雷公藤紅素通過調控ATF4/caspase-3/GSDME信號通路促進肝癌細胞焦亡

李 端,王永輝,周 靜,張 樂,孔永紅

(1.黃淮學院直屬附屬駐馬店市中心醫院藥學部,河南 駐馬店 463000;2.蘇州大學藥學院藥理學系,江蘇 蘇州 215123;3.黃淮學院化學與制藥工程學院,河南 駐馬店 463003)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是全球最常見的人類致命惡性腫瘤之一,其中以原發性肝癌占比最高,約占85%。據統計,HCC每年約有 840 000新發病例和 780 000例死亡病例[1]。大多數肝癌患者早期無癥狀確診時已發展到晚期,往往失去了手術治療的最佳時機。靶向治療是這些HCC患者的重要選擇,大量研究證實,靶向治療可以在一定程度上改善晚期 HCC患者的生存率[2]。但靶向藥物發展緩慢,臨床可用于HCC治療的靶向藥物極為有限且易產生耐藥。因此,有迫切需要開發新的和更具體的治療HCC的方法。近年來,中藥因其作用廣、副作用小、協同治療效果好等多方面優點成為抗腫瘤治療的“熱點”。雷公藤紅素(tripterine, TRI)是一種天然的化合物,主要來源于雷公藤。TRI已被證明具有抗炎、抗氧化、抗癌和抗纖維化的作用。在臨床上,TRI已被用于治療類風濕性關節炎、麻風反應和其他自身免疫性[3-6]。TRI能有效通過誘導線粒體損傷來對抗結腸癌細胞和細胞內鈣的積累。TRI還能通過促進線粒體活性氧(reactive oxygen species, ROS)產生,誘發細胞線粒體膜電位 (mitochondrial membrane potential, MMP) 和DNA損傷,從而改善急性淋巴細胞白血病[7]。也有研究報道,TRI能抑制 HCC 細胞的生長和誘導 HepG2 細胞凋亡[8]。這些研究表明TRI可能是一種潛在的癌癥治療藥物。然而,TRI抗癌作用的分子機制仍有待闡明。細胞焦亡是一種新的程序性細胞死亡形式,其特征是細胞腫脹并伴質膜表面孔隙。細胞焦亡最初歸因于半胱天冬酶(caspase)對gasdermin D (GSDMD)的蛋白水解片段化。最近的一些研究表明了一種全新的Gasdermin 家族的另一個成員gasdermin E (GSDME), 其可以誘導細胞凋亡向細胞焦亡轉換[9]。與GSDMD 類似,GSDME 包含 N 端和 C 端結構域,N 端單體在等離子體中低聚形成孔膜[10]。活化的 caspase-3酶剪切 GSDME域間鏈接器釋放 N 端域并形成細胞膜孔導致細胞焦亡,最終導致細胞乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)活性升高以及碘化丙啶 (PI) 攝取的增加。本研究探討TRI是否可通過調節ATF4/caspase-3/GSDME信號通路誘導肝癌細胞焦亡。

1 材料和方法

1.1 主要試劑TRI(純度>98%,購自成都普菲德生物技術有限公司,批號20210416)。

1.2 細胞系和細胞培養HepG2 細胞(人 HCC 細胞系)和 Hepa1-6 細胞(小鼠HCC細胞系)購自上海細胞生物研究所(中國上海)。HepG2和Hepa1-6 細胞分別在MEM和 DMEM培養基中培養。所有的培養基都是含10%胎牛血清(FBS;賽默飛世爾Scientific, Waltham, MA, USA)、青霉素 (100 kU·L-1) 和鏈霉素(100 g·L-1;Hyclone, Logan, UT, USA)。細胞在 37 ℃和5% CO2下培養。GSDME質粒由 GenePharma(中國上海)合成。通過蛋白質印跡法驗證構建是否成功。m-GSDME forward, 5′-CTGCGGATGACTGCCTCAATGG-3′,h-GSDME reverse, 5′-ATTGCTTGTGCTGTGCGTTGC-3′; h-GSDME forward, 5′-CCTGTGGCATCCACGAAACT-3′,h-GSDME reverse, 5′-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3′。轉染前,將2 mL含有1.0×106細胞的完全培養基放入6孔板。待細胞匯合度達到70%左右后,每個細胞中的完全培養基用1.8 mL不含FBS的基礎培養基代替。然后2 μg模擬物或質粒分別用 100 μL Opti-MEM (31985070, Gbico) 稀釋。此外,2 μL lipo 3000 (BMB1385, BOMEI BIOTECHNOLOGY,合肥) 也用100 μL Opti-MEM稀釋。然后將稀釋的模擬物或質粒和稀釋的 lipo 3000充分混合。孵育10 min后,最后將混合溶液加入每個孔,進一步培養 48 h用于后續分析。

