紅芪抗放化療所致靶器官損傷作用機制及其“構-效-量”關系

趙沙沙,何 海,王姿楊,邢耀瑩,任 遠,邵 晶,3,4

(1.甘肅中醫藥大學,2. 西北中藏藥省部共建協同創新中心,3.甘肅省中藥藥理與毒理學重點實驗室,4.甘肅省高校中(藏)藥化學與質量研究省級重點實驗室 ,甘肅 蘭州 730000)

放化療作為腫瘤治療的主要方式之一,會引起肝、腎、胃腸等方面的靶器官損傷,其副作用不可忽視。放療過程中,射線在穿透人體組織到達腫瘤前,會對正常組織造成一定損傷;化療是一種全身性的治療手段,在殺傷和抑制癌細胞的同時,又不可避免地對正常組織和器官產生毒性,例如骨髓抑制、胃腸道毒性、肝臟毒性、腎和膀胱毒性、免疫功能低下等[1]。紅芪是甘肅的道地藥材,為HedysarumpolybotrysHand.-Mazz的干燥根。2020版《中華人民共和國藥典》記載其具有補脾益氣、生津養血、固表止汗及利水消腫等功效,現代研究表明,其具有抗炎[2]、抗腫瘤、防治肝損傷、胃損傷等[3]藥理作用。此外,文獻報道紅芪提取物對放射性心肌細胞損傷、放射性肺損傷[4]具有保護作用,但其抗放化療所致的靶器官損傷保護作用的可能藥效機制并未明確。

中醫的醫療理念具有整體觀、系統觀的特點,中藥作用機制具有“多組分、多靶點、多通路”的特點[5]。網絡藥理學-分子對接技術的應用突破了傳統研究方式,是現代生物醫藥研究的哲學理念與研究模式的轉變的代表性研究理念和方法。其可多層次、多角度分析中藥治療疾病的物質基礎及作用機制的特點,與中醫藥的特點殊途同歸。因此,本研究通過網絡藥理學和分子對接技術預測紅芪抗放化療所致靶器官損傷保護作用的潛在“成分-靶點-通路”,基于其潛在作用機制通過動物實驗驗證,并結合HPLC含量測定探討其主要活性成分的“量-效”關系,為后續研究及臨床應用提供參考。

1 材料與儀器

1.1 動物SPF級Wistar種大鼠,雌雄各半(200±20 g),購自中國農業科學院蘭州獸醫研究所實驗動物中心,許可證號:SCXK(甘)2020-0002,質量合格證號:0002370,適應性飼養1周,飼養于甘肅中醫藥大學SPF實驗動物中心。

1.2 藥品及試劑紅芪藥材購自甘肅普蘭特有限公司,經甘肅中醫藥大學崔治家教授鑒定為豆科植物多序巖黃芪HedysarumpolybotrysHand.-Mazz的干燥根。對照品:毛蕊異黃酮(批號:Y29J2H391 62)、金雀異黃酮(批號:H30A9Z69019)、毛蕊異黃酮苷(批號:Y16O11H127829)、芒柄花黃素(批號:H06S9Z69494)、槲皮素(批號:C28J11Y116820)、刺芒柄花苷(批號:M02A11S120167)、異甘草素(批號:H03D9Z76567)、美迪紫檀素(批號:Y12M11H112983)純度均≥98%,購自上海源葉生物科技有限公司,貞芪扶正顆粒(批號:K20210842)購自甘肅扶正藥業科技股份有限公司,注射用順鉑(凍干型)(批號:1J0535B03)購自齊魯制藥有限公司。肌酐含量試劑盒(Cr,批號:20220601-RXWB0459-96)、尿素試劑盒(BUN,批號:20220601-RXWB0153-96)、丙氨酸氨基轉移酶試劑盒(ALT,批號:20220601-RXWB0374-96)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST,批號:20220601-RXWB0098-96)試劑盒、大鼠胃動素ELISA試劑盒(MTL,批號:20220601-RX302272R)、大鼠血管活性腸肽ELISA試劑盒(VIP,批號:20220601-RX302215R)、大鼠白細胞介素10 ELISA試劑盒(IL-10,批號:20220601-RX302880R)、大鼠腫瘤壞死因子α ELISA試劑盒(TNF-α,批號:20220601-RX302058R),均購自泉州市睿信生物科技有限公司。乙腈、甲酸、甲醇(色譜純,天津大茂化學制劑廠),95%乙醇,乙酸乙酯,石油醚,正丁醇(分析純,天津市大茂化學試劑廠),水為超純水。

