梔子苷抑制HSP70釋放改善風濕熱痹證膠原性關節炎大鼠血管新生的作用研究

舒 寅,甘珮榮,王 言,卜妍紅,吳 虹

(安徽中醫藥大學藥學院,新安醫學教育部重點實驗室,中藥復方安徽省重點實驗室,安徽 合肥 230012)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis, RA)是一類慢性自身免疫性疾病,RA歸屬中醫“痹癥”、“絡病”范疇,是因外感風濕熱邪,痹阻氣血經絡,滯留于關節筋骨而發病[1]。《素問》中“脈者,血之府也”提醒RA絡病實質是滑膜血管新生。血管新生作為RA主要病理特征之一,是RA遷延不愈的根本原因[2]。血管內皮細胞(vascular endothelial cells, VECs)是血管新生的效應細胞,受多種信號因子網絡調控。在RA病理狀態下,促/抑血管生成因子平衡打破,促血管生成因子占主導作用[3]。風濕熱痹證被認為是RA活動期的主要病機,此證型患者血清、滑膜液中熱休克蛋白70(heat shock proteins 70, HSP70)含量異常升高[4]。因此,辨證論治探究差異物HSP70在風濕熱痹證滑膜血管新生的作用亟需展開深入研究。

HSP70-1A作為HSP70家族的一員,是一種應激誘導蛋白,在大多數非應激的正常細胞和組織中低水平表達,在缺氧、炎癥、熱誘導等應激條件下迅速產生并積累。應激后在細胞內發揮維持蛋白質合成、折疊、降解和轉位的動態平衡作用,是重要的分子伴侶。之前被認為只能在細胞內環境存在并發揮作用,新的研究證實,HSP70-1A也存在于細胞外,并發揮出不同于熟知的分子伴侶功能,包括調節細胞免疫、炎癥,血管新生[5]。近期研究發現,HSP70能夠通過穩定缺氧誘導因子-1(hypoxia-inducible factor-1, HIF-1)α亞基積累,參與多種疾病血管新生過程。細胞外HSP70與人臍靜脈血管內皮細胞(human umbilic vein endothelial cells, HUVECs)表面受體緊密結合,通過細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)依賴機制誘導血管新生[6]。因此,有效降低HSP70的胞外釋放和胞外HSP70與胞膜受體的結合,抑制滑膜血管新生,有望成為RA治療的新策略。

梔子,作為RA臨床常用清熱解毒通絡方君藥,主要藥效成分梔子苷(geniposide, GE)。課題組前期發現GE顯著改善關節炎大鼠滑膜病變和血管新生[7]。GE不僅可以通過調節鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase 1, SphK1)表達和活性來緩解成纖維滑膜細胞的異常增殖,還可以抑制滑膜組織中促血管生成介質的產生,恢復促/抑血管生成因子平衡[8]。梔子性寒,清熱利濕,宣痹通絡,同時風濕熱痹證病因以熱邪為主,熱性炎上,治療應以清熱為基本原則,辨證論治。因此本實驗旨在探究GE是否通過抑制HSP70釋放改善風濕熱痹證CIA大鼠滑膜血管新生。

1 材料與方法

1.1 動物與細胞雄性SPF級SD大鼠,6～8周齡,48只,體質量210±10 g,購于濟南朋悅實驗動物繁育有限公司[合格證號:SCXK(魯)20190003],所有實驗均在安徽中醫藥大學倫理委員會的批準下進行(許可證號:AHUCM-rats-2021049),實驗過程中自然光照周期,自由飲水進食。HUVECs:上海中喬新舟生物科技有限公司,貨號:DFSC-EC-01。細胞使用ECM培養,其中含有5%胎牛血清,1%內皮生長因子和1%青、鏈霉素,培養環境為37 ℃、5% CO2培養箱,當細胞密度至80%時進行胰酶消化傳代。

