基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接探究祖卡木顆粒治療支氣管哮喘的作用機(jī)制

候艷敏,徐 梅,張麗娟,李俞瑤,周文欣,王航宇,王金輝,3,劉 冬,張 珂

(1.石河子大學(xué)藥學(xué)院/新疆植物藥資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,2. 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院,新疆 石河子 832002;3. 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150081)

近年來(lái),以氣管哮喘為代表的各種呼吸系統(tǒng)疾病,隨著全球氣候變化和環(huán)境污染的影響,發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì),給人們的身體健康和生命安全帶來(lái)了重大威脅[1]。支氣管哮喘,簡(jiǎn)稱(chēng)哮喘,常表現(xiàn)為氣道慢性炎癥,是一種異質(zhì)性疾病。這類(lèi)慢性炎癥與氣道高反應(yīng)性相關(guān)[2],并伴有可逆的氣流受限,會(huì)反復(fù)出現(xiàn)如喘息、氣短、胸悶、咳嗽等癥狀。支氣管哮喘如果沒(méi)有及時(shí)進(jìn)行診治,隨著病程的延長(zhǎng)可產(chǎn)生氣道不可逆性縮窄和氣道重塑[3],因此,明確其發(fā)病的機(jī)制,尋找有效的治療方法和研制出有效的藥物對(duì)哮喘的防治有著十分重要的現(xiàn)實(shí)意義和較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

祖卡木顆粒(zukamu granules,ZKMG)中主要含有山柰、睡蓮花、破布木果、薄荷、大棗、洋甘菊、甘草、蜀葵子、大黃、罌粟殼,具有調(diào)節(jié)異常氣質(zhì),清熱,發(fā)汗,通竅等功效,可用于治療感冒咳嗽,發(fā)熱無(wú)汗,咽喉腫痛等病癥。現(xiàn)如今,對(duì)ZKMG的研究顯示,ZKMG具有解熱、鎮(zhèn)痛抗炎的作用,但是對(duì)其具體的作用機(jī)制報(bào)道較少[4]。

大量研究證明,中藥能夠改善哮喘發(fā)生的各個(gè)環(huán)節(jié),如緩解氣道炎性反應(yīng)[5]。近年來(lái),網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)逐漸成為中藥研究領(lǐng)域中最常用的方法之一,這個(gè)概念最早是2007年由Andrew L Hopkins提出[6]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是建立在高通量組學(xué)數(shù)據(jù)分析、計(jì)算機(jī)虛擬計(jì)算和網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索的基礎(chǔ)上,側(cè)重于生物學(xué),生物網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和分析,揭示藥物的有效性,毒性和代謝特征[7]。它的出現(xiàn)終結(jié)了“一個(gè)藥物、一個(gè)靶標(biāo)、一種疾病”為主導(dǎo)的藥物研發(fā)模式,開(kāi)啟了多靶點(diǎn)與多種疾病間復(fù)雜網(wǎng)狀關(guān)系的新型研究模式。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法系統(tǒng)分析ZKMG抗支氣管哮喘的作用機(jī)制,并通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供SPF級(jí)健康BALB/c雌性小鼠60只,體質(zhì)量(18～22)g,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(新)2018-0001。給予實(shí)驗(yàn)鼠正常光照,自由飲食飲水,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)安排,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑卵清蛋白(ovalbumin,OVA)(北京索萊寶科技有限公司,批號(hào)912E054),地塞米松磷酸鈉注射液(天津金耀藥業(yè)有限公司,批號(hào)51705171),MDA測(cè)試盒,T-SOD測(cè)試盒,NO測(cè)試盒,GSH-Px測(cè)試盒,BCA總蛋白定量測(cè)定試劑盒,快速瑞氏-姬姆薩染色試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號(hào)20210609、20210508、20210511、20210518、20210528、20170923),蛋白裂解液(RIPA)、苯甲基磺酰氟(PMSF)(北京索萊寶科技有限公司,貨號(hào):R0010、P8340),特超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司,貨號(hào):P0018A),小鼠IL-17A、IL-23 ELISA試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司,貨號(hào)A21710141、A22310216),IκBα抗體、NF-κB p65抗體(武漢博士德生物有限公司,貨號(hào):BM3932、BA0610),Phospho-IκBα抗體(Cell Signaling Technology公司,批號(hào)9246S),一抗:ERK1/2 、p-ERK1/2、p38、p-p38(博士德生物工程有限公司 BM4326、BM5446、PB9290),β-actin抗體、山羊抗兔、山羊抗小鼠(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,貨號(hào):16A00205、ZB-2301、ZB-0312)。

