急性腦缺血/再灌注損傷后神經元細胞骨架蛋白的動態變化

張 勇,付雪琴,鄒旭歡,王漫漫,王瑋瑋,蘭 瑞

(1. 鄭州大學第三附屬醫院中醫科,河南 鄭州 450052;2. 河南中醫藥大學第一臨床醫學院,河南 鄭州 450008;3. 河南中醫藥大學第一附屬醫院腦病診療中心,河南 鄭州 450000)

腦卒中是世界范圍內人類殘疾和死亡的主要原因。缺血性腦卒中可導致不同腦區域的腦損傷,引起多種表現各異的神經功能缺損[1]。越來越多的證據表明,梗死周圍區域是神經元部分保持能量活動的區域,其結構和功能的變化可能有助于神經元的存活和功能恢復[2-3]。研究已發現,梗死周圍區在卒中早期的重要作用,炎癥、細胞凋亡和突觸可塑性發生在缺血半暗帶[2]。缺血介導的軸突、樹突及細胞骨架蛋白的改變可能在腦損傷中發揮重要作用[4]。在急性腦缺血和再灌注期間,神經元細胞骨架的動態時間過程變化一直是大家關注的熱點。本研究建立腦缺血/再灌注損傷大鼠模型,觀察軸突、樹突結構及神經元細胞骨架蛋白的時空變化。

1 材料

1.1 實驗動物成年♂ Sprague-Dawley大鼠,SPF級,體質量230～250 g,購自鄭州市惠濟區華興實驗動物養殖場[生產許可證號:SCXK(豫)2019-0002]。飼養在溫度(22±2)℃、濕度(55±5)%的河南省中醫院SPF級動物實驗中心,光照12 h/黑暗12 h,實驗操作前可自由進食和飲水5 d。動物實驗經河南中醫藥大學動物福利與倫理委員會批準(批準號:PZ-HNSZYY-2020-019),研究在河南省中醫院中心實驗室進行。

1.2 主要試劑微管相關蛋白2(microtubule associated protein 2,MAP2)抗體(貨號:4542)、神經絲重鏈(neurofilament heavy chain,NF-H)抗體(貨號:30564)、β-actin抗體(貨號:4970)、DAPI(貨號:4083),均購自Cell Signaling Technology公司;膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acid protein,GFAP)抗體(貨號:G6171)、神經元核抗原(neuronal nuclei antigen,NeuN)抗體(貨號:MAB377),均購自Millipore公司;FITC標記山羊抗小鼠抗體(貨號:GB22301)、CY3標記的山羊抗兔抗體(貨號:GB21303)、HRP標記的山羊抗兔抗體(貨號:GB23303),均購自武漢賽維爾生物科技有限公司;ECL顯影液(貨號:PE0010),購自北京索萊寶公司;尼龍線栓,購自北京沙東生物技術有限公司。

1.3 儀器Labofuge 400R低溫高速離心機(美國Sigma公司);Multiskan酶標儀(Thermo Scientific公司);蛋白電泳儀、凝膠成像儀(美國BIO-RAD公司);熒光顯微鏡(日本Nikon公司)。

2 方法

2.1 實驗分組及腦缺血/再灌注損傷模型制備實驗大鼠隨機分為對照組(Sham)、大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)90 min再灌注3 h組(IR3 h)、MCAO 90 min再灌注6 h組(IR6 h)、MCAO 90 min再灌注12 h組(IR12 h)、MCAO 90 min再灌注24 h組(IR24 h)、MCAO 90 min再灌注48 h(IR48 h)組。依據既往課題組采用的大腦中動脈線栓法,誘導腦缺血/再灌注損傷[5]。深度麻醉大鼠后,暴露左頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈。統一直徑的線栓推進到頸內動脈管腔,阻斷大腦中動脈的起始部位,90 min后拔出線栓。假手術組大鼠不進行線栓插入。

2.2 神經行為學評價根據前期的研究,再灌注不同時間點評估神經功能缺損評分,并進行前肢放置實驗[6]。對組別設盲,神經行為學評估結束后揭盲。神經功能缺損評分:0分,實驗大鼠無神經功能缺損;1分,實驗大鼠右前爪未完全伸展;2分,實驗大鼠向左盤旋;3分,實驗大鼠向左滑落;4分,實驗大鼠不能移動;5分,實驗大鼠死亡。1～3分的大鼠進入隨后的研究。前肢放置實驗方法如下:正常大鼠胡須接觸桌角時引起同側前肢放在桌面上,缺血/再灌注后,大鼠胡須接觸桌角時,同側前肢放置測試不能完成。在不同的再灌注時間點,每只大鼠觸發前肢反射10次,記錄觸須后同側前肢正確放置桌角的次數。

2.3 尼氏染色不同的再灌注時間點,大鼠深度麻醉下經心臟灌注預冷生理鹽水、4%多聚甲醛。石蠟包埋腦組織,切成厚度為5 μm的冠狀切片。參考前期的研究進行尼氏染色[7]。選取前囟后0.24 mm腦組織冠狀切片脫蠟,用1%甲苯胺藍溶液在50 ℃染色30 min。沖洗后封片,在光鏡下隨機觀察缺血皮層、紋狀體周邊的細胞缺血/再灌注損傷,選擇3個視野進行完整細胞計數。