1.2 試劑與儀器人工氣候造模箱:寧波江南儀器廠;YLS-7C型足趾容積測量儀:北京凱輝盛達科技發展有限公司;紅外熱成像儀:美國FLUKE公司;OLYMPUS BX51 高效熒光顯微鏡:上海富萊光學科技有限公司;GE:深圳海思安生物技術有限公司(hsag1899);甲氨蝶呤(M57520):上海吉至生化科技有限公司;弗氏完全佐劑(F5881):美國Sigma公司;雞Ⅱ型膠原(220184):美國Sigma公司;胎牛血清(fC04001-500):VivaCell;大鼠HSP70 ELISA試劑盒(1935)、人HSP70 ELISA試劑盒(1737):酶免生物;ECM(#1001):美國ScienCell研究實驗室;乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(A020-2-2):南京建成生物工程研究所;CD31 antibody(65058-1-1lg):武漢三鷹生物技術有限公司;VEGF-A antibody(F1019Y):武漢華美生物工程有限公司;HSP70 antibody(250141):成都正能生物技術有限公司。Cell Counting Kit 8(CCK-8)試劑盒(BS3508):白鯊生物科技有限公司;kFluor488 Click-iT EdU成像檢測試劑盒(KGA331-100):凱基生物公司。

1.3 風濕熱痹證CIA大鼠模型的建立及分組給藥將48只大鼠以相同數量(n=8)分別隨機分為6組:正常對照組(Control)、CIA模型組(CIA)、風濕熱刺激CIA模型組(CIA-S)、GE中劑量組(GE-M)、GE高劑量組(GE-H)和陽性藥組(MTX)。除正常組外的大鼠d 1在尾根部皮內注射100 μL CFA與雞II型膠原乳劑(2 g·L-1)等體積混合物,d 7進行二次免疫。從初次免疫當天開始將除正常組和CIA組以外大鼠飼養在風速5 m·s-1、溫度37 ℃、濕度90%的人工氣候造模箱中,每次2 h,每天2次,連續干預28 d后,GE-M、GE-H、MTX組大鼠分別用GE(60、120 mg·kg-1·d-1)、MTX(0.5 mg·kg-1·3d-1)灌胃兩周。

1.4 關節炎大鼠模型評價指標通過關節炎指數、足爪腫脹容積(mL)、關節腫脹數來評估關節炎嚴重程度,評估方法與我們之前的研究相同[9]。

1.5 關節表面溫度、彩色多普勒超聲和血液流變學指標大鼠造模成功后,使用紅外熱成像儀檢測大鼠足、踝關節局部的表面溫度及熱成像圖譜,用于反映關節的發熱程度;大鼠適量吸入異氟烷麻醉,使用剃毛器對繼發側關節脫毛處理,在膝關節處涂抹偶合劑,選用Color Doppler-mode,將超聲探頭對準膝關節處,檢測大鼠膝關節的血流信號;給藥最后一天,大鼠麻醉處理,使用含有肝素的一次性負壓采血管腹主動脈取血,置于冰上,上下顛倒以確保不發生凝血,送至安徽中醫藥大學第一附屬醫院進行血流變指標的檢測,其中包括全血黏度、血漿黏度和紅細胞壓積。

1.6 HE染色及免疫組化取大鼠滑膜組織4%多聚甲醛進行固定,乙醇脫水,二甲苯處理,石蠟包埋切片,蘇木精-伊紅(HE)染色切片,顯微鏡明場對關節滑膜組織進行病理觀察,收集照片并進行分析和處理。滑膜組織石蠟切片脫蠟至水分,抗原修復3% H2O2后浸泡6 min以消除內源性過氧化物酶的干擾,PBS清洗5 min × 2次。滴加CD31、HSP70和VEGF的一抗溶液,在4 ℃下放置一夜。用辣根過氧化物酶標記的IgG抗體37 ℃孵育20 min。用DAB顯色液染色3 min,蘇木精重染,浸泡置二甲苯中,進行透明處理,再封片置光學顯微鏡觀察。

1.7 Western blot樣本加入適量RIPA裂解液、PMSF、蛋白酶和磷酸酶抑制劑,冰上裂解30 min,使用超聲破碎儀對其破碎處理,使其裂解更加充分,離心機4 ℃,12 000g,5 min,小心吸取上清,留取10 μL用于蛋白定量,加入適量的上樣緩沖液,金屬浴煮沸8 min,-40 ℃保存備用。采用濕轉法將蛋白轉印到NC膜上,5%的脫脂牛奶封閉2 h,一抗孵育4 ℃過夜,TBST搖洗3次,二抗室溫孵育1.5 h,TBST搖洗3次,最后使用ECL發光檢測試劑,在顯影儀中曝光成像,保存并使用ImageJ分析處理。