1.3 主要儀器Thermo 3001全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司),超聲霧化器(NB-150U,德國(guó)歐姆龍),GT200球磨儀(上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司),TGL-16B離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)制造),DYCZ-24DN電泳儀(北京六一生物科技有限公司),Axio Imager A2蔡司正置熒光顯微鏡(北京博瑞斯科技有限公司),UVP凝膠成像儀(美國(guó)UVP公司),LEGEND MICRO 21R高速冷凍離心機(jī)(賽默飛世爾科技有限公司),DB-09型石蠟包埋機(jī)(湖北德力森科技有限公司),石蠟切片機(jī)(北京盛科信德科技有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 活性化合物篩選及建立目標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)以口服生物利用度(OB)≥30%、類(lèi)藥性(DL)≥0.18為條件,通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索祖卡木顆粒中10種中藥的化學(xué)成分,篩選化學(xué)成分及相應(yīng)的蛋白靶點(diǎn),并通過(guò)參考文獻(xiàn)進(jìn)行補(bǔ)充。將化學(xué)成分的SMILES號(hào)導(dǎo)入SwissADME數(shù)據(jù)庫(kù)中,將GI absorption-High, Druglikeness有2個(gè)Yes作為化合物篩選條件,篩選后的化合物利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)和SwisstargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行靶標(biāo)預(yù)測(cè)。在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù),輸入“bronchial asthma”,得到疾病靶點(diǎn),將疾病靶點(diǎn)和成分預(yù)測(cè)靶點(diǎn)通過(guò)Venny將這兩部分相交,得到關(guān)鍵靶點(diǎn)。

2.2 構(gòu)建藥物-組分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖和蛋白-蛋白交互作用網(wǎng)絡(luò)將通過(guò)篩選的化合物以及關(guān)鍵靶點(diǎn)的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape(3.8.1版本)進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化,構(gòu)建了藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。在STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中導(dǎo)入基因靶標(biāo),Cytoscape中優(yōu)化蛋白-蛋白交互作用網(wǎng)絡(luò)。

2.3 基因本體富集分析(GO)與京都基因和基因組百科全書(shū)通路富集分析(KEGG)利用Metascap平臺(tái)對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO與KEGG富集分析,篩選條件P<0.01,利用微生信在線(xiàn)工具對(duì)富集結(jié)果進(jìn)行可視化。

2.4 分子對(duì)接選擇PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點(diǎn)與藥物的核心成分進(jìn)行分子對(duì)接,通過(guò)PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)獲得核心成分的3D結(jié)構(gòu),保存為MOL2格式。大分子靶蛋白的PDB格式文件通過(guò)PDB數(shù)據(jù)庫(kù)下載。分子活性位點(diǎn)對(duì)接借助Discovery studio 4.5軟件進(jìn)行。

2.5 模型的建立及給藥將60只雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為6組,每組10只,分為正常組(Control)、OVA組(5 mg·kg-1),祖卡木顆粒低、中、高劑量組(ZKM-L:1.6 g·kg-1,ZKM-M:4.8 g·kg-1,ZKM-H:14.4 g·kg-1)和地塞米松陽(yáng)性對(duì)照組(DEX,2 mg·kg-1)。

小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周即開(kāi)始造模,在d 1和d 4時(shí),正常組腹腔注射生理鹽水,其余5組腹腔注射OVA致敏液(0.5 g·L-1,OVA干粉100 mg,2 mg氫氧化鋁,200 mL生理鹽水)進(jìn)行致敏,造模成功后,在d 21～34,進(jìn)行實(shí)驗(yàn)干預(yù),每天對(duì)正常組以及OVA模型組用生理鹽水進(jìn)行灌胃,ZKM(L,M,H)組的小鼠用不同濃度祖卡木顆粒進(jìn)行灌胃給藥治療,DEX組進(jìn)行腹腔注射地塞米松(2 mg·kg-1)進(jìn)行治療。在d 27～34,對(duì)OVA組、ZKM-L、ZKM-M、ZKM-H以及DEX組用超聲霧化器對(duì)小鼠進(jìn)行1% OVA(OVA 500 mg溶于50 mL生理鹽水,現(xiàn)用現(xiàn)配)霧化刺激,每天30 min,正常組的小鼠采用100 mL生理鹽水進(jìn)行霧化激發(fā)。在末次OVA激發(fā)24 h后,對(duì)小鼠進(jìn)行摘眼球取血,血樣置于4 ℃,5 000 r·min-1離心10 min,取上清液,-80 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩Ｈ〔糠中∈蠓谓M織灌注1 mL生理鹽水,連續(xù)灌注3次,回收率約70%～80%,得肺泡灌洗液(BALF)。每組取部分小鼠左下葉肺固定于10%的福爾馬林溶液中,用于后續(xù)的病理學(xué)觀(guān)察,其余肺組織采集稱(chēng)質(zhì)量后置于-80 ℃保存,待進(jìn)一步檢測(cè)。肺系數(shù)計(jì)算方法:肺系數(shù)=肺質(zhì)量/體質(zhì)量×100%。

