黃連素通過誘導線粒體自噬干預呼吸道合胞病毒感染HEp-2細胞的作用機制

崔玉娟,趙 輝,蘇東霞,胡丹東

(1. 西北師范大學生命科學學院,甘肅 蘭州 730070;2. 北京市延慶區(qū)疾病預防控制中心,北京 102100;3. 北京市延慶區(qū)市場監(jiān)管檢驗檢測監(jiān)控中心,北京 102100)

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)屬于副黏病毒科、肺病毒屬,是一種含有包膜的反義單鏈RNA病毒,直接或間接與患者的分泌物、飛沫接觸均可感染,具有高度傳染性。RSV是引起兒童下呼吸道感染的主要病原,感染初期與一般感冒無異,隨著感染加劇可引起不同的組織病變,特別是引發(fā)肺炎等嚴重的呼吸系統(tǒng)疾病[1]。免疫功能較差的老年感染者,還可能影響心肺功能,引起心肌梗死或呼吸衰竭。RSV感染每年在全球造成約16萬人死亡,至今缺乏有效的抗病毒藥物[2]。因此,發(fā)現(xiàn)新的候選藥物治療RSV感染,并研究其潛在的機制是當務之急。

黃連素(berberine,BE)是一種從黃連等小檗屬植物中分離得到的異喹啉類生物堿,具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗衰老等多種藥理作用,近年來的研究表明BE還具有抗病毒功能,可適用于治療多種病毒感染性疾病。研究發(fā)現(xiàn),BE對登革熱病毒和人乳頭瘤病毒具有直接的抗病毒活性[3]。BE能通過作用于TNF-α、STAT3、IL-6、CCL2等靶點,抑制炎癥和纖維細胞活化,達到治療新型冠狀病毒感染所致肺纖維化的目的[4]。BE可抑制單純皰疹病毒在細胞中的復制并抑制其感染誘導的炎癥反應[5]。

病毒感染致組織損傷的一個重要原因與線粒體損傷有關。損傷的線粒體會釋放大量活性氧(ROS),導致NLRP3炎性小體過度活化,激活炎癥反應,進而導致細胞功能喪失,并誘導組織損傷。因此,細胞采用了線粒體自噬的策略來清除受損的線粒體。通過與溶酶體融合,受損的線粒體由各種水解酶完成降解,該過程在調(diào)節(jié)線粒體數(shù)量、維持線粒體功能以及維持細胞穩(wěn)態(tài)和生存方面起著至關重要的作用[6]。本研究旨在探究BE對RSV感染HEp-2細胞的影響,通過分析線粒體功能和線粒體自噬標志蛋白的檢測結果,討論線粒體自噬在其中的作用機制,為RSV感染性疾病的藥物開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器人喉表皮樣癌細胞(HEp-2)、RSV病毒株購自美國ATCC公司。BE購自北京索萊寶科技有限公司(CAS號:2086-83-1,分子量:336.36,純度:≥98%)。環(huán)孢素A(59865-13-3)、RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、二甲基亞砜(DMSO)(200-664-3)、MitoSOX工作液(1821370-28-8),購買自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司;CCK-8試劑(HY-K0301)購自德國默克公司;一抗抗體NLRP3、ASC、caspase-1、PINK1、Parkin、P62、Beclin1、LC3 Ⅰ、LC3 Ⅱ、BNIP3購自美國Cell Signaling Technology公司;IL-1β ELISA檢測試劑盒(1025K7110)購自北京索萊寶科技有限公司;PBA緩沖液、JC-1試劑盒(C2005)、ATP試劑盒(S0026)、DAPI工作液(C1006)、MitoTracker Red工作液(C1049B)購自上海碧云天生物技術有限公司。流式細胞分析儀(型號CytoFLEX)購自美國美國貝克曼庫爾特公司;酶標儀購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司;全自動蛋白印跡系統(tǒng)(型號Qblot)購自上海曼博生物醫(yī)藥科技有限公司;激光共聚焦顯微鏡(型號OLS5100)購自日本奧林巴斯公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng)、分組及處理 HEp-2細胞用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),取對數(shù)生長期HEp-2細胞按照1×105/孔接種于6孔板中,細胞生長度達80%～90%時備用。取適量BE在DMSO溶液中充分溶解,配置濃度分別為5、10、15 μmol·L-1的BE溶液。將HEp-2細胞隨機分為:Control組(不用RSV和BE處理)、RSV組(用200 pfu/孔的RSV處理)、RSV+5 μmol·L-1-BE組(用200 pfu/孔的RSV和5 μmol·L-1的BE處理)、RSV+10 μmol·L-1-BE組(用200 pfu/孔的RSV和10 μmol·L-1的BE處理)、RSV+15 μmol·L-1-BE組(用200 pfu/孔的RSV和15 μmol·L-1的BE處理),對照組和感染組則加入DMSO 20 μL,BE處理組加入相應濃度的BE溶液20 μL。各組細胞在37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,收集細胞檢測相應指標。環(huán)孢素A抑制線粒體驗證實驗中,隨機分為:RSV組、RSV+環(huán)孢素A組。