1.8 ELISA法用ELISA試劑盒檢測大鼠血清和細胞上清液中HSP70的水平,全程按照試劑盒說明書操作。

1.9 細胞HSP70釋放模型的建立取生長狀態良好的HUVECs,選用熱休克溫度(41～45)℃設立3個梯度并分組,刺激1 h后培養箱穩定30 min后,Western blot檢測胞內HSP70表達量,ELISA檢測胞外釋放量。取細胞上清液,根據說明書,通過酶標儀檢測450 nm處每個樣品的A值并計算LDH相對含量。LDH含量 =(測量A值 - 空白A值)/(標準A值 - 空白A值)× 100%。選擇細胞毒性低且HSP70顯著升高的溫度(41 ℃)作為建立細胞模型的條件。

1.10 條件培養基(HUVECs-CM)的制備與質控用不同濃度的GE(25、50和100 μmol·L-1)預處理細胞24 h,細胞換液處理,接下來使用上一步篩選出的溫度41 ℃水浴加熱細胞1 h,收集細胞上清液ELISA檢測胞外HSP70含量,收集細胞Western blot檢測HSP70表達情況。選擇最有效的GE濃度(100 μmol·L-1)用于接下來的條件培養基誘導模型的構建。

1.11 HUVECs-CM誘導模型的建立用不同體積分數的HUVECs-CM(0%、25%、50%、75%、100%)刺激細胞24 h,CCK-8法檢測細胞活力。以最佳濃度(100%)的HUVECs-CM刺激細胞,檢測細胞增殖、水平遷移、垂直遷移和成管能力。

1.12 CCK-8實驗取生長狀態良好的HUVECs,96孔板每孔加入100 μL含7×103個HUVECs的細胞懸液。細胞貼壁后,使用不同體積分數的條件培養基處理24 h。培養結束后,吸除舊培養基,每孔加入100 μL含10% CCK-8的培養基,培養2 h,于酶標儀450 nm處測吸光度值,計算細胞活力。

1.13 EdU染色取生長狀態良好的HUVECs,24孔板提前加入細胞爬片,每孔加入1 mL含1×105個HUVECs的細胞懸液,待細胞融合至70%～80%后,分別用完全培養基、41 ℃-CM、41 ℃+GE-CM培養HUVECs 24 h后,吸棄舊培養基,使用含有EdU的培養基200 μL孵育2 h。4%多聚甲醛固定15 min,PBS搖洗3次,0.5% Triton X-100通透,每孔加入200 μL Click-iT反應混合物,避光孵育30 min。接著,使用Hoechst 33342溶液對細胞進行DNA復染。預先在載玻片上滴加適量抗熒光淬滅劑,取出爬片,細胞面緊貼載玻片,指甲油滴于四周封片,通風櫥避光晾干,使用熒光倒置顯微鏡拍照觀察。

1.14 細胞劃痕實驗取生長狀態良好的HUVECs,6孔板每孔加入1 mL含1×105個HUVECs的細胞懸液,待細胞貼壁后,使用已經滅菌的200 μL槍頭抵住直尺垂直于孔板底部用力均勻劃線,吸取PBS沿孔壁緩慢加入,洗去細胞碎片,此時在顯微鏡下攝取劃痕照片,記為0 h。分組給藥處理細胞24 h后,在顯微鏡下觀察并拍照,記為24 h。根據公式:劃痕愈合率=(劃痕面積0 h - 劃痕面積24 h)/ 劃痕面積0 h × 100%,計算細胞劃痕愈合率。

1.15 Transwell小室遷移實驗取生長狀態良好的HUVECs,Transwell小室上室加入200 μL含1×104個HUVECs的細胞懸液,在下室加入15%胎牛血清的完全培養基600 μL,細胞貼壁后,吸棄上室舊培養基,分組給藥處理24 h。使用棉簽輕輕擦去上室未透膜細胞,4%多聚甲醛固定20 min,結晶紫染色20 min,晾干。在倒置顯微鏡下觀察細胞垂直遷移情況并拍照,ImageJ分析穿膜細胞數量。