2.6 肺泡灌洗液(BALF)細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)及染色將采集到的BALF放入EP管中,4 ℃低溫條件下3 000 r·min-1離心10 min后取下層沉淀物進(jìn)行細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)和瑞氏-姬姆薩染色,在光學(xué)顯微鏡下區(qū)分不同細(xì)胞。

2.7 肺組織病理學(xué)觀(guān)察將肺組織固定在10%甲醛中24 h后,進(jìn)行梯度乙醇脫水,石蠟包埋、切片,對(duì)肺組織病理切片進(jìn)行蘇木精-伊紅染色和三色染色,高倍光學(xué)顯微鏡觀(guān)察各組織的病理學(xué)變化。

2.8 小鼠血清中IL-17A以及IL-23的含量取小鼠血清進(jìn)行IL-17A以及IL-23的含量檢測(cè),具體實(shí)驗(yàn)操作按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)中的方法進(jìn)行。

2.9 測(cè)定MDA、NO的含量以及T-SOD和GSH-Px的活力將小鼠肺組織,用冷0.9%生理鹽水制成10%的組織勻漿,4 ℃,3 500 r·min-1,離心10 min,取上清用于MDA、NO、T-SOD和GSH-Px含量及活性的檢測(cè),具體操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2.10 Western blot用RIPA裂解緩沖液從肺組織中提取總蛋白,根據(jù)核蛋白提取試劑盒說(shuō)明從肺組織中提取核蛋白。蛋白濃度按照BCA蛋白檢測(cè)試劑盒進(jìn)行測(cè)定。通過(guò)凝膠電泳將等量的蛋白質(zhì)樣品分離,并將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%封閉液封閉后,將膜與一抗進(jìn)行孵育,4 ℃下過(guò)夜。用TBST洗滌4次后,與山羊抗小鼠/兔二抗室溫孵育1.5 h。然后用TBST洗滌4次,用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑形成膜上的蛋白條帶。用Image-Pro Plus 6.0軟件檢測(cè)蛋白條帶的灰度值,用靶帶與β-actin的比值進(jìn)行半定量分析。

3 結(jié)果

3.1 藥物活性成分、靶點(diǎn)的篩選利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)以及多種開(kāi)源數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)祖卡木顆粒中10種中藥的化學(xué)成分進(jìn)行檢索歸納,經(jīng)過(guò)OB、DL篩選后,最終獲得194種活性成分,剔除重復(fù)靶點(diǎn)后,最終共獲得靶點(diǎn)326個(gè)。

3.2 祖卡木顆粒與支氣管哮喘靶點(diǎn)交集在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索“Bronchial asthma”,去掉疾病靶點(diǎn)的重復(fù)值并進(jìn)行整合,共計(jì)得到靶點(diǎn)1 577個(gè)。借助Venny2.1工具繪制Venn,得到交集靶點(diǎn)176個(gè),結(jié)果見(jiàn)Fig 1A。

3.3 “藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將上述交集靶點(diǎn)和相對(duì)應(yīng)的成分信息文件導(dǎo)入Cytoscape,構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)中有邊(edge)1 722條,節(jié)點(diǎn)(node)378個(gè),節(jié)點(diǎn)的大小,表示在網(wǎng)絡(luò)中的重要性。

3.4 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)的分析為了探討祖卡木顆粒治療哮喘的分子機(jī)制,構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。該P(yáng)PI網(wǎng)絡(luò)由176個(gè)節(jié)點(diǎn)和2 464個(gè)邊組成。對(duì)該網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)進(jìn)行分析,得出靶基因的平均度值為28.5,度值越大,節(jié)點(diǎn)大小越大,對(duì)應(yīng)的重要程度越高。