1.2.2CCK-8實驗檢測HEp-2細胞存活率 收集培養(yǎng)24 h后的各組HEp-2細胞,加入100 μL CCK-8試劑,37 ℃孵育1 h,檢測450 nm處的吸光度值,計算細胞存活率。細胞存活率=實驗組吸光度值/對照組吸光度值×100%。

1.2.3Western blot檢測HEp-2細胞相關蛋白表達 收集培養(yǎng)24 h后的各組HEp-2細胞,用RIPA裂解液提取總蛋白,用BCA法測濃度,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),并轉膜,用5%脫脂奶粉封閉,加入相應一抗(1 ∶1 000),4 ℃過夜。加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1 ∶5 000),37 ℃孵育1 h。ECL顯色、暗室曝光。以GAPDH為內(nèi)參,利用Quantity One軟件分析各條帶灰度值。

1.2.4ELISA檢測HEp-2細胞IL-1β分泌水平 收集培養(yǎng)24 h后的各組HEp-2細胞的培養(yǎng)液上清,按照ELISA試劑盒說明書檢測IL-1β水平。

1.2.5檢測HEp-2細胞中ATP水平 收集培養(yǎng)24 h后的各組HEp-2細胞的培養(yǎng)液上清,加入ATP檢測溶液,用多功能酶標儀測量發(fā)光強度。隨后根據(jù)標準曲線計算ATP含量(mmol·g-1Pro)。

1.2.6流式細胞術檢測HEp-2細胞凋亡率和線粒體膜電位 HEp-2細胞培養(yǎng)48 h后,收集細胞,用冰冷的PBS洗滌兩次,并在70%冰冷的乙醇中在4 ℃下固定過夜。在PBS中再水化15 min后,將細胞在黑暗中用PI溶液染色30 min,通過流式細胞術分析細胞凋亡率。HEp-2細胞培養(yǎng)24 h后2 000 r·min-1離心5 min,棄上清,加入500 μL的JC-1工作液,37 ℃下孵育20 min。2 000 r·min-1離心5 min,棄上清,緩沖液洗滌細胞,并重懸,用流式細胞儀分析各組HEp-2細胞線粒體膜電位。線粒體膜電位較高時,JC-1聚集在線粒體基質中,形成聚合物,呈紅色熒光。線粒體膜電位較低時,JC-1為單體,不能聚集在線粒體基質中,呈綠色熒光。線粒體膜電位用紅色熒光細胞的比例表示。

1.2.7MitoSOX染色檢測mtROS水平 HEp-2細胞培養(yǎng)24 h后,加入終濃度5 μmol·L-1的MitoSOX工作液,37 ℃避光孵育20 min,PBS洗滌,加入DAPI工作液,室溫避光孵育15 min,PBS洗滌,激光共聚焦顯微鏡下觀察。紅色為mtROS,藍色為細胞核。

1.2.8免疫熒光染色檢測線粒體-自噬小體共定位 HEp-2細胞培養(yǎng)24 h后,加入MitoTracker Red工作液,在37 ℃避光孵育30 min。PBS洗滌,4%多聚甲醛固定15 min,PBS洗滌,0.3% Triton X-100室溫滲透10 min,PBS洗滌。加入山羊血清封閉液,室溫孵育1 h。加入LC3一抗(1 ∶150),4 ℃孵育過夜。PBS洗滌,加入FITC偶聯(lián)的驢抗兔二抗(1 ∶300),室溫孵育1 h。PBS洗滌。加入DAPI工作液,室溫孵育3 min。PBS洗滌,激光共聚焦顯微鏡下觀察。MitoTracker Red標記的線粒體呈紅色,LC3標記的自噬小體呈綠色,DAPI染色的細胞核呈藍色。