2.4 免疫熒光染色取石蠟切片,經脫蠟和抗原修復后,腦切片用含0.1% Triton X-100的阻斷緩沖液孵育,然后用封閉液孵育后,滴加稀釋后的一抗,4 ℃冰箱孵育過夜。沖洗后,與相應的熒光二抗在室溫下避光孵育1.5 h。DAPI染核后封片。熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.5 免疫印跡在不同時間點再灌注,實驗大鼠深度麻醉后,快速取出腦組織,分離出梗死周圍皮層,提取蛋白。通過SDS-PAGE電泳分離,然后轉移到PVDF膜,5%脫脂奶粉封閉后,與一抗4 ℃孵育過夜。TBST洗膜后,與HRP標記的二抗孵育90 min。洗膜后,ECL化學發光液顯色。

2.6 透射電鏡不同的觀察節點,實驗大鼠深度麻醉后,經心灌注生理鹽水、4%多聚甲醛及0.5%戊二醛混合溶液。取腦梗死周圍皮層組織,送至河南中醫藥大學電鏡室進行電鏡標本處理。透射電鏡下觀察軸突、樹突、神經絲等超微結構變化。

3 結果

3.1 MCAO后再灌注不同時間點腦損傷情況Nissl染色顯示(Fig 1A),隨著再灌注時間的延長,腦梗死范圍逐漸擴大,腦損傷加重,再灌注后24 h損傷最嚴重。定量分析顯示(Fig 1B、C),再灌注3 h后梗死周圍紋狀體的完整細胞數量明顯減少,細胞數量呈時間依賴性減少。值得注意的是,皮層損傷晚于紋狀體,再灌注后6 h缺血皮層細胞數量明顯減少,隨著時間的推移,在24 h達到最低值。

3.2 MCAO后再灌注不同時間點的神經行為學功能采用神經功能缺損評分、前肢放置實驗評價實驗大鼠的神經行為學功能。Fig 2結果顯示,再灌注3 h后,大鼠出現輕微的神經功能缺損。隨著時間的推移,神經行為功能逐漸惡化。

3.3 MCAO后再灌注不同時間點MAP2蛋白的表達變化采用MAP2與GFAP/NeuN免疫熒光雙染法檢測MCAO后再灌注不同時間點MAP2的動態變化。結果顯示(Fig 3),腦缺血/再灌注誘導MAP2免疫熒光強度降低,并且隨著時間的延長,MAP2的急性丟失確定了梗死邊界。MAP2與GFAP共標記表明,梗死區域MAP2、GFAP免疫熒光強度均減少,存在共染部分。然而,MAP2的免疫熒光強度在梗死周圍區域降低,GFAP的熒光強度增加,提示活化的星形膠質細胞在梗死周圍累積。MAP2與NeuN的共標記顯示(Fig 4),腦缺血/再灌注梗死及周圍皮層MAP2、NeuN共染細胞明顯減少,提示神經元在梗死區丟失死亡,在梗死周圍區域出現明顯的缺血/再灌注損傷。

3.4 MCAO后再灌注不同時間點NF-H蛋白的表達變化采用NF-H與GFAP/NeuN免疫熒光雙染法觀察NF-H的動態改變。Fig 5、6結果顯示,腦缺血/再灌注后缺血區、梗死區的NF-H熒光強度增強,12 h后明顯升高。梗死周圍區域NF-H免疫陽性細胞的形態異常,免疫信號斷續。不同區域的NF-H相關免疫熒光強度不同。NF-H與GFAP免疫熒光雙染顯示,腦缺血/再灌注后NF-H與星形膠質細胞存在部分共染,提示NF-H與星形膠質細胞可能存在相互作用。NF-H與NeuN免疫共染顯示,腦缺血/再灌注后NF-H與神經元突起,部分與樹突明顯不連續。

3.5 MCAO后再灌注不同時間點的軸突、樹突和細胞骨架變化采用電鏡、Western blot法觀察再灌注不同時間點的缺血皮層神經元細胞骨架變化。

Fig 1 Nissl-stained images and quantitative analysis of intact cells at different regions after MCAO and

Fig 2 Neurological function tests after MCAO and

Fig 3 Double immunofluorescence labeling of MAP2 (red) and GFAP (green) in ratmodels of MCAO and reperfusion

Fig 7結果顯示,腦缺血/再灌注后細胞骨架成分,如微管、神經絲排列受損。缺血皮層軸突神經絲密度明顯降低,電子密度降低,樹突腫脹。免疫熒光結果顯示,假手術組MAP2、NF-H免疫陽性細胞形態正常,排列規律。然而,再灌注24 h可見腫脹、不連續的微管和神經絲。與上述觀察結果一致,Western blot也證實,與假手術組相比,再灌注12、24、48 h后,MAP2和NF-H蛋白水平明顯降低。