3.5 祖卡木顆粒治療支氣管哮喘核心靶點(diǎn)獲取將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape中,借助“CytoNCA”插件計(jì)算出節(jié)點(diǎn)交互關(guān)系的DC、BC、CC、LAC等值,以中位數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)逐步篩選核心靶點(diǎn)。得到36個(gè)核心靶點(diǎn),其中包括腫瘤壞死因子(TNF)、白蛋白(ALB)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGFA)、腫瘤蛋白P53(TP53)、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)等與支氣管哮喘有關(guān)的核心靶點(diǎn)。

3.6 GO富集分析及KEGG通路富集分析采用Metascape對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行功能與通路的富集分析,并進(jìn)行結(jié)果可視化,共富集到生物學(xué)過(guò)程883條,細(xì)胞組分40條,分子功能64條,通過(guò)P值篩選排名前20的條目繪圖。KEGG通路富集條目133條,結(jié)合靶點(diǎn)富集數(shù)及Count值篩選條目進(jìn)行分析并作圖。氣泡大小代表基因靶點(diǎn)富集數(shù),氣泡顏色由綠逐漸轉(zhuǎn)紅表明其顯著性越強(qiáng)。主要涉及蛋白質(zhì)多糖與癌癥通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等,結(jié)果見(jiàn)Fig 1B,C。

3.7 分子對(duì)接結(jié)果選擇PPI網(wǎng)絡(luò)中排名前6的靶點(diǎn)以及排名前10的關(guān)鍵成分進(jìn)行分子對(duì)接。根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)分析,將槲皮素、山奈酚、木犀草素、豆甾醇、柚皮素、原阿片堿、異鼠李素、蘆薈大黃素、芹菜素以及7-甲氧素-2-甲基異黃酮作為關(guān)鍵成分,TNF、ALB、VEGFA、TP53、EGFR、SRC作為靶點(diǎn),進(jìn)行分子對(duì)接,選擇Discovery studio 4.5軟件評(píng)分靠前的結(jié)果進(jìn)行可視化展示,具體結(jié)果見(jiàn)Tab 1。

3.8 祖卡木顆粒對(duì)哮喘小鼠肺系數(shù)的影響小鼠肺濕重與正常組相比較,OVA模型組(P<0.01)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,與模型組相比較,ZKM-H(P<0.05)與DEX(P<0.05)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由結(jié)果提示OVA模型組小鼠肺濕重增大,出現(xiàn)一定程度的水腫,通過(guò)給藥后小鼠肺濕重有所降低。其中劑量組ZKM-H效果較為明顯(P<0.05),結(jié)果如Fig 2所示。

3.9 哮喘小鼠肺泡灌洗液細(xì)胞計(jì)數(shù)及染色為了進(jìn)一步研究ZKMG對(duì)OVA誘導(dǎo)的哮喘小鼠的作用,對(duì)小鼠肺泡灌洗液中的總細(xì)胞數(shù)和各類(lèi)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),如Fig 3,4所示,相較于正常組,模型組的總細(xì)胞數(shù)以及各類(lèi)炎癥細(xì)胞數(shù)均明顯增加。相較于模型組,3個(gè)劑量組與陽(yáng)性藥組的總細(xì)胞數(shù)、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞的數(shù)量均明顯減少。

Fig 1 Network pharmacology

Tab 1 Molecular docking software score

Fig 2 Lung wet weight and lung coefficient in asthmatic mice n=8)

3.10 祖卡木顆粒對(duì)哮喘小鼠肺組織病理形態(tài)的影響通過(guò)HE染色與Masson染色進(jìn)一步評(píng)估祖卡木顆粒的抗哮喘作用。由Fig 5結(jié)果顯示,與正常組相比,模型組的肺組織中,細(xì)胞排列紊亂,并伴隨大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與模型組相比,ZKMG劑量組和陽(yáng)性藥組表現(xiàn)出明顯的抗哮喘作用,減輕肺部炎癥現(xiàn)象,肺部細(xì)胞排列也趨于正常化。

Fig 3 Cell Richter-Jimsa staining in alveolar lavage fluid of each group

Fig 4 Cell counts in alveolar lavage fluid of each group n=8)

Fig 5 HE staining of lung tissues of asthmatic mice (400×)