1.3 儀器Waters e2695型高效液相色譜儀(美國Waters公司),XS205DU型十萬分之一電子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司),CP513型電子分析天平(奧豪斯儀器常州有限公司),DHG-9070B型智能電熱恒溫鼓風干燥箱(上海瑯玕實驗設備有限公司),Milli-Q超純水系統(德國墨克生命科學公司),SHB-IIIA型循環水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司),SB-5200DTD型超聲波清洗儀(寧波新芝生物科技股份有限公司),HH-s4型恒溫數顯水浴鍋(江蘇正基儀器有限公司)。

2 方法與結果

2.1 網絡藥理學及分子對接的作用機制與“構-效”預測

2.1.1紅芪活性成分的篩選 以TCMSP線上數據庫篩選紅芪化學成分。以口服生物利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18為篩選條件。篩選得到美迪紫檀素、毛蕊異黃酮、芒柄花素等14個成分,由于所得成分中具有代表性的成分不多,因此查閱文獻篩選近年學者研究較多的成分,另加入紅芪所含的金雀異黃酮、毛蕊異黃酮苷等13種成分,共27種成分(如Tab 1所示),使得基礎分析對象的數據能盡可能全面并接近原中藥功效的整體性和真實性。

2.1.2紅芪對放化療引起的靶器官損傷保護作用靶點的獲取 基于“2.1.1”得到的化合物利用Uniprot線上數據庫和SwissTarget Prediction在線平臺預測紅芪活性成分靶點324個;在人類基因數據庫(Gene Cards)和比較毒物基因組學數據庫(CTD)兩個平臺,以“Target organ damage caused by radiotherapy and chemotherapy”為檢索詞,獲得放化療引起的靶器官損傷的疾病靶點2 069個,對活性成分和疾病預測靶點進行映射取其交集,篩選得到紅芪對放化療引起的靶器官損傷保護作用的潛在靶點177個。

Tab 1 Main active components of Radix Hedysari screened out

2.1.3“中藥-化合物-靶點”網絡的構建 將“2.1.1”所得27種成分及“2.1.2”所得177個交集靶點導入Cytoscape 3.8.2軟件構建可視化調控網絡,以探究紅芪抗放化療引起的靶器官損傷的藥效作用機制。如Fig 1所示,紅色代表化合物,紫色代表靶點,分為3圈,由里到外分別代表可被1種化合物調控(103)、可被2-3種調控(44)、可被4種以上調控(26)。按照degree值≥20的化合物有4種,分別為槲皮素(105)、熊果酸(44)、芒柄花素(24)、柚皮素(22),分別可調控145、43、23、21個靶點,可作為重點化合物。

2.1.4PPI蛋白互作網絡構建及關鍵靶點篩選 將“2.1.2”所得177個交集靶點導入String數據庫對其潛在靶點進行蛋白互作,選擇最高置信度0.900,得到初級互作網絡并以Cytoscape 3.8.2軟件進行拓撲分析。以Degree進行分析,以網絡參數中心性、接近中心度、中介中心度3種條件進行限定和篩選,得到起調控作用的8個關鍵靶點(TP53、MAPK1、MAPK3、AKT1、JUN、HSP90AA1、TNF、ESR1)。PPI網絡圖如Fig 2所示,黑色框中綠色圓形節點為紅芪-放化療引起的靶器官損傷預測靶點,三角符號為Degree>15所得節點,藍色框中棱形節點為betweeness>0.042所得節點,綠色框中V形節點為closeness>0.340所得關鍵節點,靶點信息見Tab 2。

