白藜蘆醇通過miR-512-3P/DUSP1軸抑制葡萄膜黑色素瘤細胞的自噬并促進細胞凋亡

孫正楊,劉楠楠,范學菲,陳蘇環,陳唔奇,陳廣祎,邵玉寶,陳曉宇,

(1.安徽醫科大學組織胚胎學教研室,安徽 合肥 230032;2. 中國科技大學醫院眼科,安徽 合肥 230002;安徽醫科大學 3.臨床醫學系、4.形態學實驗中心, 安徽 合肥 230032)

葡萄膜黑色素瘤是一種嚴重的眼部癌癥,起源于葡萄膜的黑色素細胞,是成人致死率較高的眼部腫瘤[1]。白藜蘆醇(resveratrol,RES)是一種類黃酮多酚化合物,具有改善代謝和免疫功能,保護心肌細胞,且在抗腫瘤中具有顯著的效果[2],有報道RES對黑色素瘤也具有一定的治療效果[3-4]。miRNA(microRNA)是一類非編碼RNA分子,miRNA的異常表達與多種疾病有關。前期研究發現[5],miR-512-3P在腫瘤組織中表達減低,而在RES治療后明顯增加。雙特異性磷酸酶1(dual specificity phosphatase 1,DUSP1)具有調節細胞信號通路轉導的作用[6],在炎癥、免疫應答、癌癥等許多疾病中扮演重要角色。本研究旨在探究RES抑制葡萄膜黑色素瘤細胞(choroidal melanoma cells,MUM2B)自噬并促進其凋亡的調控作用及機制,為葡萄膜黑色素瘤尋找新的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞與試劑 侵襲性MUM2B購自美國典型生物資源保藏中心(ATCC,Rockville,MD,USA)。RES(R5010,分子量228.24),購自美國Sigma公司;DMEM(10569-010),購自美國Gibco公司;胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(04-001-1ACS),購自美國BI公司; Annexin V-PE/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒(BB-41012-3),購自上海貝博生物公司;CCK-8試劑盒(C0037),SYBR Green QPCR master mix(D7260),Hoechst 33342活細胞染色液(C1027),購自碧云天生物有限公司; mimic,購自擎科生物科技有限公司;Lipo2000(CN2483146),購自美國Thermo Fisher Scientific公司; RNA提取試劑盒(A4A0978),購自湖南AG生物科技有限公司。Epha2(bs-0485R),E-cadherin(bs-4310R)購自北京博奧森生物科技有限公司;ERK(WL01864),p-ERK(WLP1512),購自沈陽萬類生物科技有限公司;β-actin(ab8226),購自美國Abcam公司; AGO2(67934-1- Ig),購自武漢三鷹生物科技有限公司; LC3A / B(12741),p62(16177S),購自美國CST公司;p-mTOR(T56571),Bcl2(ab182858),Caspase3(T40044),購自上海艾比瑪特生物科技有限公司;Bax(YT0455),購自美國ImmunoWay公司。

1.1.2儀器 MultikanFC型酶標儀(美國賽默飛世爾公司);激光八色流式細胞儀(美國BD公司)Thermo Forma4111 CO2恒溫培養箱(美國熱電公司);LEICA.SP5-DMI6000-DIC共聚焦顯微鏡(德國Leica公司);蛋白電泳儀、蛋白轉膜儀、凝膠成像系統(北京六一儀器廠);TS2R-FL熒光倒置顯微鏡(日本尼康公司)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養與處理 MUM2B在Dulbecco的改良Eagle培養基中培養,內有10%胎牛血清和1%抗生素。將細胞在含5% CO2的37 ℃培養箱培養。使用Lipo2000將mimic轉染到MUM2B細胞中,然后將細胞用于后續實驗。

1.2.2細胞劃痕實驗 首先使用 marker 筆在 6 孔板背后,用直尺比著,均勻的劃橫線,大約每隔 0.5～1 cm 一道,橫穿過孔。在孔中加入約5×105個細胞。第二天用槍頭垂直與細胞平面,沿著前一天劃在平板背面的線在細胞層上進行劃痕。劃痕完成后,將細胞放入 37 ℃、5% CO2培養箱培養。然后在0 h和24 h取出細胞,顯微鏡線觀察并測量劃痕的寬度,并拍照。使用 ImageJ隨機劃取6～8條水平線,計算細胞間距離的均值。

