基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討梔黃止痛散治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎作用機(jī)制及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

田曉云,楊瑩潔,鄭婉婷,黃鳴清,趙海譽(yù),南麗紅,陳劍鈺

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,福建 福州 350122;2.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所,北京 100700)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種慢性自身免疫性疾病,臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、僵硬及腫脹,屬于中醫(yī)“痹癥”的診療范疇。該病發(fā)病人群廣、發(fā)病率高、治療周期長且致殘率高。近年來,中藥復(fù)方在干預(yù)、治療RA取得較好效果,因此,具有巨大潛力。研究表明,益腎清絡(luò)活血方可通過抑制炎癥反應(yīng),降低炎癥評(píng)分及血清中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素1β (interleukin-1 beta,IL-1β)的表達(dá),升高OPG/RANKL的比值來調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)骨破壞的環(huán)境,進(jìn)而緩解RA病情[1];甘草養(yǎng)陰湯抑制大鼠成纖維滑膜細(xì)胞增殖,從而抗炎[2];斷藤益母湯可通過下調(diào)VEGF信號(hào)通路抑制人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)的增殖、遷移、黏附和血管形成,減輕RA血管翳的形成[3];四妙勇安湯合白虎湯加味可以抑制可溶性髓樣細(xì)胞觸發(fā)受體-1(triggering receptor expressed on myeloid cells 1,sTREM-1)、白細(xì)胞介素32(interleukin 32, IL-32)、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶(glucose-6-phosphate isomerase, GPI)等炎癥介質(zhì)的表達(dá),減輕RA軟骨炎癥損傷[4]。

梔黃止痛散(Zhi-Huang-Zhi-Tong powder,ZHZTP)是全國名老中醫(yī)王宏坤教授參考《誠書》梔黃散所得的經(jīng)驗(yàn)加減方,由梔子、大黃、姜黃、黃柏、天花粉、赤小豆、赤芍、白芷、木香、冰片組成,其中梔子、大黃破瘀通脈、消腫散結(jié)為君藥;天花粉、姜黃、黃柏可以加強(qiáng)活血化瘀之功為臣藥;赤小豆、赤芍、白芷、木香行氣利水消腫,冰片開竅通絡(luò),引領(lǐng)諸藥,促使藥物的吸收,是為佐使。ZHZTP的功效為清熱解毒、逐瘀通經(jīng)、消腫止痛,臨床在關(guān)節(jié)扭傷、骨關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)滑膜炎等方面具有較好的治療效果。王銘增等[5]研究表明,使用ZHZTP治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者,可顯著降低血清炎性因子、C-反應(yīng)蛋白(c-reactive protein,CRP)、血清尿酸(serumuric acid,UA)的水平,減輕患者疼痛;齊秀春等[6]發(fā)現(xiàn),ZHZTP能夠減輕機(jī)體膠原纖維損傷、拮抗損傷局部過氧化反應(yīng),縮短急性踝關(guān)節(jié)扭傷患者疼痛時(shí)間;溫陽陽等[7]發(fā)現(xiàn),ZHZTP可明顯降低IL-1β、TNF-α等炎性因子水平,促進(jìn)痛風(fēng)患者關(guān)節(jié)腫脹消退。可見,ZHZTP在臨床上治療各類關(guān)節(jié)炎疾病具有較好效果,然而其有效成分、作用機(jī)制、以及是否對RA具有治療效果尚無報(bào)道。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種多學(xué)科交叉、通過整體生物網(wǎng)絡(luò)分析探討藥物,尤其是復(fù)雜中藥,作用于疾病機(jī)制的研究方法,能快速挖掘藥物與作用靶點(diǎn)間的相互關(guān)系、揭示中藥活性成分間的協(xié)同作用[8]。本文運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討ZHZTP化學(xué)成分、作用靶點(diǎn)及信號(hào)通路,挖掘其治療RA的可能作用機(jī)制并進(jìn)行體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,為臨床治療及后期臨床前研究提供理論依據(jù),具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步探索

