜0.05）。2.5‰組絨毛高度顯著高于其余各組 （P＜0.05），分別提高了11.2%、60.8%、2.6%和17.0%。 2.5‰組絨毛寬度顯著高于對照組、7.5‰和10‰組（P＜0.05），分別提高了18.9%、4.8%和6.2%。7.5‰組肌層厚度顯著高于對照組、5‰和10‰組 （P＜0.05），分別提高了23.3%、12.5%和9.6%。

圖3 復(fù)方中草藥對大口黑鱸幽門盲囊組織結(jié)構(gòu)的影響

表7 復(fù)方中草藥對大口黑鱸幽門盲囊組織結(jié)構(gòu)的影響 μm

2.4.4 肝組織結(jié)構(gòu) 由圖4 可見， 對照組與試驗組相比，肝細胞界限模糊，細胞核位置偏移、細胞空泡化嚴(yán)重、脂肪滴多。試驗組中肝細胞輪廓和細胞核清晰度均優(yōu)于對照組，試驗組中5‰和7.5‰投喂組要優(yōu)于2.5‰和10‰投喂組。

圖4 復(fù)方中草藥對大口黑鱸肝組織結(jié)構(gòu)的影響

3 討論

3.1 復(fù)方中草藥對大口黑鱸生長的影響 復(fù)方中草藥起初在畜禽業(yè)促生長和提高飼料利用率上廣泛應(yīng)用。 本試驗中，7.5‰復(fù)方中草藥一定程度上可促進大口黑鱸幼魚的生長和飼料利用。 謝麗玲等（2009）發(fā)現(xiàn)，黃岑、金銀花等中草藥能促進羅非魚生長，提高飼料利用率。 曲木等（2018）認(rèn)為，隨著黃芪、黨參等復(fù)方中草藥添加量的增加，黃顙魚的特定生長率、 增重率和蛋白質(zhì)效率呈先下降后上升趨勢，飼料系數(shù)呈相反趨勢。王凡等（2021）發(fā)現(xiàn)，黃芪、山藥等復(fù)方中草藥有促進虹鱒生長的趨勢。 然而在魚類生長及飼料利用上也有不同結(jié)論。如田娟等（2008）報道，黨參、黃芪、山楂等復(fù)方中草藥對草魚的生長和飼料利用率分別存在抑制和促進作用，當(dāng)中草藥添加劑中黃酮含量過高時，對草魚生長起到抑制作用， 而適量的黃酮對草魚生長和飼料利用有促進作用， 推斷出復(fù)方中草藥添加劑中中草藥主要成分是影響魚類生長和飼料系數(shù)的重要因素。

3.2 復(fù)方中草藥對大口黑鱸體成分的影響 隨著水產(chǎn)品由數(shù)量到質(zhì)量轉(zhuǎn)型， 人們更加追求品質(zhì)和口感，而魚肉的品質(zhì)及口感與魚肉成分有關(guān)。山楂含有的總黃酮在促進前脂肪細胞增殖的同時對其分化具有抑制作用（張祺嘉鈺等，2021）。在本試驗中，當(dāng)復(fù)方中草藥添加量為7.5‰時，大口黑鱸幼魚肌肉粗蛋白質(zhì)含量顯著高于對照組， 說明一定水平的山楂、 神曲和半夏等中草藥有提高大口黑鱸幼魚肌肉品質(zhì)的作用。陳麗婷等（2014）發(fā)現(xiàn)，飼料中添加山楂、枸杞、黃芪等中草藥可以降低鯉肌肉中水分含量， 增加蛋白質(zhì)和脂肪含量。 黃文（2013）得出，添加麻黃、苦參等中草藥提升了鯉肉的品質(zhì)。 然而，添加黃芪、金銀花等中草藥對羅非魚的肌肉品質(zhì)無顯著影響（湯菊芬等，2009）。譚娟等（2015）報道，添加魚腥草、金銀花等中草藥對草魚幼魚的肌肉品質(zhì)無顯著影響。

3.3 復(fù)方中草藥對大口黑鱸消化酶活性的影響消化酶是由消化腺和消化系統(tǒng)分泌的有助于魚類對食物的營養(yǎng)吸收和消化的酶。 其中肝胰臟作為消化酶的產(chǎn)生和分泌場所， 腸道使用消化酶促進消化（Cahu 等，2004）。 環(huán)境中的溫度、鹽度、酸堿度和魚類自身的食性和飼料種類都會影響其活性。 據(jù)AL-Hussaini（1949）報道，魚體內(nèi)消化酶活性受其飼料影響。 研究表明山楂含有VC、VB2、胡蘿卜素和有機酸等物質(zhì)能促進魚類胃腸道蠕動，使消化酶活性和分泌量增加（張祺嘉鈺等2021）。本試驗中，2.5‰和10‰復(fù)方中草藥能顯著提高大口黑鱸幼魚胃和肝胰臟中脂肪酶活性，7.5‰和10‰組腸和肝胰臟中胰蛋白酶活性顯著高于對照組， 而對照組腸道和幽門盲囊中脂肪酶活性顯著高于試驗組； 還發(fā)現(xiàn)復(fù)方中草藥對大口黑鱸幼魚體內(nèi)α-淀粉酶活性影響不大；與王吉橋等（2006）發(fā)現(xiàn)，飼喂金銀花、山楂等復(fù)方中草藥對牙鲆的淀粉酶活性無顯著影響結(jié)論相吻合。 劉慧吉等（2008）發(fā)現(xiàn)，山楂、麥芽等復(fù)方中草藥可以顯著提高花鱸的肝臟和胃脂肪酶活性； 徐安樂等（2018）認(rèn)為，黃芪、杜仲等復(fù)方中草藥可以顯著提升對珍珠龍膽石斑魚胰蛋白酶活性。可見，飼料中添加復(fù)方中草藥，依據(jù)其藥性，可以一定程度上促進消化酶分泌，進而提高相應(yīng)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。