Tab 2 PPI core target information

2.1.5 生物信息學分析將“2.1.2”篩選所得177個共同靶點導入Omicshare平臺進行KEGG和GO分析。

2.1.5.1 基因本體(GO)分析 GO分析得到(Pvalue<0.01)184個細胞組分(CC),紅芪抗放化療引起的靶器官損傷靶點基因在細胞組分(CC)層面與膜區域、膜微區、膜筏、細胞質部分有最顯著相關;而在312個分子生物學功能(MF)層面最顯著表現的是信號受體結合活性和酶結合活性,其次為轉錄因子結合活性;參與了3 182個生物過程(BP)富集到最主要的途徑為對化學物質的反應、對有機物的反應、對含氧化合物響應,見Tab 3。

2.1.5.2 京都基因與基因組百科全書(KEGG)分析 KEGG分析得到(Pvalue<0.01)150條通路,Fig 3展示了前20個顯著差異通路,一級分類有4種:環境信息加工分類、細胞過程、生物體系統、人類疾病分類。前3種分類各自僅一條通路排入前20,可作為重點通路:腫瘤壞死因子信號通路(ko04668)、細胞衰老(ko04218)、白細胞介素-17信號通路(ko04657),第4種則有17條富集通路,其中膀胱癌(ko05219)Rich Factor值最大,Pvalue值最小,可作為此類重要的通路。四類一級分類相較而言,人類疾病分類在紅芪抗放化療引起的靶器官損傷的通路中更重要些,其次為生物體系統分類和環境信息加工分類。

Fig 1 Diagram of “herbs, components and targets”

Fig 2 PPI network diagram

2.1.6“活性成分-靶點”的分子對接驗證 以“2.1.4”所得8種核心靶點基因作為受體;以“2.1.3”所得4種重點活性成分作為配體。利用Uniprot數據庫獲得靶點唯一且穩定的條目識別符(Entry號),輸入蛋白質結構數據庫(RCSB PDB),以pdb格式導出選擇分辨率(refinement resolution ?)分辨率最好的且自帶小分子配體的結晶復合物;由TCMSP數據庫和ChemBio3D Ultra 14.0軟件得到活性成分3D分子結構,分別進行分子對接獲得親和力分析,以結合能≤-5.0 kJ·mol-1作為篩選標準,對其進行最低能量的計算和結構的優化,獲得穩定的分子構象。并利用Pymol和AutoDockTools-1.5.6處理配體和受體,以Vina進行運算對接,對比其親和力大小和構象的合理性,獲得最佳受體蛋白和配體分子,利用Pymol和Ligplot軟件進行可視化。

對接結果顯示,與槲皮素具有高親和力的為HSP90AA1(6tn5蛋白受體),與熊果酸具有高親和力的為TP53(3d06蛋白受體),與芒柄花素具有高親和力的為HSP90AA1(6tn5蛋白受體),與柚皮素具有高親和力的為MAPK3(9qtb蛋白受體),見Tab 4。

Fig 4各化合物分子對接分析結果顯示,分子均位于蛋白的活性空腔內,且兩者均有較好的匹配,為紅芪中這4種化合物與蛋白受體間的相互作用提供了基礎。相互作用2D圖中4種成分分別與周圍的蛋白質殘基形成的氫鍵作用力(綠色虛線)和疏水作用力(紅色半弧形),各化合物與周圍氨基酸殘基結合緊密,存在著明顯的作用力,這些結構與特點的存在,增強了化合物與靶點蛋白之間的相互作用,使化合物和對應靶點對接形成穩定構象,有助于與靶點蛋白的結合。