1.1.1梔黃止痛散活性成分及靶點(diǎn)預(yù)測 利用TCMSP數(shù)據(jù)庫( https://old.tcmsp-e.com/index.php)檢索ZHZTP君臣藥(梔子、大黃、姜黃、黃柏、天花粉)的化學(xué)成分及相應(yīng)靶點(diǎn)蛋白,另外,將相應(yīng)靶點(diǎn)蛋白名稱用uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)轉(zhuǎn)化為其基因名。

1.1.2RA疾病靶點(diǎn)獲取 Genecards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/),OMIM數(shù)據(jù)庫和TTD數(shù)據(jù)庫,綜合匯總RA疾病發(fā)病過程中重要靶點(diǎn)。

1.1.3梔黃止痛散活性成分關(guān)系分析 將RA疾病相關(guān)靶點(diǎn)與中藥活性成分的作用靶點(diǎn)取交集,獲得交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/),Cytoscape3.8.2軟件作圖分析Network Analysis功能計(jì)算出節(jié)點(diǎn)的degree,betweenness、closeness值,并取以上3項(xiàng)均大于平均值的靶點(diǎn),確定參與調(diào)控的核心靶點(diǎn),并進(jìn)行蛋白-蛋白網(wǎng)絡(luò)關(guān)系(PPI)網(wǎng)絡(luò)分析。

1.1.4構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò) Cytoscape3.8.2軟件繪制“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖,以網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)和邊表示各因素之間的關(guān)聯(lián)性。利用軟件中的“Network Analyzer”功能對“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析,選取degree、betweenness及closeness大于平均值的成分,從而分析通過作用RA重要靶點(diǎn)發(fā)揮治療作用的各單味藥之間、單味藥與成分的關(guān)聯(lián)性,進(jìn)而闡明ZHZTP的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。另外,也可提示ZHZTP中重要化學(xué)成分與重要靶點(diǎn)的關(guān)聯(lián)性,從而推測ZHZTP可能的作用機(jī)制。

1.1.5GO和KEGG通路富集分析 將“1.3”結(jié)果中的交集基因通過DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO和KEGG分析,從而確定ZHZTP所調(diào)控的信號(hào)通路及所涉及的相關(guān)分子功能。

1.1.6關(guān)鍵成分與核心靶點(diǎn)的分子對接驗(yàn)證 取Cytoscape3.8.2軟件分析“藥物-成分-靶點(diǎn)”關(guān)聯(lián)性中degree排名前3的靶點(diǎn),確定其為ZHZTP治療RA的核心靶點(diǎn)。使用AutoDock vina軟件,將關(guān)鍵活性成分與上述核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接,確定其結(jié)合作用及結(jié)合位點(diǎn),結(jié)果用pymol軟件展示。

1.2 體外驗(yàn)證

1.2.1主要試劑與儀器 試劑:TNF-α(AF-300-01A),PeproTech公司;噻唑藍(lán)(0793-1),Lablead 公司;胎牛血清(FBS,10099-141)Gibco公司;青霉素-鏈霉素(Penicillin-Streptomycin Solution,15140122),Gibco公司;DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基(11965-092),Gibco公司;β-actin(P31029),北京全式金生物公司;PI3K(154598) ,Abcam公司;AKT(4691S),Cell Signaling Technology公司;m-TOR(2983S)抗體,Cell Signaling Technology公司; 鼠二抗(SA00001-1),Proteintech公司;兔二抗 (SA00001-2),Proteintech公司。

儀器:ALPHA1-2 LD plus冷凍干燥機(jī)(德國Christ公司); 552BR138222 型電泳儀,71BR13865 型化學(xué)發(fā)光成像儀(美國 Bio-Rad 公司); 30174782 型多功能酶標(biāo)儀(美國 Bio-Tek 公司); AS2000倒置生物顯微鏡(Motic公司)。