1.3 細胞活力測定和LDH釋放測定接種指數生長的 HepG2 細胞或 Hepa1-6 細胞在刺激前 24 h放入96孔板(7 000 個細胞/孔)中。將TRI溶解在 DMSO 中并稀釋用不同濃度的培養基 (DMSO終濃度<0.1%)。用TRI孵育指定的時間和濃度。通過CCK-8測定細胞活力(Dojindo 實驗室,日本九州島)。根據Prism 6計算的的細胞活力值計算半數最大抑制濃度(IC50)。對于LDH釋放,細胞培養上清液收集后,使用LDH 檢測試劑盒(Beyotime 生物技術研究所),在黑暗室溫下孵育30 min。在酶標儀(Thermo Scientific Varioskan LUX,Waltham,MA,USA)450 nm 處測定吸光度分光光度。

1.4 免疫熒光用于免疫熒光染色的細胞用4%多聚甲醛固定 20 min,然后使用 0.5% Triton X-100滲透15 min。將細胞在 3% BSA中孵育30 min。之后,細胞孵育一抗并4 ℃過夜。PBS 3 次洗滌后,孵育二抗(Invitrogen,美國)2 h。最后,將印跡用DAPI染色5 min(Beyotime),在熒光顯微鏡下觀察細胞(徠卡,德國)。

1.5 通過流式細胞術評估細胞凋亡收集細胞,根據說明書,用PBS洗滌2次并使用FITC和PI染色(益生,中國)。染色的細胞是用流式細胞儀檢測,并使用FlowJo軟件進行數據處理。

1.6 蛋白質印跡收集細胞總蛋白,并BCA 試劑盒(QPBCA,默克)測定其濃度。然后,使用SDS-PAGE 凝膠對30 μg 總蛋白和4 μL標記物(PR1910,Solarbio,中國)進行電泳,隨后轉移到0.22 μm PVDF膜(W015-2,建城生物,中國)。用5%脫脂牛奶封閉后,膜與下列相關一抗在4 ℃孵育12 h:抗人 GSDMD (1 ∶1 000, Proteintech),抗 GSDME (1 ∶1 000, Abcam),抗兔半胱天冬酶3 (caspase3,1 ∶1 000)、抗兔聚 ADP-核糖聚合酶 (PARP, 1 ∶1 000)、抗鼠 GSDMD(1 ∶1 000,Abcam)和抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH, 1 ∶5 000)均購自Cell Signaling Technology。抗兔P-eIF2α (1 ∶1 000),抗兔eIF2α (1 ∶1 000),抗兔ATF4 (1 ∶1 000) 均購自Abcam。然后,2 h后與兔二抗(1 ∶10 000,Abcam)或鼠二抗孵育抗體(1 ∶10 000,Abcam),進一步用200 μL ECL發光液進行顯影(P0019,Beyotime,上海)。最后,檢測到信號圖像使用IPP6.0軟件進行分析。

1.7 動物研究40只雄性BALB/c裸鼠(6周,體質量18～20 g)獲購自揚州大學比較醫學中心(揚州,中國)并保存在動物實驗中心中國藥科大學。隨機分為4組,陰性對照 (NC)、si-GSDME組、TRI組和TRI+si-GSDME組,NC和TRI組給予未干擾的Hepa1-6細胞3×106被皮下注射到小鼠右上肢腋下;si-GSDME組和TRI+si-GSDME組小鼠接種等數量si-GSDME干擾的Hepa1-6 細胞。每3 d監測一次小鼠腫瘤體積(長×寬×寬×3.14/6)和體質量。在治療結束時,處死小鼠,取出腫瘤,稱質量。動物實驗通過本機構動物倫理委員會批準。

1.8 組織病理學檢查收獲小鼠的腫瘤組織和肝臟,并用4%多聚甲醛固定,脫水,包埋石蠟。

2 結果

2.1 TRI抑制HCC細胞增殖和侵襲TRI在各種癌癥中發揮抗腫瘤作用,但在肝癌中的研究有限[7-8]。因此,我們考察了TRI是否可以抑制HCC細胞增殖。CCK-8結果表明,TRI可呈濃度和時間依賴性抑制肝癌細胞HepG2、Hepa1-6的增殖(Fig 1A和1D)。細胞實驗結果顯示,隨著TRI濃度的增加,肝癌細胞HepG2、Hepa1-6的克隆數均明顯減少(Fig 1B和1E)。同時,細胞Transwell實驗結果表明,隨著TRI濃度的增加,肝癌細胞HepG2、Hepa1-6的侵襲(Fig 1C和1F)能力。