1.16 成管實驗取第7代生長狀態良好的HUVECs,取50 μL Matrigel基質膠加入96孔板中,待膠凝固后,分組每孔加入100 μL不同的含藥細胞懸液,密度為每100 μL含7×103個HUVECs,置于細胞培養箱孵育4 h后,在倒置顯微鏡下觀察細胞成管情況并采集圖像。使用ImageJ軟件計算成管的數量和長度。

2 結果

2.1 GE緩解CIA-S大鼠炎癥建立了模擬RA活動期特征為紅、腫、熱、痛的CIA-S模型以及CIA模型,給予不同劑量的GE和陽性藥MTX。在初次免疫后,每7天進行一次大鼠模型評價,數據顯示,CIA-S大鼠相較于CIA大鼠,癥狀出現時間早,高峰期高,持續時間長,體質量漲幅也不同(Fig 1B)。d 28給藥后,GE和MTX明顯改善CIA-S大鼠癥狀(P<0.05,P<0.01),包括關節腫脹嚴重度(Fig 1A)、足腫脹數量(Fig 1C)、AI指數(Fig 1D)、足腫脹容積(Fig 1E)。GE(120 mg·kg-1)組與MTX(0.5 mg·kg-1)組治療效果相似,GE(60 mg·kg-1)組治療效果較高劑量組差,說明GE治療風濕熱痹證大鼠關節炎有效且呈劑量依賴性。

2.2 GE逆轉CIA-S大鼠熱屬性指標風濕熱痹證CIA大鼠踝、趾關節紅、腫、熱,給藥后癥狀緩解(Fig 2A)。CIA-S大鼠關節表面溫度(35.39 ± 0.20)℃較正常組(27.37 ± 0.37)℃和CIA組(32.76 ± 0.23)℃明顯升高(P<0.01),給藥后向正常組恢復(P<0.01)(Fig 2B)。低切率下全血黏度越高,紅細胞聚集性越強,血液流變學結果顯示,與正常組相比,CIA組與CIA-S組血漿黏度升高,但兩組間無明顯差異;CIA組與CIA-S組紅細胞壓積均高于正常組且CIA組較CIA-S組更高。這反映CIA模型在風濕熱的條件刺激下,表現為遇熱血流快,血液黏度降低(Fig 2C,D)。

2.3 GE改善CIA-S大鼠滑膜病理形態HE結果顯示(Fig 3),與正常相比,CIA組與CIA-S組大鼠滑膜組織中可見異常增殖且排列紊亂的滑膜細胞,大量浸潤的炎性細胞以及微血管形成,且CIA-S更嚴重。GE和MTX給藥可有效改善這種異常病理形態。

2.4 GE抑制CIA-S大鼠滑膜血管新生應用彩色多普勒超聲觀察大鼠膝關節滑膜血流信號顯示(Fig 4A),正常組無明顯血流信號,而CIA與CIA-S組有點狀和短線狀血流信號,且CIA-S組較CIA組更為明顯,這表明兩種大鼠模型膝關節滑膜組織中均有新生血管形成并且CIA-S組血管新生更強烈。GE和MTX組較CIA-S組觀察到的血流信號減少。此外,采用免疫組化和Western blot檢測大鼠滑膜組織中血管內皮細胞標志物CD31和促血管生成因子VEGF表達水平(Fig 4B-G),與正常組比,CIA和CIA-S組CD31和VEGF表達明顯增加(P<0.01)。與CIA-S組相比,CIA組兩者表達量稍少,GE和MTX干預后,CIA-S大鼠滑膜CD31和VEGF水平降低。表明CIA-S大鼠滑膜血管新生明顯,GE具有抑制血管新生的作用。

Fig 1 GE alleviated inflammation in CIA-S rats n=8)

Fig 2 GE reversed CIA-S rat thermal properties indicator n=8)

Fig 3 GE improved synovial pathology in CIA-S rats (×100) n=8)

2.5 GE減少HSP70在CIA-S大鼠滑膜組織與血清中的含量免疫組化結果(Fig 5A, B)和滑膜組織Western blot結果(Fig 5C, D)顯示,CIA-S大鼠滑膜組織中HSP70表達較正常組大鼠明顯升高(P<0.01)。GE和MTX給藥抑制CIA-S大鼠滑膜HSP70表達(P<0.01)。ELISA結果顯示(Fig 5E),CIA-S大鼠血清中HSP70較正常組大鼠明顯升高(P<0.01)。GE和MTX給藥會減少CIA-S大鼠血清中HSP70的表達(P<0.01)。