1.2.2梔黃止痛散凍干粉的制備及含量測定 ZHZTP由大黃30 g,天花粉20 g,黃柏20 g,梔子15 g,赤芍15 g,白芷15 g,赤小豆15 g,姜黃15 g,木香15 g,冰片10 g組成,均購自福建省第三人民醫(yī)院,按常規(guī)中藥煎煮法制備并濃縮,將濃縮液平鋪于100 mm的培養(yǎng)皿中,置-80 ℃冰箱預(yù)冷過夜。將培養(yǎng)皿放入冷凍干燥機(jī)進(jìn)行凍干,48 h后將凍干粉快速捻勻后放入50 mL離心管中,儲(chǔ)存于-20 ℃?zhèn)溆谩０?020版《中國藥典》梔子、大黃項(xiàng)下含量測定方法檢測,ZHZTP凍干粉中熊果酸含量為0.34%,大黃素含量為0.023%。

適量凍干粉加入二甲亞砜(DMSO)配制質(zhì)量濃度為50 g·L-1的ZHZTP母液,使用0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌,于-80 ℃冰箱保存。實(shí)驗(yàn)時(shí)提前解凍母液,用培養(yǎng)基對母液進(jìn)行稀釋,獲得不同實(shí)驗(yàn)所需藥物濃度,藥物最大濃度的含藥培養(yǎng)基中DMSO的濃度<1%。

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng) HUVECs購自ATCC公司,用含10% FBS、1% PS的DMEM高糖培養(yǎng)基,在37 ℃,5% CO2條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)皿細(xì)胞在倒置顯微鏡下觀察,根據(jù)細(xì)胞的狀態(tài)、密度,進(jìn)行換液、傳代培養(yǎng)、凍存、復(fù)蘇或者種板等操作,其中4～6代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.4MTT檢測HUVECs活力 將HUVECs以5×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板,培養(yǎng)至細(xì)胞對數(shù)生長期。 分別以濃度為0、15.6、31.3、62.5、125、500 mg·L-1ZHZTP孵育細(xì)胞,各劑量組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。24 h后棄去上清,每孔加入100 μL MTT(5 g·L-1)工作液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后用酶標(biāo)儀測定在490 nm處的吸光度A,并計(jì)算細(xì)胞活力,每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

確定給藥濃度范圍后,分別設(shè)置空白組、模型組(基于課題組前期研究TNF-α 20 μg·L-1)、ZHZTP低、中、高劑量治療組(12.5、25、50 mg·L-1),按照上方法進(jìn)行檢測,計(jì)算細(xì)胞活力,每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.5平板劃痕實(shí)驗(yàn)檢測HUVECs遷移情況 平板劃痕實(shí)驗(yàn),即傷口愈合實(shí)驗(yàn)(wound-healing assay),在融合的單層細(xì)胞上制造一個(gè)空白區(qū)域,稱為“劃痕/傷口”,邊緣的細(xì)胞會(huì)逐漸進(jìn)入空白區(qū)域使“劃痕/傷口”愈合。因其類似體外傷口愈合過程,廣泛用于觀察藥物、基因等外源因素對細(xì)胞遷移和修復(fù)的影響。用marker筆在24孔板背后,以直尺均勻劃橫線,大約每隔0.5～1 cm/道,橫穿過孔,根據(jù)3.4結(jié)果,設(shè)置空白對照組、模型組(TNF-α 20 μg·L-1)、ZHZTP低、中、高劑量治療組(12.5、25、50 mg·L-1)。在每孔中加入HUVEC約5×104個(gè),過夜待細(xì)胞鋪滿,加入無血清培養(yǎng)基饑餓12 h,以排除細(xì)胞增殖的影響。用10 μL槍頭垂至于背后的橫線劃痕,用PBS洗細(xì)胞3次,去除劃下的細(xì)胞,加入無血清培養(yǎng)基,ZHZTP低、中、高劑量治療組依次加入(12.5、25、50 mg·L-1)ZHZTP預(yù)處理2 h,模型組和ZHZTP治療組分別加入TNF-α(20 μg·L-1),放入37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。按0、12 h取樣,每個(gè)樣本選取3個(gè)視野,拍照。使用ImageJ軟件進(jìn)行處理,取均數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。愈合率=(各處理組0 h面積-12 h面積/各處理組0 h面積)×100%。