1.2.3CCK-8檢測 收獲對數生長期的MUM2B細胞,以每孔1×106L-1的密度接種于96孔板,邊緣孔用PBS填充,5% CO2、37 ℃孵育至細胞貼壁。轉染24 h后,向每孔加入10 μL CCK-8溶液。將培養板在培養箱內孵育1～4 h。用酶標儀測定在450 nm處的吸光度。

1.2.4生信分析 通過GEO數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)獲取數據集GSE163942,并通過GEO數據庫在線分析工具GEO2R進行差異基因分析,篩選logFC>1或logFC<-1,P<0.05為差異基因。使用miRDB預測miR-512-3p與DUSP1的靶向結合。

1.2.5Western blot 使用制備的SDS裂解緩沖液從細胞中提取總蛋白,用于蛋白質印跡分析。然后,使用60% SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白質并印跡到聚偏二氟乙烯膜上。然后將膜在5%脫脂牛奶中密封1.5 h。加入相應一抗在4 ℃孵育過夜,然后加入HRP標記的二抗孵育1 h,并通過ECL發光系統檢測免疫反應。

1.2.6qRT-PCR 采用RNA提取試劑盒提取細胞RNA,采用紫外分光光度計檢測RNA濃度,置-80 ℃保存備用。采用SYBR Green QPCR master mix檢測RNA的表達。以β-actin為內參對照,取平均CT值(擴增動力曲線拐點),按2-△△CT進行半定量分析,計算目的基因相對表達量。引物序列見Tab 1。

1.2.7Hochest33342染色 棄去培養基,PBS洗2遍,滴加適量的Hoechst33342活細胞染色液,輕柔混勻。在適宜于細胞培養的溫度孵育10 min。吸除染液,用培養液或PBS洗滌2～3次,在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.8Annexin V-FITC/PI雙染檢測細胞凋亡 將細胞按5×108L-1的密度接種到6孔板培養24 h,轉染mimic。加入0.25%的胰酶溶液(不含EDTA)消化細胞,經過PBS沖洗,離心,加入100 μL緩沖液使細胞重懸。然后加入5 μL Annexin V-FITC及5 μL PI于室溫避光解育15 min。隨后加入400 μL緩沖液,采用流式細胞儀測定細胞調亡狀況。

1.2.9RIP實驗 RIP用于驗證miR-512-3p與DUSP1之間的結合關系。將全細胞裂解物與含有與抗Ago2抗體偶聯磁珠的RIP緩沖液一起在4 ℃孵育過夜,免疫球蛋白G(IgG)用作陰性對照。洗滌磁珠,提取RNA。通過qRT-PCR對共沉淀RNA進行評估。

2 結果

2.1 RES激活ERK通路抑制葡萄膜黑色素瘤的增殖與侵襲為研究RES在抑制MUM2B增殖與侵襲中作用,我們使用不同濃度RES(0、10、20、40、60、80 μmol·L-1)處理MUM2B細胞,劃痕實驗檢測細胞遷移,CCK-8檢測細胞活力,結果表明,高濃度RES(60、80 μmol·L-1)可以明顯抑制MUM2B的遷移與細胞活力(Fig 1A,B)。Western blot實驗結果表明,RES抑制了Epha2與E-cadherin蛋白表達(Fig 1C)。qRT-PCR結果表明,高濃度RES抑制MUM2BMMP2、MMP9、E-cadherin、PCNA、Epha2的RNA表達(Fig 1D)。此外RES還激活了ERK通路的表達(Fig 1E)。因此,RES通過激活ERK通路參與抑制葡萄膜黑色素瘤的侵襲與增殖。

2.2 RES通抑制MUM2B的自噬促進其凋亡為探究RES治療后MUM2B中自噬與凋亡的關系,我們使用不同濃度RES處理細胞,Western blot結果表明,P62大量蓄積,LC3B表達減少,Bax和Caspase3剪切體蛋白表達增多,Bcl2蛋白表達減少(Fig 2A,B)。然后使用不同濃度雷帕霉素處理經RES治療后的MUM2B,Western blot檢測自噬與凋亡蛋白表達,結果表明,雷帕霉素激活了細胞自噬,抑制了RES導致的細胞凋亡(Fig 2C,D)。上述結果表明,RES可能通過抑制MUM2B的自噬促進細胞凋亡。