由Fig 6結(jié)果顯示,哮喘模型組小鼠相對(duì)于空白對(duì)照組小鼠,肺組織纖維化明顯,而ZKMG干預(yù)組小鼠肺纖維化程度明顯改善。

3.11 ZKMG對(duì)哮喘小鼠肺組織中NO,T-SOD,GSH-Px以及MDA的影響為了解ZKMG對(duì)哮喘的影響是否參與氧化應(yīng)激過(guò)程,本研究對(duì)小鼠肺組織中的NO、T-SOD、GSH-Px以及MDA進(jìn)行含量檢測(cè),結(jié)果如Fig 7,與正常組相比,OVA模型組肺組織中MDA和NO含量明顯增加(P<0.01),T-SOD和GSH-Px活性明顯降低(P<0.01)。與OVA組比較,ZKM劑量組和DEX組肺組織中MDA和NO的含量相對(duì)降低(P<0.05或P<0.01),T-SOD和GSH-Px的活性明顯升高(P<0.05或P<0.01)。提示,ZKMG可以增加抗氧化劑活性物質(zhì)的含量,并有助于緩解OVA誘發(fā)的哮喘。

Fig 6 Masson staining of lung tissue in asthmatic mice (400×)

3.12 ZKMG對(duì)哮喘小鼠血清中IL-17A與IL-23的影響檢測(cè)血清中IL-17A與IL-23細(xì)胞因子的表達(dá)水平,以探討ZKMG對(duì)哮喘炎性介質(zhì)的影響。結(jié)果Fig 8,與正常組相比,OVA誘導(dǎo)哮喘模型的IL-17A與IL-23細(xì)胞因子在血清中的表達(dá)明顯增加(P<0.05);與OVA模型組相比,ZKM劑量組和DEX組中IL-17A與IL-23的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05),并且呈明顯的劑量依賴(lài)性。這表明ZKMG可以抑制OVA誘發(fā)的哮喘小鼠的血清中IL-17A與IL-23的表達(dá)。

Fig 7 MDA, NO content, T-SOD and GSH Px activity in lung tissue in serum of asthmatic mice n=8)

3.13 ZKMG對(duì)哮喘模型小鼠肺組織中NF-κBp65、IκB-α、p-IκB-α蛋白以及MAPK通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響網(wǎng)絡(luò)藥理富集分析結(jié)果表明,ZKMG治療支氣管哮喘的機(jī)制可能與TNF、VEGFA和ALB有關(guān),它們?cè)谘装Y反應(yīng)中發(fā)揮作用。與OVA組相比,ZKMG抑制了NF-κB p65蛋白的過(guò)度表達(dá),抑制了IκBα蛋白的磷酸化。此外,在炎癥反應(yīng)中,MAPK通路也扮演著重要的角色。因此,我們分析了磷酸化的ERK1/2和磷酸化的p38的水平。如Fig 9所示,OVA組明顯增加了p-ERK1/2和p-p38的表達(dá),在ZKMG處理后,這些表達(dá)均減少。

4 討論

哮喘是世界上最常見(jiàn)的慢性病,哮喘的發(fā)病機(jī)制有幾種,現(xiàn)階段最被大家認(rèn)可的哮喘發(fā)病機(jī)制是氣道免疫-炎癥機(jī)制[8-10],當(dāng)外源性的刺激源通過(guò)各種途經(jīng)進(jìn)入到體內(nèi),被抗原遞呈細(xì)胞內(nèi)吞并激活T細(xì)胞。激活的T細(xì)胞產(chǎn)生白介素激活B淋巴細(xì)胞,從而合成特異性IgE。刺激源如果再次進(jìn)入體內(nèi),會(huì)與細(xì)胞表面的IgE結(jié)合,使細(xì)胞合成多種活性介質(zhì),導(dǎo)致平滑肌收縮,黏液分泌增多以及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),會(huì)出現(xiàn)反復(fù)喘息、氣短、咳嗽、咳痰、喉間哮鳴音等[11]。如果哮喘不能及時(shí)進(jìn)行治療,氣道炎癥和反復(fù)發(fā)作的上皮損傷,會(huì)最終導(dǎo)致氣道重塑。多種炎性因子、多種炎性介質(zhì)均參與了氣道重構(gòu)的形成。故哮喘是由多種炎性細(xì)胞和炎性因子參與的氣道慢性炎癥性疾病。

Fig 8 IL-17A and IL-23 content in serum of

中藥是我國(guó)幾千年來(lái)的瑰寶,在疾病防治中具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)。近年來(lái),隨著系統(tǒng)生物學(xué)、人工智能、多向藥理學(xué)以及其他技術(shù)的快速發(fā)展,網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)也應(yīng)運(yùn)而生[12]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可以根據(jù)中藥中的成分,運(yùn)用多種數(shù)據(jù)庫(kù),快速篩選出潛在靶點(diǎn),預(yù)測(cè)作用機(jī)制,系統(tǒng)性地分析藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)的相互作用[13]。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)了ZKMG治療支氣管哮喘的可能性,并通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了其有效性。