1.2.6Western blot檢測HUVECs中部分關(guān)鍵靶點(diǎn)的表達(dá) 將HUVEC細(xì)胞以30×104個(gè)/孔的密度接種于6孔板,培養(yǎng)至細(xì)胞對數(shù)生長期,分組給藥參照3.5。給藥24 h后,收集細(xì)胞,加細(xì)胞裂解液50 μL,冰上充分裂解30 min,4 ℃,12 000 r·min-1,10 min,收集上清液,采用BCA試劑盒定量蛋白濃度,10% SDS-PAGE膠電泳分離蛋白,冰上轉(zhuǎn)膜80 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束,5%脫脂奶粉封閉2 h,加入一抗PI3K(1 ∶1 000)、AKT1(1 ∶1 000)、m-TOR(1 ∶1 000) 和β-actin(1 ∶1 000),4 ℃孵育過夜。除去一抗后,按要求分別加入鼠二抗(1 ∶3 000)、兔二抗(1 ∶3 000)室溫孵育2 h。最后ECL化學(xué)發(fā)光顯影,采集圖像,并分析灰度值。

2 結(jié)果

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果

2.1.1梔黃止痛散有效活性成分及作用靶點(diǎn)篩選結(jié)果 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫分析并篩選ZHZTP有效成分共116個(gè),并通過TCMSP分析此116個(gè)活性成分的靶點(diǎn)信息,用Uniprot數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)化為基因名,去重后得到242個(gè)靶點(diǎn)。

2.1.2RA疾病靶點(diǎn)篩選結(jié)果 綜合GeneCards數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫和TTD數(shù)據(jù)庫,去重后匯總共得RA相關(guān)靶點(diǎn)共1 364個(gè)。將RA相關(guān)靶點(diǎn)(1 364個(gè))與TCMSP分析得到的ZHZTP靶點(diǎn)(242個(gè))取交集,得到共有靶點(diǎn)93個(gè)(如Fig 1)。

2.1.3“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系 利用Cytoscape3.8.2軟件繪制ZHZTP治療RA的“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖(Fig 2)。圖中節(jié)點(diǎn)表示藥物或成分或靶點(diǎn)因素,邊表示不同因素之間的關(guān)聯(lián)性;節(jié)點(diǎn)的面積越大,顏色越深,表示該因素重要性越高;連線的顏色越深,表示該因素與其他因素的關(guān)聯(lián)性越強(qiáng);網(wǎng)絡(luò)中共包括471個(gè)節(jié)點(diǎn)和1 821條邊。將“成分-靶點(diǎn)”分析結(jié)果中Degree排序篩選前3得到靶點(diǎn)AKT1、TNF和IL-6(Tab 1),推測它們可能是ZHZTP治療RA的核心靶點(diǎn)。作用RA相關(guān)靶點(diǎn)的單體成分中熊果酸、大黃素的degree值明顯高于其它成分,在“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖中占據(jù)成分的核心地位,表明這兩個(gè)成分與RA重要靶點(diǎn)密切相關(guān),可能是ZHZTP治療RA的主要活性成分。另外,通過“藥物-成分”分析發(fā)現(xiàn)熊果酸、大黃素分別屬于君藥梔子、大黃中的重要成分。

Fig 1 Intersection of predicted targets of Zhi-Huang-Zhi-Tong powder and RA

Tab 1 Hub targets regulated by Zhi-Huang-Zhi-Tong powder in RA treatment

2.1.4GO和KEGG通路富集分析 將RA相關(guān)靶點(diǎn)與ZHZTP靶點(diǎn)取交集得到的93個(gè),通過DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO和KEGG分析,從而確定ZHZTP所調(diào)控的信號(hào)通路及所調(diào)控的相關(guān)分子功能。GO功能分析中biological function(BP)、molecular function(MF)和cell components(CC)均取中的繪制柱形圖,結(jié)果如Fig 4,表明ZHZTP對BP、MF和CC均有影響。KEGG通路富集得到共156條信號(hào)通路(P<0.05),從中選取前20的繪制氣泡圖。結(jié)果表明,ZHZTP的功能主要富集在PI3K-AKT、TNF和IL-6信號(hào)通路。