2.2 “構-效-量”關系驗證

2.2.1動物實驗驗證

2.2.1.1分組造模及給藥 分組:以苦味酸對大鼠進行順序編號,隨機分為7組,每組6只。包括正常組(normal group,NG)、模型組(model Group,MG)、對照組(control group,CG)、藥物組:(水提物低劑量組(water extract group-L,WEG-L)、水提物中劑量組(water extract group-M,WEG-M)、水提物高劑量組(water extract group-H,WEG-H)。

Tab 4 Molecular docking affinity table of main active components of Hedysari Radix and key targets

Fig 4 Results of molecular docking analysis

造模給藥:除正常組外均以1 mg·kg-1順鉑腹腔注射,連續7 d,進行造模,正常組:每只灌胃0.9%氯化鈉溶液1 mL/100 g灌胃,連續7 d;對照組:貞芪扶正顆粒0.54 g·kg-1連續7 d灌胃給藥;藥物組:按照大鼠體質量連續7 d灌胃給藥(水提物低劑量組1.35 g·kg-1,水提物中劑量組2.7 g·kg-1,水提物高劑量組5.4 g·kg-1,均按生藥量計算)。

(注:給藥按體表面積折算,人的臨床劑量與大鼠的等效劑量的比值為0.018。成人體質量70 kg,大鼠體質量0.2 kg)

大鼠劑量=30 g/70 kg×70 kg×0.018/0.2 kg=2.7 g·kg-1

2.2.1.2 體質量及進食量監測 從d 1起,每日定量給食100 g,并于每日相同時間對各鼠進行稱體質量,以便從外部觀測其體質量及進食量變化。Fig 5顯示,除正常組外進食量均逐漸降低,模型組比較其他組進食量最低。體質量均呈現先升高后降低的情況,模型組的體質量自d 2起降低幅度最大。

Fig 5 Weight and water intake of rats with Hedysarum rubrum

如Fig 6所示,各因子模型組含量均明顯增加或降低(P<0.01),對照組與模型組相比各因子含量差異均有統計學意義(P<0.01,P<0.05),Fig 6A顯示與模型組相比VIP和MTL含量均明顯升高(P<0.01),肝因子AST和ALT以及腎因子Cr和BUN均出現明顯的降低(P<0.01或P<0.05)如Fig 6B,C,如Fig 6D所示,抑炎因子IL-10回升,促炎TNF-α下降(P<0.05)。

2.2.2主要成分的含量測定

Fig 6 Effect of Radix Hedysari on contents of various factors in serum of rats with target organ injury caused by

2.2.2.1 色譜條件 色譜柱:大連依利特SinoChrom ODS-AP(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱溫:25℃;流動相:乙腈(A)-0.2%甲酸水溶液(B);梯度洗脫(0～15 min,17%～33% A;15～20 min,33%～34% A;20～24 min,34%～37% A;24～27 min,37%～38% A;27～30 min,38%～40% A;30～35 min,40%～43% A;35～45 min,43%～90% A);流速為0.6 mL·min-1;檢測波長:260 nm;進樣量為10 μL。

2.2.2.2 供試品溶液的制備 稱取紅芪飲片100 g,加10倍量水,回流兩次,分別2.0 h和1.5 h,合并兩次濾液并濃縮、干燥至恒重。精密稱取上述水提物0.250 0 g,置于5 mL容量瓶中,加甲醇溶解,定容,即得。

2.2.2.3 對照品溶液的制備 稱取各對照品適量,加甲醇分別制成一定濃度的母液,后分別量取一定體積混合,配制成每1 mL含0.024 0 mg毛蕊異黃酮苷、0.028 8 mg刺芒柄花苷、0.024 0 mg毛蕊異黃酮、0.024 0 mg槲皮素、0.025 2 mg金雀異黃酮、0.024 0 mg異甘草素、0.026 4 mg芒柄花素、0.027 6 mg美迪紫檀素的混合對照品溶液,即得。