ZKMG在維吾爾醫(yī)藥中,是治療感冒的首選藥方,具有調(diào)節(jié)異常氣質(zhì),清熱,發(fā)汗,通竅等功效。大量臨床應(yīng)用表明,ZKMG對(duì)于上呼吸道感染,具有療效好,見(jiàn)效快,無(wú)毒副作用,且適用于不同年齡階段感冒患者的特點(diǎn)。不斷有研究證明,ZKMG具有解熱、鎮(zhèn)痛和抗炎的作用,但是對(duì)其具體的作用機(jī)制報(bào)道較少。基于ZKMG的抗炎作用,我們希望發(fā)現(xiàn)其對(duì)支氣管哮喘的治療潛力,并開(kāi)發(fā)其新的臨床應(yīng)用價(jià)值。

通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以及分子對(duì)接結(jié)果分析,我們發(fā)現(xiàn)TNF、ALB、VEGFA是ZKMG中活性化合物治療支氣管哮喘的關(guān)鍵靶點(diǎn)。腫瘤壞死因子TNF分為T(mén)NF-α和TNF-β兩類(lèi),TNF-α是介導(dǎo)炎癥和免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)的重要因子,TNF-β可以通過(guò)上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞表面黏附分子的表達(dá),激活巨噬細(xì)胞,從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)[14]。ALB,又稱(chēng)白蛋白,分布于組織和體液中,在組織損傷或炎癥發(fā)生時(shí),ALB分解代謝會(huì)增加,其濃度會(huì)降低。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGFA)屬于VEGF家族,由多種細(xì)胞分泌,而VEGF是已知的最強(qiáng)血管通透劑,在支氣管炎性反應(yīng)和支氣管重塑過(guò)程中起著重要的作用[15]。通過(guò)GO和KEGG富集分析,我們推測(cè)ZKMG抗支氣管哮喘的機(jī)制可能是通過(guò)NF-κB信號(hào)通路、MAPK等通路實(shí)現(xiàn),因此,我們?cè)O(shè)計(jì)了相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證ZKMG抗支氣管哮喘的作用。

哮喘患者由于支氣管氣道中中性粒細(xì)胞的積聚而表現(xiàn)出氧化應(yīng)激增強(qiáng),超氧化物歧化酶活性降低會(huì)造成氣道高反應(yīng)以及氣流阻塞,有研究數(shù)據(jù)表明,哮喘患者呼出的NO濃度高于正常受試者。NO水平的升高和氧化應(yīng)激的增強(qiáng)可能導(dǎo)致強(qiáng)過(guò)氧亞硝酸根的形成,從而導(dǎo)致支氣管氣道中的蛋白質(zhì)亞硝基化,最終導(dǎo)致氣道炎癥[16]。在本研究中,ZKMG治療降低了OVA誘導(dǎo)的哮喘小鼠肺組織中NO和MDA的水平,增高T-SOD和GSH-Px的活力值,提示ZKMG可以通過(guò)降低氧化應(yīng)激改善氣道高反應(yīng)性。

IL-17A是由Th17細(xì)胞分泌,可作用于上皮細(xì)胞,通過(guò)激活核因子-κB (NF-κB)、MAPK等信號(hào)通路促進(jìn)炎癥因子與趨化因子的表達(dá)[17]。IL-23可以促進(jìn)Th17的擴(kuò)增與穩(wěn)定,IL23的含量可作為評(píng)價(jià)哮喘嚴(yán)重程度及氣流受限的參考標(biāo)志[18]。在本研究中,經(jīng)ZKMG治療后,哮喘小鼠肺泡灌洗液中的炎性細(xì)胞數(shù)量減少,血清中IL-17A與IL-23的含量降低,肺組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)以及膠原沉積現(xiàn)象得到改善。Western blot結(jié)果顯示,ZKMG可以通過(guò)調(diào)控NF-κBp65/MAPK通路相關(guān)蛋白表達(dá)達(dá)到抗支氣管哮喘的目的。

5 結(jié)論

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以及分子對(duì)接研究ZKMG對(duì)支氣管哮喘的物質(zhì)基礎(chǔ)以及可能的作用機(jī)制,在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證了ZKMG治療支氣管哮喘的可能性,為ZKMG新的臨床應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。