2.1.5蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作關(guān)系(PPI)分析及核心靶點(diǎn)篩選 將RA疾病相關(guān)靶點(diǎn)與ZHZTP有效成分靶點(diǎn)取交集得到的93個(gè)靶點(diǎn)(Fig 1)。Network Analysis分析篩選滿足degree、betweenness和close-ness大于平均值的靶點(diǎn)前20,見Tab 1。其中,位居前3的分別是AKT1、TNF和IL-6,它們在PPT網(wǎng)絡(luò)(Fig 3)中占據(jù)核心地位,可能是ZHZTP治療RA的核心靶點(diǎn)。因此,使用AutoDock vina軟件,將關(guān)鍵活性成分熊果酸、大黃素與上述核心靶點(diǎn)AKT1、TNF和IL-6進(jìn)行分子對接,確定其結(jié)合作用、結(jié)合位點(diǎn)及鍵長,結(jié)果用pymol軟件展示,如Fig 5所示;它們之間的結(jié)合能對接結(jié)果如Tab 2所示。其中,單一化合物與3個(gè)核心靶點(diǎn)的比較中,我們發(fā)現(xiàn)大黃素與熊果酸與核心靶點(diǎn)結(jié)合能由低到高依次為AKT1

Tab 2 Binding energy by interaction of compounds and targets

最后,本研究也總結(jié)ZHZTP“有效成分-重要靶點(diǎn)-信號(hào)通路”網(wǎng)絡(luò)調(diào)控作用關(guān)系(Fig 6),內(nèi)圈粉紅色代表ZHZTP抗RA重要有效成分;中間圈橘黃色代表上述重要有效成分作用于RA疾病過程中重要的靶點(diǎn);外圈藍(lán)色代表上述重要靶點(diǎn)所介導(dǎo)的信號(hào)通路。

2.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1梔黃止痛散對HUVECs活力的影響 采用MTT法考察不同濃度ZHZTP處理后細(xì)胞活力的影響,IC50=2 232 mg·L-1(Fig 7A)。與正常對照組比較,ZHZTP在給藥濃度為0～62.5 mg·L-1時(shí)對細(xì)胞活性無明顯抑制作用。確定50,25,12.5 mg·L-1濃度為后續(xù)研究劑量,ZHZTP在選定濃度下對細(xì)胞活性均抑制作用(Fig 7B)。

2.2.2梔黃止痛散對TNF-α誘導(dǎo)的HUVECs增殖的影響 采用MTT法考察不同濃度ZHZTP對TNF-α誘導(dǎo)的HUVECs增殖的影響,細(xì)胞活力在一定程度上體現(xiàn)細(xì)胞的增殖活性。與空白組比較,模型組能明顯促進(jìn)HUVECs的增殖(P<0.01);與模型組比較,ZHZTP治療組細(xì)胞增殖活性均明顯降低(P<0.01)(Fig 7C)。

2.2.3梔黃止痛散對TNF-α誘導(dǎo)的HUVECs 遷移能力的影響 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與空白組比較,模型組愈合率明顯增加(P<0.01);與模型組比較,ZHZTP治療組愈合率明顯減少(P<0.01)(Fig 8)。

Fig 2 Network profile of targets regulated by Zhi-Huang-Zhi-Tong powder in RA pathogenesis

Fig 3 The PPI network map of Zhi-Huang-Zhi-Tong powder in RA treatment

Fig 4 GO and KEGG enrichment for mechanism regulated by active compounds of Zhi-Huang-Zhi-Tong powder in RA treatment

Fig 5 Molecule docking between active compounds and targets

2.2.4梔黃止痛散對PI3K/AKT/m-TOR信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響 Western blot 結(jié)果顯示(Fig 9),與空白組比較,模型組 HUVECs中PI3K,AKT,m-TOR蛋白相對表達(dá)水平明顯升高;與模型組比較,ZHZTP治療組PI3K、AKT及m-TOR蛋白相對表達(dá)明顯降低。