2 結果

2.1 BE提高RSV感染HEp-2細胞的活性CCK-8法檢測RSV感染HEp-2細胞的存活率,流式細胞術檢測RSV感染HEp-2細胞的凋亡率。結果顯示,Control組中HEp-2細胞的活力最高。在RSV感染后,細胞的存活率減半,與Control組比較,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),不同濃度的BE干預后提高了RSV感染的HEp-2細胞的存活率,且呈劑量依賴性(P<0.05),見Fig 1A。而RSV感染提高了HEp-2細胞凋亡率(P<0.05),BE干預降低了RSV感染HEp-2細胞的凋亡率(P<0.05),見Fig 1B、C。

2.2 BE降低RSV感染HEp-2細胞中NLRP3炎性小體活化水平Fig 2結果顯示,與Control組比較,RSV感染后提高了HEp-2細胞NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表達及IL-1β分泌水平(P<0.05),BE干預后降低了RSV感染的HEp-2細胞中NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表達及IL-1β分泌水平,且呈劑量依賴性(P<0.05)。BE有效降低了NLRP3炎性小體活化水平,保護了HEp-2細胞。

2.3 BE升高RSV感染HEp-2細胞線粒體膜電位和ATP水平Fig 3結果顯示,RSV感染后,HEp-2細胞中呈紅色熒光細胞的數(shù)量占比減少至53.1%,降低了線粒體膜電位(P<0.05)。BE干預后,各濃度組中紅色熒光細胞的比例均提升,且呈劑量依耐性(P<0.05),高濃度組中最高線粒體膜電位細胞比例達到84.2%,抑制了線粒體的損傷。隨著線粒體膜電位的升高,細胞中ATP水平與RSV組相比明顯升高(P<0.05)。

Fig 1 BE increased activity of

Fig 2 BE reduced NLRP3 inflammasome activationin RSV infected HEp-2

2.4 BE降低RSV感染HEp-2細胞mtROS水平Fig 4結果顯示,Control組中mtROS水平最低,ROS在正常細胞中保持較低的水平。RSV感染HEp-2細胞后,與Control組相比,感染組中活性線粒體ROS紅色熒光強度最高,細胞中mtROS水平明顯升高(P<0.05),說明線粒體發(fā)生損傷,產(chǎn)生大量的ROS并釋放到細胞質中。BE干預后,mtROS紅色熒光強度逐漸減弱,與RSV組相比熒光強度明顯降低,mtROS水平隨BE濃度的升高而降低,同樣呈濃度依賴性(P<0.05)。

2.5 BE提高RSV感染HEp-2細胞線粒體自噬水平Fig 5結果顯示,與Control相比,在RSV感染后,HEp-2細胞中PINK1、Parkin、Beclin1蛋白的表達水平升高,p62蛋白的表達水平降低,BNIP3蛋白的表達水平降低,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值提升,表明RSV的感染激活了PINK1/Parkin介導線粒體自噬,而線粒體的損傷導致BNIP3表達水平降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。BE干預后,與RSV組相比,PINK1、Parkin、Beclin1蛋白的表達水平升高,p62蛋白的表達水平降低,BNIP3蛋白的表達水平升高,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值提升,并隨著BE濃度的增加,線粒體自噬標志蛋白表達水平越高(P<0.05)。免疫熒光結果顯示,Control組HEp-2細胞線粒體(紅色熒光)含量較高,自噬小體(綠色熒光)含量較低,沒有觀察到線粒體-自噬小體共定位。在RSV感染的HEp-2細胞中,線粒體含量降低,自噬小體含量提高,同樣沒有綠色熒光標記,未發(fā)現(xiàn)明顯的線粒體-自噬小體共定位,共定位率與對照組相比無差異(P>0.05)。BE干預后自噬小體數(shù)量升高,線粒體數(shù)量同樣升高,且能觀察到明顯的線粒體-自噬小體共定位,共定位率明顯升高(P<0.05)。

2.6 抑制線粒體功能加重RSV感染Fig 6結果顯示,在RSV感染HEp-2細胞中,環(huán)孢素A加入后細胞活性明顯下降(P<0.05),炎性小體相關蛋白NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表達水平明顯升高(P<0.05),炎性因子IL-1β分泌水平升高(P<0.05),表明環(huán)孢素A的加入加重了細胞的炎癥反應。進一步檢測線粒體功能發(fā)現(xiàn),線粒體膜電位與RSV組相比明顯降低(P<0.05),細胞中ATP的水平也明顯降低(P<0.05),提示線粒體的功能被進一步抑制。