2.2.2.4 方法學考察

2.2.2.4.1 線性關系考察 取混合對照品溶液,用甲醇稀釋成系列不同濃度,按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定,以濃度(g·L-1)為橫坐標,峰面積為縱坐標,考察各成分的線性關系,結果表明各成分線性關系良好,具體見Tab 5。

2.2.2.4.2 精密度 精密吸取同一對照品溶液,連續進樣6次,記錄各成分峰面積,分別計算RSD值,結果顯示6次檢測結果各成分相對峰面積的RSD均小于1.0%,表明儀器精密度良好。

2.2.2.4.3 重復性 精密吸取紅芪供試品溶液,平行制備6份樣品,進樣測定,記錄各成分的峰面積,分別計算RSD值,結果顯示6份樣品中各成分相對峰面積的RSD均小于3.0%,表明各成分在此方法下的重復性良好。

Fig 7 Chromatogram

Tab 5 Results of linear relationship test of eight active components in Radix Hedysari

2.2.2.4.4 穩定性 精密吸取紅芪供試品溶液,分別在0、2、4、8、12、24 h進樣,記錄各成分的峰面積,結果顯示各成分6個時間點檢測的相對峰面積的RSD均小于3.0%,表明各成分在24 h內均穩定性良好。

2.2.2.4.5 加樣回收率試驗 取已知成分含量的紅芪供試品9份,每份約25 mg,按低、中、高3組分別精密加入各對照品溶液,按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定,計算加樣回收率及RSD,結果顯示毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、槲皮素、金雀異黃酮、異甘草素、芒柄花素、美迪紫檀素的平均回收率依次為97.80%、101.15%、100.19%、100.69%、103.01%、102.58%、97.51%、99.05%,RSD值依次為0.43%、0.29%、0.42%、0.37%、0.27%、0.88%、0.40%、0.56%。

2.2.2.5 樣品含量測定 稱取紅芪水提物,并按照“2.2.2.2”項下方法制備供試品溶液,按照“2.2.2.1”項下色譜方法進行測定,分別計算紅芪中8個活性成分的含量。

結果顯示,芒柄花苷含量最高,達到2.743 5 μg·g-1,毛蕊異黃酮苷含量第二(2.449 0 μg·g-1),而二者的苷元含量分別為芒柄花素(1.038 6 μg·g-1)、毛蕊異黃酮(1.270 3 μg·g-1),其他成分含量為美迪紫檀素(1.587 2 μg·g-1)、異甘草素(1.103 2 μg·g-1)、金雀異黃酮(0.715 9 μg·g-1)、槲皮素(0.618 5 μg·g-1)。

Fig 8 Content of different components of Radix Hedysari

3 討論

本文通過網絡藥理學篩選出4種抗放化療所致靶器官損傷的有效活性成分和相應的8個靶點及4條重要信號通路。在此基礎上將篩選出的4種化學成分與8個靶點進行分子對接,結果表明槲皮素與HSP90AA1,熊果酸與TP53,芒柄花素與HSP90AA1,柚皮素與MAPK3具有較好的結合活性,這提示HSP90AA1、TP53、MAPK3可能為紅芪抗放化療所致靶器官損傷的重要靶點。HSP90AA1為14號染色體的基因,該基因編碼的蛋白質是可誘導的分子伴侶,能維持和調節特定靶蛋白的結構和功能的完整性從而調節細胞存活、增殖與凋亡。馮茵怡等[6]研究表明,通過調控HSP90AA1靶點介導信號通路可發揮抗纖維化作用。TP53為17號染色體的基因,由這種基因編碼的蛋白質是一種轉錄因子,其控制著細胞周期的啟動,DNA損傷時,TP53被激活,從而誘導細胞周期阻滯、凋亡、衰老、DNA修復或代謝改變。齊振強等[7]研究表明,上調TP53蛋白表達可對腎小球內皮細胞缺血損傷具有顯著保護作用。MAPK3為絲裂原活化蛋白激酶3,參與細胞因子的產生、胞吞作用、細胞遷移、染色質重塑和轉錄調節。已有研究發現MAPK3表達的下調在炎性腸病相關的結直腸癌中發揮著重要的作用。