2.2 GSDME對TRI誘導的肝癌細胞焦亡至關重要據報道,TRI可通過誘導腫瘤細胞凋亡抑制腫瘤進展[8]。我們試圖確定是否還可通過其他方式抑制 HCC 進展。有趣的是,在TRI處理后的 HepG2 和Hepa1-6 細胞均出現了焦亡(Fig 2A)。為了證實這一發現,我們評估了焦亡相關蛋白。在gasdermin 蛋白家族成員中, GSDMD 的裂解可以將 GSDMD 的 N 端結構域釋放到膜上。雖然 GSDMD 在 HepG2和 Hepa1-6 細胞中表達,但TRI處理不能誘導GSDMD分裂 (Fig 2B)。此外,在Gsdmd siRNA的Hepa1-6(Fig 2C)不影響TRI誘導的細胞死亡和 LDH 釋放(Fig 2D 和E)。進一步我們檢測了新細胞焦亡效應因子GSDME的表達,結果表明,TRI呈劑量依賴性方式誘導HCC 細胞 caspase 3和PARP裂解(Fig 2F-I)和 N 端 GSDME (N-GSDME)的釋放。

Fig 1 Proliferation and invasion of HCC cells inhibited by TRI

Fig 2 TRI-induced pyroptosis of hepatoma cells

Fig 3 GSDME mediated response of HCC cells to TRI

2.3 GSDME缺失可部分逆轉 TRI 對肝癌細胞抑制作用為了驗證GSDME的作用,我們沉默Hepa1-6 細胞中的 GSDME(Fig 3A-F)。結果顯示,GSDME缺失明顯減少TRI誘導的 LDH 釋放和質膜膨脹,雖然沒有挽救細胞死亡。同時,GSDME缺失后可部分逆轉細胞TRI抑制肝癌細胞菌落形成和遷移的作用(Fig 4A-D)。TRI處理的Hepa1-6細胞迅速進入膜聯蛋白V(annexin V)和PI雙陽性階段,而Gsdme的敲低后隨著annexin V單陽性細胞比例的增加和雙陽性細胞百分比的降低而延遲細胞的凋亡(Fig 4E-F)。這些發現表明TRI發揮其作用部分取決于HCC細胞中的GSDME。

2.4 TRI激活 eIF2α/ATF4軸觸發GSDME介導的細胞焦亡為進一步闡明細胞焦亡的發生機制,我們檢測了eIF2a/ATF4軸,這已被證明是caspase-3的上游調控通路。Western blot結果表明,TRI刺激后HepG2 和 Hepa1-6 細胞中 p-eIF2a、ATF4均顯著升高(Fig 5A-C)。同時,免疫熒光結果也顯示,TRI刺激后HepG2 和 Hepa1-6 細胞中ATF4陽性細胞數明顯增加,并呈劑量依賴性(Fig 5D,E)。

2.5 TRI抑制腫瘤生長部分依賴于GSDME進一步研究 TRI的抗HCC腫瘤作用,我們進行了體內動物研究。結果顯示,TRI治療顯著抑制腫瘤生長、減少腫瘤重量,且TRI+si-GSDME 敲低組腫瘤增長明顯快于TRI+NC組。(Fig 6A-C)。總之,TRI抑制腫瘤生長部分依賴于GSDME。

Fig 4 GSDME mediated response of HCC cells to TRI

Fig 5 TRI activation of eIF2α/ATF4 axis triggered GSDME-mediated pyroptosis

Fig 6 TRI inhibited growth of HCC cells in vivo

3 討論

HCC總體 5年生存率仍然很差低。化療仍然是晚期 HCC的主要治療方法。索拉非尼是晚期 HCC 患者的標準療法,但它只能為患者提供有限的生存益處[11]。所以,迫切需要確定更有前途的高活性且低毒性的HCC治療藥物。細胞活力實驗表明,TRI可以明顯抑制HepG2或 Hepa1-6 細胞生長。此外,體內實驗HCC 模型顯示,TRI治療抑制HCC腫瘤的生長。