3 討論

RSV病毒感染在世界范圍內(nèi)普遍存在,嚴重威脅人類健康,BE作為一種傳統(tǒng)的中藥提取物,具有抗炎、抗菌和抗病毒活性等功效,是近期抗病毒研究中的熱點之一,由于其效果穩(wěn)定、安全性高,具有極大的臨床應用前景。既往研究可知,BE通過LncRNA NRAV、RAB5C靶向競爭結合miR-299-3p,抑制JNK/p38 MAPK信號通路和PI3K/AKT信號通路提高了HSV-1感染HEp-2細胞的存活率,并降低凋亡率[7]。基于上述結果,本研究探究了BE對RSV感染HEp-2細胞活性的影響,RSV感染HEp-2細胞后,細胞存活率明顯降低、凋亡率升高,BE干預則可顯著提高感染細胞的活性,細胞凋亡率顯著降低,表明BE減輕了RSV感染所致HEp-2細胞的損傷。

Fig 3 BE increased mitochondrial membrane potential and ATP levels in RSV infected HEp-2

Fig 4 BE reduced mtROS levels in RSV infected HEp-2

Fig 5 BE increased mitochondrial autophagy levels in RSV infected HEp-2

NLRP3炎性小體能被多種類型的病原體或危險信號激活,在機體免疫反應和疾病發(fā)生過程中具有重要作用,是機體介導免疫炎癥的關鍵調(diào)控因子,主要由 NLRP3、ASC及caspase-1組成。NLRP3炎癥小體在抵抗病毒感染中起重要作用[8]。病毒感染后,NLRP3識別入侵的病毒改變蛋白構象準備組裝炎性小體,與ASC結合后,ASC構象變化與caspase-l結合,促進IL-1β等炎癥因子成熟釋放,誘導細胞高炎癥狀態(tài),導致細胞損傷,進而發(fā)生細胞凋亡。大量的研究證明NLRP3炎性小體的過度活化是病毒感染導致細胞損傷的重要原因之一[9]。因此,作為炎癥反應的核心,NLRP3炎癥小體可能為各種病原體感染和炎癥性疾病的治療提供新的靶點。研究顯示,RSV感染可提高HEp-2細胞內(nèi) NLRP3、ASC、caspase-l蛋白表達及IL-1β分泌水平,導致 NLRP3 炎性小體過度活化,使感染細胞的存活率降低,這與既往病毒感染的結果相似[10]。BE干預可降低RSV感染HEp-2細胞內(nèi)NLRP3、ASC、caspase-l蛋白表達及IL-1β分泌水平,抑制NLRP3 炎性小體活化。結果提示BE對RSV感染HEp-2細胞的保護作用可能與BE抑制NLRP3 炎性小體活化有關。

線粒體很容易受損,在病毒感染后,細胞先天免疫反應或其他細胞應激產(chǎn)物會影響線粒體功能,一旦受損則會對細胞功能造成更加嚴重后果[11]。線粒體膜電位的異常會影響氧化磷酸化和線粒體ATP合成,進一步導致細胞受損[12],因此,評估磷酸化能力和電子傳遞能力、線粒體膜電位等,是研究病毒對線粒體功能的影響以及了解病毒性疾病發(fā)病機理的重要工具。在研究中,檢測到RSV感染后細胞中表示線粒體高膜電位的紅色熒光細胞比例由有96.5%下降至45.7%,ATP水平與未感染細胞相比降低60%,病毒感染使線粒體膜電位顯著降低,并導致細胞質內(nèi)的H+轉運受阻,ATP合成大量減少。說明RSV感染使線粒體嚴重受損,線粒體膜電位去極化,提供細胞活動的ATP合成不足,導致細胞活性降低。BE干預后,線粒體膜電位逐漸升高,ATP合成增加,BE改善了線粒體功能,維持了細胞的穩(wěn)定。線粒體膜電位的微量變化都會極大地影響線粒體的功能,并影響細胞的穩(wěn)定,引發(fā)機體的各種疾病,BE的改善結果展示了對線粒體的保護作用,對病毒感染引起的線粒體功能障礙的治療將具有重要意義。