本研究對靶點進行富集分析,以探尋紅芪抗放化療所致靶器官損傷所調控的重要信號通路及其作用機制,結果顯示膀胱癌信號通路、TNF信號通路、細胞衰老、IL-17信號通路等與其保護作用密切相關。四條重點通路中,膀胱癌通路中腫瘤通常以p53和RB通路的改變為特征,這些通路通常通過與Ras-絲裂原活化蛋白激酶信號轉導通路(MAPK)相互作用來調節細胞周期[8]。IL-17信號通路由IL-17A-F組成的細胞因子通路集合,IL-17家族是細胞因子的一個新分類亞群,在急性和慢性炎性反應中均起關鍵作用[9]。TNF信號通路中主要的靶點為TNFR1和TNFR2,研究發現TNF通過這兩種跨膜受體發揮生物效應。TNFR1在幾乎所有類型的細胞上都表達[10],是主要負責啟動炎癥反應的TNF受體。

分子對接顯示4種化合物與蛋白受體之間均有較好的匹配,相互作用分析表明兩者可形成較穩定的氫鍵和產生較有利的疏水作用。研究發現槲皮素可改善胃潰瘍并可調控肝自噬[11],可通過抑制MAPK途徑改善缺血/再灌注損傷的傷口愈合過程[12];芒柄花素為紅芪的主要活性成分之一,對順鉑所致以及膿毒癥誘導的急性腎損傷具有一定保護作用[13],可減少小腸黏膜損傷[14];另有研究表明,柚皮素可以降低血管炎性、抑制肝纖維化[15]、改善腎損傷;熊果酸被發現可通過抑制NOX4/ROS和RhoA/ROCK1信號通路逆轉肝纖維化[16]并可通過通過誘導自噬治療急性腎損傷發揮抗炎活性[17]。

動物實驗表明,紅芪水提取物可提升順鉑所致的胃腸損傷因子VIP和MLT的表達水平,可降低腎損傷因子Cr和BUN以及肝損傷因子AST和ALT的表達水平,提示紅芪對順鉑所致的靶器官損傷具有一定的保護作用且存在劑量依賴,其中高劑量組各因子改善效果更明顯。此外抑炎因子IL-10和促炎因子TNF-α的表達水平有所改善,表明紅芪水提物對于順鉑所致的機體炎性損傷有所修復。

本實驗建立了8種黃酮類成分同時測定的含量測定方法,結果表明芒柄花苷、毛蕊異黃酮苷、美迪紫檀素含量較高。但是網絡藥理學和分子對接結果顯示芒柄花素在調控紅芪抗放化療所致靶器官損傷的過程中起重要作用。其原因可能是黃酮苷類化合物進入人體會被腸道微生物所產生的酶分解為相對應的苷元而發揮作用[18],故推測紅芪抗放化療所致靶器官損傷的真正效用計量應以芒柄花苷和芒柄花素合計,這與生物體內苷和苷元的相互轉化有關。

本研究建立了紅芪成分的“構”與其對放化療所致靶器官保護的“效”之間的關系,初步探討闡明了紅芪通過多成分、多靶點、多通路對放化療引起的靶器官損傷保護作用的可能性分子機制:芒柄花素、槲皮素、熊果酸、柚皮素等活性成分作用于TP53、HSP90AA1、MAPK3等靶點調節膀胱癌、TNF信號通路、細胞衰老、IL-17信號通路等多條通路發揮作用,同時通過動物實驗進一步對“效”進行協同驗證,并利用HPLC法對其活性成分的“量”進行測定,構建了紅芪對靶器官保護的“構-效-量”關系,以期為紅芪抗放化療所致靶器官損傷的物質基礎及作用機制研究提供理論依據。