細胞凋亡通常被認為是調節腫瘤細胞死亡的主要形式。TRI用于癌癥治療,也歸因于其抑制癌細胞的生長能力并誘導癌細胞凋亡。已有研究發現TRI可誘導HepG2細胞凋亡[12]。在本研究中,我們擴展了傳統觀點,并提出 GSDME 依賴性細胞焦亡參與TRI在 HCC 中的治療,這一觀點得到了以下實驗數據驗證。首先,在TRI處理的 HCC 細胞中觀察到細胞焦亡現象,如細胞膜裂解、氣球樣氣泡、LDH釋放和 PI 陽性染色。但值得注意的是,經歷壞死性凋亡的細胞也表現出質膜透化,細胞腫脹和溶解。在細胞焦亡期間,焦亡發生時形成孔隙,它允許細胞質的內容物,如LDH和炎性細胞因子釋放,熒光標記的膜聯蛋白V (Annexin V)、7-氨基放線菌D (7-AAD)或PI可進入細胞。相比之下,膜不透性染料,如作為7-AAD或 PI,可通過孔隙進入使焦亡細胞著色,但不染色凋亡細胞。我們發現TRI處理的 Hepa1-6 細胞LDH水平明顯升高,且Annexin V 和 PI 雙陽性細胞比例增多,提示TRI誘導了肝癌細胞焦亡。同時,肝癌細胞GSDME 沉默后沒有挽救TRI誘導的肝癌細胞死亡,而減少了TRI誘導的 LDH 釋放和細胞腫脹,并減少了雙陽性細胞的百分比。以上表明,TRI誘導肝癌細胞焦亡可能與激活GSDME表達有關。GSDMD是細胞焦亡通路代表性蛋白,已有大量研究證明,多種中藥可通過caspase-1/GSDMD通路抑制腫瘤的發生[13-15]。本研究Western blot結果顯示,TRI作用于肝癌細胞后,細胞中N-GSDMD蛋白水平未明顯改變,且擊倒Hepa1-6細胞的 Gsdmd 沒有影響TRI誘導的細胞死亡和 LDH 釋放。因此,GSDMD 不參與TRI誘導的 HCC 細胞焦亡,主要是GSDME。GSDME 依賴性細胞焦亡可由促凋亡蛋白caspase-3觸發。我們發現TRI誘導Hepa1-6 細胞中cleaved caspase-3、cleaved-PARP和 N-GSDME 的蛋白質水平呈劑量依賴性增加。因此,TRI可以誘導通過調控 caspase-3/GSDME 途徑誘發肝癌細胞焦亡。但TRI是如何激活caspase-3/GSDME的呢?

eIF2α/ATF4/CHOP通路是一個重要的信號通路調節細胞存活的途徑。磷酸化真核起始因子 2 α (eIF2α) 的表達受到刺激后,可增強激活轉錄因子 4 (ATF4),依賴于 ATF4-C/EBP 同源蛋白 (CHOP) 的表達上調,促進細胞凋亡[16]。據報道,eIF2α 通過多種途徑誘導細胞凋亡,包括線粒體依賴性途徑、死亡受體途徑和其他途徑[17]。研究表明,eIF2α在細胞凋亡中起關鍵作用并且與 ER 應激引起的許多疾病有關。在正常情況下,p-eIF2α的表達較低。然而,在病理情況下,p-eIF2α會急劇表達并引發細胞凋亡[18]。同樣,不同劑量TRI對肝癌細胞中p-eIF2α表達的影響,隨著TRI劑量的增加,p-eIF2α蛋白的水平明顯增加。最近的研究表明,化療藥物誘導的細胞焦亡是由 BAK/BAX-caspase-3-GSDME介導的,表明 BCL-2 家族的促凋亡因子可能參與細胞焦亡。此外,線粒體功能障礙觸發 caspase-3-GSDME 通路激活介導米替隆誘導的肝癌細胞焦亡。因此可能會有類似的誘導細胞焦亡的機制。以前的研究表明,ATF4/CHOP 可能是調節 BCL-2 家族的關鍵上游轉錄因子[19]。本研究顯示,TRI作用的肝癌細胞中ATF4蛋白水平明顯升高。這些結果表明 eIF2α/ATF4/caspase-3 通路是TRI 誘導GSDME升高的原因。最后,體內證據進一步證明TRI在 HCC 腫瘤中誘導腫瘤細胞焦亡。

綜上,TRI可能是一種潛在的治療HCC的候選藥物,并指出ATF4/caspase-3/GSDME可調節TRI誘導的焦亡過程。