Fig 6 Inhibiting mitochondrial function aggravated RSV

NLRP3炎性小體的活化主要受mtROS調(diào)控,而ROS主要來自損傷的線粒體。ROS水平是細胞正常生理功能和環(huán)境因素導致細胞氧化損傷的重要標志,病毒感染使線粒體受損,導致線粒體釋放ROS,并大量積累[13]。本研究發(fā)現(xiàn),RSV感染可顯著提高HEp-2細胞內(nèi)mtROS水平,與既往研究腺病毒、流感病毒的結果相似[14-15],細胞受到病毒入侵后發(fā)生了嚴重的氧化應激反應,線粒體內(nèi)膜在ROS高水平的環(huán)境中被破壞,同時NLRP3炎性小體和IL-1β炎性因子通過增加鈣依耐性線粒體ROS和誘導ROS生成的基因來增加線粒體氧化,進一步加劇線粒體功能障礙,這也是導致細胞活性降低的主要原因之一。BE具有抗氧化的性質,干預后可顯著降低RSV感染細胞內(nèi)mtROS的水平。同時結合上文中得到BE能夠提高線粒體膜電位并提高ATP水平的結果,對線粒體功能檢測表明,RSV感染使細胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)與氧自由基的平衡被打破,細胞內(nèi)ROS水平過多,破壞線粒體的酶類、脂類和核酸,使機體出現(xiàn)氧化應激,同時ROS可攻擊線粒體DNA產(chǎn)生氧化損傷,導致線粒體ATP合成減少、線粒體膜電位破壞等結構和功能變化。BE干預可減輕RSV病毒感染導致的線粒體損傷、抑制mtROS生成。

線粒體自噬是一種專一降解損傷或老化線粒體的選擇性自噬,其對維持線粒體數(shù)量及正常功能、保持mtROS平衡非常重要[16]。線粒體自噬標志物根據(jù)自噬途徑的不同,主要分為泛素依賴性和非泛素依賴性兩種,目前研究最廣泛的是PINK1/Parkin通路和BNIP3通路。線粒體受損后膜電位降低或消失,PINK1無法進入線粒體內(nèi)膜并在線粒體外膜積累,這會募集激活Parkin,并泛素化自噬受體蛋白(p62、OPTN、NDP52)在線粒體外膜積累,導致泛素化產(chǎn)物通過與LC3結合被招募到自噬體中,成熟的自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體,包含的線粒體隨后被降解。非泛素依賴性線粒體自噬途徑需要借助線粒體外膜上的BNIP3、NIX、FUNDC1等受體,通過與細胞自噬標志物蛋白LC3的相互作用,介導自噬體特異性識別受損的線粒體,進而誘導完成線粒體自噬[17]。本研究中,RSV感染提高HEp-2細胞內(nèi)LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值,降低BNIP3、p62表達,升高PINK1、Parkin、Beclin1表達。免疫熒光實驗顯示,RSV感染可增強綠色熒光(LC3,標記自噬小體),降低紅色熒光(標記線粒體),未觀察到明顯的線粒體-自噬小體共定位,表明病毒感染可增加細胞整體的自噬水平,但對線粒體自噬水平無顯著影響。病毒感染破壞線粒體功能使線粒體膜電位降低導致PINK1在線粒體外膜積累,進一步招募Parkin并激活,PINK1/Parkin介導的線粒體自噬被激活。病毒感染所致BNIP3水平降低,這可能是由于病毒感染致線粒體損傷,線粒體含量降低,定位于線粒體的BNIP3隨之降低。BE干預可顯著提高RSV感染HEp-2細胞內(nèi)LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值,表明自噬小體的自噬活性升高,PINK1/Parkin通路和BNIP3通路均被激活。BE的干預可增強RSV感染的HEp-2細胞中線粒體-自噬小體共定位水平,表明BE可誘導線粒體自噬,減輕RSV病毒誘導的線粒體損傷。有研究表明,BE可通過誘導線粒體自噬,降低線粒體ROS的產(chǎn)生,進而抑制流感病毒引發(fā)的巨噬細胞NLRP3炎性小體活化,減輕細胞炎癥反應[18]。本研究結果與上述文獻一致,提示BE可能通過調(diào)控線粒體自噬/ROS/NLRP3炎性小體通路,減輕RSV感染的HEp-2細胞損傷。為了驗證改善線粒體功能對線粒體自噬的干預作用,用線粒體抑制劑環(huán)孢素A對RSV感染HEp-2細胞中的線粒體進行抑制,線粒體功能發(fā)生了更加嚴重的障礙,線粒體膜電位和ATP水平降低、NLRP3炎性小體活化程度提高、細胞的存活率比RSV感染后更低。環(huán)孢素A的使用抑制了線粒體的自噬水平,加重了RSV感染。

綜上所述,BE對RSV感染的HEp-2細胞損傷具有保護作用,其機制可能與BE通過誘導PINK1/Parkin與BNIP3共同介導線粒體自噬,提高線粒體膜電位與ATP水平,抑制mtROS生成并抑制NLRP3炎性小體活化有關。然而,線粒體自噬是一個復雜的過程,我們后續(xù)實驗將進一步探索是否存在其它分子機制在BE誘導線粒體自噬中發(fā)揮作用。