3 討論

ZHZTP臨床用于治療RA,療效顯著,但其物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制尚不清楚。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析其抗RA有效成分及相關(guān)作用機(jī)制。結(jié)果表明,ZHZTP中通過調(diào)控RA疾病過程重要靶點(diǎn)的主要有效成分有20種,其中,熊果酸、大黃素位居前二,對RA疾病過程重要靶點(diǎn)的調(diào)控作用強(qiáng)于其它治療RA的有效成分。提示這兩個(gè)成分與RA重要靶點(diǎn)密切相關(guān),可能是ZHZTP治療RA的核心有效成分。另外,進(jìn)一步分析這兩個(gè)核心有效成分,發(fā)現(xiàn)它們均來自梔子(君藥)和大黃(君藥);且兩個(gè)成分與ZHZTP治療RA的核心靶點(diǎn)AKT1、TNF和IL-6的結(jié)合能表現(xiàn)一致,以上可闡明ZHZTP中梔子、大黃共為君藥的合理性,及各藥物君臣佐使配伍相對合理,可發(fā)揮協(xié)同抗RA作用。

本研究也發(fā)現(xiàn)ZHZTP治療RA的核心靶點(diǎn)依次為AKT1、TNF和IL-6,對接結(jié)果也顯示核心有效成分與它們之間均有結(jié)合作用,且與AKT1結(jié)合能最低。核心靶點(diǎn)中TNF-α、IL-6均在RA滑膜微環(huán)境中高度表達(dá),并通過直接或間接作用于RA滑膜組織中的不同細(xì)胞類型產(chǎn)生促血管生成分子,促使內(nèi)皮細(xì)胞異常增殖,促進(jìn)微血管新生進(jìn)一步形成RA病理血管翳[9-11]; AKT1屬于PI3K-AKT通路蛋白,該通路介導(dǎo)細(xì)胞增殖、分化和凋亡等多種細(xì)胞功能[12];這3個(gè)靶點(diǎn)與RA密切相關(guān)。提示,ZHZTP可通過作用AKT1和TNF、IL-6調(diào)控RA疾病的細(xì)胞水平和分子水平,從而發(fā)揮治療RA的作用。

Fig 6 Complicated network of “active compounds-targets-pathways” mediated by Zhi-Huang-Zhi-Tong powder in RA treatment

Fig 7 Effect of ZHZTP on cell viability of HUVECs or TNF-α-stimulated HUVECs

考慮到RA病理性血管翳的形成是由于血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移及侵襲能力增強(qiáng),促進(jìn)滑膜組織新生血管形成,為增生的滑膜組織供血供氧,進(jìn)一步促進(jìn)滑膜增生,加重RA病理發(fā)生發(fā)展。因此,我們分別考察ZHZTP對HUVECs活力及遷移能力的影響。

此外,TNF-α在RA病理過程中起著“中心犯罪的作用”,因此,我們采用TNF-α誘導(dǎo)HUVECs研究VEC功能的重要細(xì)胞系)細(xì)胞模型,評(píng)估ZHZTP對TNF-α誘導(dǎo)HUVECs活力、遷移作用及相關(guān)機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)ZHZTP可抑制由TNF-α誘導(dǎo)的HUVECs異常增殖,及遷移;進(jìn)一步機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)ZHZTP可能與下調(diào)PI3K/AKT/m-TOR信號(hào)通路有關(guān)。

Fig 8 Effect of ZHZTP on migration of TNF-α

Fig 9 Effect of ZHZTP on expression of PI3K, AKT and m-TOR in TNF-α induced HUVECs

4 結(jié)論

ZHZTP抗RA的有效物質(zhì)基礎(chǔ),主要為熊果酸、大黃素,可能通過PI3K/AKT/m-TOR信號(hào)通路抑制HUVECs細(xì)胞活力、遷移發(fā)揮抗RA作用。