3.4 復(fù)方中草藥對大口黑鱸消化器官健康的影響 大口黑鱸胃由黏膜層、黏膜下層、固有層、肌層組成，呈Y 形，最前端為賁門部，最后端為幽門部，中間部分為胃體部（Kageyama，2002）。 本試驗中，2.5‰和5‰添加組胃黏膜層和肌層厚度顯著高于對照組， 說明飼料中添加該復(fù)方中草藥對大口黑鱸幼魚胃消化能力提升有促進作用， 分析其原因，可歸結(jié)為黏膜層中含有胃腺細胞，黏膜層的厚度越大， 胃腺細胞數(shù)量越多； 肌層由平滑肌構(gòu)成， 肌層厚度越大胃的收縮能力和消化能力越強（張杰，等2015；初慶柱，等2009）。

幽門盲囊作為魚類消化系統(tǒng)中特有部分，其結(jié)構(gòu)與腸道結(jié)構(gòu)相似，具有肌層和腸絨毛，幽門盲囊對腸道消化具有輔助作用（徐革鋒等，2009；楊桂文等1998）。 本試驗中，2.5‰和7.5‰添加組絨毛高度、寬度和肌層厚度顯著高于對照組，推斷該復(fù)方中草藥的添加對大口黑鱸幼魚幽門盲囊的健康狀況有促進作用。

腸道是魚類體內(nèi)生理代謝和營養(yǎng)消化吸收的重要器官，不同腸道絨毛高度、絨毛寬度和肌層厚度反應(yīng)大口黑鱸腸道對飼料的消化吸收能力及其腸道健康狀況（Baram 等，1999；Kato 等，1999）。研究表明，大口黑鱸前腸皺襞數(shù)量多，是主要消化場所，其消化和吸收能力強，而中腸和后腸的環(huán)境則為食物殘渣和糞便的排出提供了有利條件（趙柳蘭等，2018；Faccioli 等，2014）。 本試驗中， 投喂2.5‰和5‰復(fù)方中草藥后， 大口黑鱸幼魚前腸絨毛長度顯著提高， 進而推斷該中草藥可以促進腸道消化吸收。 王鵬（2011）發(fā)現(xiàn)，神曲、山楂等中草藥組仔豬的腸絨毛長度顯著提高； 賀永康（2010）發(fā)現(xiàn)，黃芪、大黃等復(fù)方中草藥組的腸絨毛長度顯著提高。 這些結(jié)果表明投喂適宜的復(fù)方中草藥可改善腸道結(jié)構(gòu)，促進營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收。

肝胰臟是魚類的代謝和排毒器官， 在魚體中起著去氧化、 肝糖儲存和分泌性蛋白質(zhì)合成等功能， 膽汁作為腸道中對脂肪消化的主要物質(zhì)也是由肝胰臟合成。 添加復(fù)方中草藥可影響魚類生長發(fā)育， 也影響肝胰臟組織結(jié)構(gòu)和生理生化功能（Imsland 等，2019）。當(dāng)能量攝入過多時，多余脂肪堆積在肝胰臟部位，導(dǎo)致肝細胞核偏移，肝細胞空泡化，肝細胞損傷導(dǎo)致代謝能力下降，堆積脂肪不能被分解，出現(xiàn)肝損傷（Yuan 等，2012）。 本試驗中，試驗組肝胰臟組織健康情況較好，對照組中肝細胞形狀不規(guī)則，脂肪滴和空泡化情況嚴(yán)重，輪廓模糊不清，細胞核偏移嚴(yán)重。 劉玉延（2018）發(fā)現(xiàn)，投喂杜仲、 百合等復(fù)方中草藥可使泥鰍肝細胞輪廓清晰、脂肪滴減少。可見有些種類的中草藥具有保肝護肝的作用。

4 結(jié)論

復(fù)方中草藥可以一定程度上促進生長， 顯著改善肌肉品質(zhì)。復(fù)方中草藥可以顯著提高胃、肝胰臟脂肪酶活性和腸、肝胰臟胰蛋白酶活性，一定程度上改善消化系統(tǒng)健康狀況。 綜合大口黑鱸幼魚生長、消化、肌肉成分、消化系統(tǒng)健康方面考慮，建議山楂、神曲、半夏復(fù)方中草藥（比例為6：2：2）添加量為2.5‰ ～7.5‰。