2.6 GE抑制熱誘導的HSP70表達和釋放首先建立熱誘導表達釋放HSP70的細胞模型,選用熱休克溫度(41～45)℃設立梯度并分組,刺激1 h后培養箱穩定30 min后Western blot檢測胞內HSP70表達量,ELISA檢測胞外釋放量,結果發現41℃刺激明顯升高HSP70釋放量和表達量(Fig 6A-C)(P<0.01),并且41 ℃條件下細胞毒性較43 ℃與45 ℃低(P<0.05),因此我們選用41 ℃刺激1 h作為誘導HSP70表達和釋放升高模型的刺激劑。在細胞熱刺激造模前1天分別GE(25、50、100 μmol·L-1)處理給藥,結果表示HSP70胞內含量降低,與模型組相比差異有統計學意義(P<0.05,P<0.01)(Fig 6E,F),HSP70胞外釋放量經給藥處理后明顯降低(P<0.05,P<0.01)(Fig 6G),因此,GE能有效降低熱刺激導致的HSP70表達和釋放的升高,且在25～100 μmol·L-1范圍內呈劑量性依賴,因此條件培養基的制備選用GE 100 μmol·L-1。CCK-8結果顯示(Fig 6H),在不同體積分數的條件培養基刺激下HUVECs增殖能力增強,體積分數為0.75和1時差異有統計學意義,且體積分數為1時增殖活性最強,因此選擇體積分數為1的條件培養基用于接下來的實驗(P<0.01)。

Fig 4 GE inhibited synovial angiogenesis in CIA-S rats n=8)

2.7 GE抑制HSP70釋放進而改善HUVECs生物學功能使用條件培養基(HUVECs-CM)處理HUVECs,分別為41 ℃加熱1 h,GE(100 μmol·L-1)處理24 h后41 ℃加熱1 h的細胞上清液刺激細胞,并以單獨刺激65 μg·L-1的HSP70作為對照(與條件培養基中HSP70含量相似)。具體分組為:Control組,41 ℃-CM組,GE+41 ℃-CM組,HSP70組。EdU染色實驗檢測HUVECs DNA復制能力,評價HUVECs增殖能力。EdU結果顯示(Fig 7A),與Control組相比,41 ℃-CM組和HSP70組增殖能力增強,GE+41 ℃-CM組增殖能力較41 ℃-CM組減弱。采用細胞劃痕實驗和Transwell小室實驗分別檢測HUVECs水平遷移和豎直遷移能力(Fig 7B-E)。41 ℃-CM組和HSP70組的水平和豎直遷移能力均明顯高于對照組(P<0.01),GE+41 ℃-CM組遷移能力較41 ℃-CM組明顯減弱(P<0.05)。采用Matrigel基質膠成管實驗檢測HUVECs細胞管腔形成能力。如Fig 7 F-H所示,與Control組相比,41 ℃-CM組和HSP70組HUVECs形成連續、密集的網狀結構,管腔數目和長度明顯增加(P<0.01)。GE+41 ℃-CM組成管能力較41 ℃-CM組明顯減弱(P<0.05)。

Fig 5 GE reduced HSP70 in synovial tissue and serum of CIA-S rats n=8)

Fig 6 GE reduced heat-induced HSP70 expression and release n=3)

Fig 7 GE inhibited HSP70 release and thereby improved biological function of HUVECs n=3)

3 討論

新生微血管、異常增殖的滑膜細胞與炎性細胞構成血管翳,侵蝕軟骨進而造成關節不可逆損傷。血管新生是形成和維持RA血管翳的重要因素。在RA病理狀態下,促/抑血管生成因子平衡打破,促血管生成因子占主導作用,促進血管新生。抑制內源性促血管生成因子產生的藥物已在臨床上被證明有效[10]。因此,闡明一種新的血管生成因子的功能對理解血管新生的復雜機制有重要意義。已有研究表明,應激誘導蛋白HSP70發揮出不同于熟知的分子伴侶功能,作為新型促血管生成因子發揮作用[6],但其在RA滑膜血管新生中的作用還尚不清楚。