4 討論

當動脈血流突然停止或下降至不合適的量時,相應的動脈供應區腦組織會發生細胞凋亡[8]、壞死[9]、鐵死亡[10]、自噬[11]、炎癥、氧化應激[12]等一系列事件,并進一步導致不可挽回的腦損傷[13]。缺血半暗帶是急需被挽救的重要區域,保護缺血半暗帶可減少缺血后的神經功能缺損,并有助于神經功能的改善[14-15]。MCAO法可成功建立梗死區、缺血半暗帶區,并模擬大動脈梗死的病理生理過程,是研究腦缺血/再灌注腦損傷最廣泛使用的模型[11]。本研究成功建立大腦中動脈閉塞再灌注損傷模型,動態觀察MCAO 90 min再灌注3～48 h后,神經功能缺損、細胞損傷。Nissl染色發現,腦缺血/再灌注3 h紋狀體區神經細胞呈現出缺血/再灌注損傷征象,而皮層的損傷出現較晚,隨著再灌注時間的延長,梗死區逐漸擴大,缺血半暗帶區完整神經細胞數減少,24 h的損傷最重。神經行為學評分結果表明,腦缺血/再灌注后大鼠的神經功能逐漸惡化,與梗死周圍區完整細胞的數量、梗死面積一致。

Fig 4 Double immunofluorescence labeling of MAP2 (red) and NeuN (green) in rat models of MCAO and reperfusion

MAP2與NF-H是神經元細胞骨架蛋白,參與維持神經細胞完整性和穩定性[4],并調節軸突轉運、突觸功能,影響神經元的功能[16]。腦缺血后,神經元細胞骨架的影響被認為是缺血病變從可逆性損傷至不可逆組織損傷演變的一個關鍵機制[17]。腦缺血發生后,神經元最易發生損傷,目前神經絲蛋白NF-L、MAP2、磷酸化NF-H外周水平被證明為腦損傷及神經元破壞的敏感標志物,與腦卒中患者的臨床結局有關。值得注意的是,神經骨架蛋白迄今為止未被深入研究并考慮為神經保護的潛在靶點[16,18]。既往的報道多采用腦缺血1個時間點的觀察,不同的是,本研究采用免疫熒光染色、免疫印跡、透射電鏡等多種實驗方法,系統研究缺血/再灌注急性期不同時點神經元骨架蛋白的改變,有助于明確缺血性腦卒中的發病機制和探尋神經保護的作用靶點。本研究發現,MCAO后再灌注6 h,缺血區域MAP2的免疫反應性下降,隨著時間的發展,MAP2免疫信號減少的區域逐漸擴大,提示梗死面積增加;再灌注12 h及更晚的觀察時間點,MAP2急性丟失并出現明顯的梗死-缺血邊界,這與先前文獻報道的缺血誘導的MAP2早期丟失一致[4,16]。同時,對比Nissl染色發現,MAP2染色更早、更準確反映缺血與梗死區域界限及細胞的形態變化。然而,本研究還發現腦缺血/再灌注12 h后,在梗死及缺血區域NF-H免疫反應性明顯增強,與文獻結果不太一致,可能是選用的動物及模型不同,而NF-H相關免疫強度增加,可能由于腦缺血/再灌注后與NF-H降解形成的小片段相結合導致。值得注意的是,腦缺血/再灌注后NF-H結構完整性被破壞,隨后的免疫印跡結果提示,缺血半暗帶皮層MAP2、NF-H蛋白水平呈現時間依賴性下調。為進一步獲得腦缺血/再灌注導致的神經元細胞骨架亞顯微結構變化,透射電鏡觀察軸突、樹突結構、神經絲密度,發現缺血半暗帶皮層神經絲腫脹、密度降低,軸突、樹突數量減低,周圍組織水腫,結構損害。超微結構的改變可能與觀察到的缺血/再灌注后MAP2、NF-H水平下降相關。以上結果均提示,在腦缺血/再灌注后,神經細胞骨架蛋白可能是缺血/再灌注損傷的神經保護潛在靶點。

Fig 5 Double immunofluorescence labeling of NF-H (red) and GFAP (green) in rat models of MCAO and reperfusion

Fig 6 Double immunofluorescence labeling of NF-H (red) and NeuN (green) in ratmodelsof MCAO and reperfusion

本研究進行腦缺血/再灌注后細胞損傷、行為學、神經元細胞骨架蛋白縱向現象描述,通過設立不同的再灌注時間點,在蛋白、超微結構等水平揭示了腦缺血/再灌注后神經細胞骨架的動態損傷,軸突、樹突、神經絲的破壞,缺血半暗帶區完整細胞的下降,這些可能與神經行為學的惡化、腦損傷逐漸加重密切相關。腦缺血/再灌注早期神經元細胞骨架蛋白可能是未來治療的靶點。隨后研究需要將時間點擴展至更長時間,進一步觀察神經元細胞骨架蛋白變化,并探索相關的潛在機制,同時探討缺血/再灌注后如何保持神經細胞骨架的完整性。

Fig 7 Alterations of axons and dendrites and MAP2/NF-H expression following MCAO and