2.3 RES通過促進miR-512-3p的表達靶向抑制DUSP1為進一步探究RES治療葡萄膜黑色素瘤的內在機制,我們通過qRT-PCR檢測,發現miR-512-3p在RES治療的MUM2B中高表達(Fig 3A)。通過生信分析與數據庫預測到miR-512-3p在MUM2B中低表達并且與DUSP1存在靶向結合位點(Fig 3B)。通過RIP實驗證明miR-512-3P能夠與AGO2形成沉默復合體靶向降解DUSP1(Fig 3C)。此外,過表達miR-512-3p抑制了DUSP1的表達(Fig 3D),并且Western blot結果顯示,RES抑制了MUM2B中DUSP1蛋白的表達(Fig 3E)。以上結果表明,RES通過促進miR-512-3p的表達靶向抑制DUSP1,從而參與抑制MUM2B的發生發展。

2.4 miR-512-3p抑制了MUM2B的增殖并促進其凋亡為進一步探究miR-512-3p在MUM2B中發揮的功能,我們過表達了miR-512-3p,qRT-PCR檢測E-Cadherin和Vim的RNA表達,結果表明,過表達miR-512-3p抑制了MUM2B的增殖(Fig 4A)。此外通過qRT-PCR檢測Bax、Bcl2的表達,通過Hochest33342與流式檢測細胞凋亡,結果表明,過表達miR-512-3p促進了MUM2B的凋亡抑制了細胞增殖(Fig 4B,C,D)。

3 討論

葡萄膜黑色素瘤也稱脈絡膜黑色素瘤,其具有非常強的轉移侵襲能力,且轉移后預后極差。當前對葡萄膜黑色素瘤的治療方法的研究多集中在免疫療法[7-8]。近年來,隨著對天然化合物的研究不斷增多,發現它們不僅對免疫性疾病、神經退行性疾病有著顯著治療效果,同時也能有效抑制腫瘤的發生發展[9]。在本研究中,我們發現RES能夠有效抑制MUM2B的增殖與侵襲,并且減少了MUM2B的氧化水平,此外,RES還通過抑制細胞自噬促進了MUM2B的凋亡。RES是一種類黃酮多酚化合物,具有良好的抗炎抗氧化以及抗腫瘤的作用,對黑色素瘤有一定的治療效果。本研究中我們發現RES能夠抑制MUM2B的增殖與侵襲。RES通過激活ERK通路,抑制MUM2B的自噬,并且促進了細胞凋亡,此外RES通過增加miR-512-3p的表達,抑制了DUSP1的表達,促進了ERK通路的激活。

miRNA是一類短小非編碼RNA分子,與腫瘤之間存在緊密的關系,可以作為腫瘤的潛在治療靶點或預測標志物。研究發現,miR-512-3p在肝癌細胞中有明顯的差異表達[10]。并且miR-512-3p還通過CDCA3參與三陰乳腺癌的調控[11]。我們研究中發現miR-512-3p在葡萄膜黑色素瘤中低表達,而在RES治療后出高表達,并且過表達miR-512-3p明細促進了MUM2B的凋亡抑制了細胞增殖。

DUSP1是一種擁有磷酸酯酶活性的蛋白質,它在細胞內參與調控多種信號通路。DUSP1可以通過去磷酸化MAPK從而抑制細胞增殖和促進細胞凋亡,進而對腫瘤的生長和轉移產生抑制作用[12]。在本研究中,我們發現DUSP1在MUM2B中高表達,而在RES治療后出現下降,并且抑制了MUM2B的凋亡。

本研究探討了RES治療葡萄膜黑色素瘤具有可行性的證據,RES可以通過ERK通路抑制細胞自噬促進其凋亡。此外,本研究闡明了RES通過miR-512-3P/DUSP1軸調控MUM2B自噬與凋亡的內在機制。為尋找葡萄膜黑色素瘤治療的新靶點提供了理論依據。

Fig 1 Resveratrol activated ERK pathway to inhibit proliferation and invasion of uveal melanoma

Fig 2 Resveratrol inhibited autophagy and promoted apoptosis in uveal melanoma cells

Fig 3 Resveratrol targeted and inhibited DUSP1 by promoting miR-512-3p expression

Fig 4 miR-512-3p inhibited proliferation and promoted apoptosis in uveal melanoma cells