研究表明,風濕熱痹證患者血清、滑膜液中HSP70含量異常升高。合適的動物模型是實驗研究的基礎。CIA是一種內源性自身抗原介導自身免疫性疾病的模型,在臨床表現、病理及免疫學變化等方面與RA有許多相似之處,是研究RA病理機制和評價RA藥物療效的理想的動物模型[11]。CIA大鼠的基礎屬性偏向熱,病理實質為炎癥細胞浸潤,經風濕熱刺激后,血管翳形成及骨質破壞更為明顯。本研究在CIA模型的基礎上,使用人工氣候造模箱,控制溫度、濕度和風速,建立病證結合的風濕熱痹證CIA大鼠模型。以治療RA的金標準藥物MTX為陽性對照,探究GE(60、120 mg·kg-1)對CIA-S大鼠的治療作用。結果顯示,CIA-S較CIA關節炎峰值提前、持續時間延長,消退緩慢,血管新生與HSP70表達更為強烈。這與之前的研究相同[4],可能表明HSP70是區別于風濕熱痹證與其他證型的差異物,HSP70含量多少同血管新生嚴重程度趨勢相同。熱屬性是評價CIA-S模型的特殊指標,其中CIA-S關節表面溫度平均值達到35.39 ℃,器官的變化及血流受阻都會引起血流和熱量從深層組織傳導至局部皮膚,導致溫度升高[12]。CIA-S血液黏度及血流速度在風濕熱條件刺激下分別表現為降低、加快,符合現代醫學認為RA存在血液黏度增高的狀態[13]。GE干預明顯抑制CIA-S大鼠關節炎癥,改善滑膜病理,減少膝關節滑膜血流信號以及抑制CD31和VEGF的表達,提示GE對CIA-S大鼠治療作用明顯著,可以抑制CIA-S大鼠滑膜血管新生。我們檢測了各組別滑膜和血清中HSP70的含量,進一步探究GE體內改善滑膜血管新生是否與HSP70表達釋放相關。結果發現,與空白對照組相比,GE干預后明顯減少HSP70在CIA-S大鼠滑膜組織表達與血清含量,這提示GE改善RA滑膜血管新生可能與HSP70有關。

如前所示,我們繼續進行體外實驗探究HSP70對HUVECs生物學功能的影響以及GE的干預作用。熱應激41～45 ℃是誘導HSP70表達和釋放最直接最有效的因素之一。本研究在選擇41 ℃水浴加熱1 h建立HSP70胞外釋放模型,結果發現GE能夠降低熱應激后HUVECs HSP70的蛋白含量。胞外HSP70刺激HUVECs增殖、遷移和形成管狀結構,進一步支持HSP70在RA血管新生中的作用。熱應激的條件培養基同時也發揮相同作用,GE預處理后明顯逆轉,這可能與GE抑制熱應激誘導的HSP70釋放有關。體外實驗進一步證實了GE抑制HSP70釋放改善RA滑膜血管新生。

此研究當前還存在局限性,HSP70作為細胞因子發揮作用的前提是釋放至胞外,然而HSP70的胞外釋放機制仍不明確。它區別于普通分泌型蛋白,通過非經典的、獨立于內質網-高爾基體的途徑被運輸到質膜,主動釋放可能與脂筏相關,通過與細胞內葉磷脂酰絲氨酸結合外翻至胞外空間[14-15]。有研究表明,非應激細胞的脂筏中含有穩定的HSP70,細胞受到刺激時,細胞內HSP70選擇性在脂筏中聚集增加,同時HSP70的釋放也增加,用甲基環糊精破壞脂筏的結構后,HSP70釋放明顯降低[16]。同時,課題組前期也發現GE靶向作用于SphK1,抑制SphK1過度轉位至胞膜。有研究發現質膜中的脂筏微域很有可能是SphK1再定位的目標[17]。GE減少胞外的HSP70分泌是否與抑制SphK1再定位有關仍待探究。

綜上所述,在RA血管新生過程中,過度分泌的HSP70作用于HUVECs,促進病理性血管新生;GE體內、外有效的減少HSP70釋放改善RA滑膜血管新生。在之后的研究中,我們將更深入的闡明GE抑制HSP70釋放的機制,為中藥治療RA血管新生的研究與應用提供新的實驗依據。