Parkin泛素化調節線粒體穩態在心血管疾病中的研究進展

李珂娟,陳建淑,李勇男,謝宜欣 ,卜佳樂,張小衛

(蘭州大學第二醫院1.心血管內科、2.心胸外科,甘肅 蘭州 730000)

蛋白質翻譯后修飾通過調節蛋白質的活性、穩定性和定位來調節復雜的生物學過程。泛素化是蛋白質的一種翻譯后修飾,在哺乳動物細胞中可以檢測到的數萬個泛素化位點說明了泛素化的普遍性。泛素化通過一系列復雜的酶的級聯反應,將一個高度保守的多肽分子—泛素(ubiquitin,Ub)附加到靶蛋白上編碼獨特的生物信息,涉及的酶主要為E1泛素激活酶、E2泛素結合酶以及E3泛素連接酶。Parkin屬于E3泛素連接酶家族,E3泛素連接酶Prkn編碼Parkin蛋白,Parkin在線粒體質量控制、線粒體自噬和其他多種功能中起著重要作用[1]。線粒體除產生ATP外,還具有血紅素生物和活性氧(reactive oxygen species,ROS)合成、鈣穩態調節及參與調節信號轉導通路等功能[2]。因此生理狀態下,保持線粒體的正常功能對機體活動非常重要。值得注意的是線粒體的穩態受到線粒體動力學(包括線粒體融合與分裂)和線粒體自噬的泛素化的調節,當線粒體穩態失衡時,心肌細胞生物活動發生障礙,可導致高血壓、冠心病、心力衰竭和心肌病等心血管疾病。

1 Parkin泛素化在線粒體穩態中調控的作用

1.1 Parkin泛素化與線粒體動力學線粒體通過不斷地裂變和融合的循環來維持其正常的形態、分布和功能。心肌細胞中富含線粒體,為心臟正常活動提供能量保障,因此線粒體裂變和融合之間的動態平衡對維持細胞穩態尤為關鍵。動力相關蛋白1(dynamin-related protein 1,Drp1)是主要的裂變蛋白,Parkin靶向Drp1泛素化發生降解。敲除或突變Parkin基因,線粒體中Drp1增多,線粒體分裂過度,產生的ROS顯著增加,促進細胞凋亡[3]。研究發現Drp1的缺失使線粒體增大,說明線粒體裂變功能受損可導致介導線粒體融合的三個動力蛋白相關的GTP酶失活,它們分別為外膜線粒體融合蛋白1(mitofusin1,Mfn1)和線粒體融合蛋白2(mitofusin 2,Mfn2)以及內膜視神經萎縮蛋白1(optic atrophy gene 1,OPA1)[4]。線粒體泛素化主要作用于線粒體外膜蛋白,泛素化和去泛素化調控著這些蛋白的活性,如wMITOL使線粒體Mfn2泛素化,PINK1會選擇性地調節Mfn1和Mfn2以適應線粒體大小的增加,但并不調節OPA1[5]。

1.2 Parkin泛素化與線粒體自噬線粒體自噬是清除功能障礙或受損線粒體的一種選擇性調節形式,是一個線粒體自我降解的過程,線粒體自噬通過溶酶體識別和降解泛素靶向標記的受損線粒體。線粒體自噬能力受損,線粒體功能發生障礙,導致有缺陷的細胞器進行性積累從而造成細胞損傷。

線粒體受損蛋白被泛素化修飾并降解,無法修復的不可逆受損線粒體可能被線粒體自噬消除。線粒體自噬降解受損細胞器主要有兩條基本途徑(Fig 1):(1)依賴Pink1-Parkin的線粒體自噬:當線粒體受損時,線粒體膜發生去極化,Pink1穩定在線粒體外膜(outer mitochondrial membrane,OMM)上并被激活,使Mfn2和泛素分子發生磷酸化,從而招募Parkin到受損線粒體的膜上,Pink1使Parkin發生磷酸化并與磷酸化泛素結合,激活Parkin,Mfn2是Parkin的受體,兩者相互作用促進OMM上的多個線粒體相關蛋白泛素化,形成多聚泛素鏈,磷酸化的多泛素鏈與線粒體自噬接頭蛋白(如p62[4]、NDP52、OPTN、NBR1、TAX1BP1)相互識別并結合,其泛素結合區域LIRs與自噬標志物LC-3連接,從而介導線粒體自噬清除受損線粒體[6]。(2)非依賴Parkin的線粒體自噬(受體介導的線粒體自噬):是由某些線粒體蛋白(如FKBP8、BNIP1、BNIP3、FUNIP3和NIX)介導的,它們通過LIRs基序直接與自噬體膜上的LC-3B相互作用,并不通過泛素化作用[7]。

Fig 1 Parkin protein regulates mitochondrial homeostasis through ubiquitination

線粒體動力學紊亂通常與線粒體自噬協同作用,在小鼠特異性敲除Drp1實驗中發現線粒體自噬減少;使用BNIP3/NIX雙敲除和Drp1缺失的細胞系證實了通過依賴Drp1線粒體片段化和BNIP3/NIX介導的依賴Pink1線粒體自噬清除受損線粒體[8]。以上證據說明,泛素化和線粒體自噬通路高度協調,相互補充,在應激條件下維持線粒體穩態,從而保證細胞進行正常的生理活動。

2 Parkin泛素化調節線粒體穩態在心血管疾病中的作用

心臟是具有高能量需求的器官,若線粒體功能障礙或者數量減少,ATP產生水平降低,氧化應激增加,將會導致細胞功能障礙和細胞凋亡(Tab 1)。以下逐一展開分析線粒體功能障礙在各種心血管疾病中的作用機制。

2.1 Parkin泛素化調節線粒體穩態在高血壓中的作用心血管重構是高血壓發病機制中的一個中心特征,它意味著細胞的功能和結構的改變并伴隨著能量代謝的紊亂。細胞能量產生的改變為靶器官功能障礙或損傷提供了額外的基礎。代謝底物利用改變、ROS產生增加以及線粒體動力學的紊亂與線粒體能量產生減少相關。病變細胞中線粒體動力學的變化會對細胞活力和凋亡產生影響,并介導生物能學適應。線粒體受損發生線粒體動力學融合或裂變的失衡,細胞內有害成分積累增加,誘導細胞功能障礙或死亡。

有研究報道,PINK1/Parkin途徑參與細胞增殖過程,氧化應激可加重線粒體損傷,加速血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells ,VSMCs)的增殖,這是高血壓血管重塑的重要機制。蝦青素通過降低Drp1的磷酸化來抑制線粒體分裂,通過增加PINK、Parkin、線粒體轉錄因子A(mitochondrial transcription factor A ,TFAM)和PGC-1α的表達來增強線粒體自噬和生物合成過程,從而保護血管平滑肌細胞免受氧化應激誘導的線粒體功能障礙,減輕高血壓疾病的血管重塑[9]。胰島素樣生長因子Ⅱ(insulin like growth factor Ⅱ,IGF-Ⅱ)及其受體IGF-ⅡR也在高血壓期間發展成心力衰竭中起著重要作用,研究顯示IGF-Ⅱ觸發IGF-ⅡR受體激活,導致線粒體斷裂,線粒體功能障礙,通過Parkin依賴性線粒體自噬導致線粒體含量降低,ROS增加,最終心肌細胞死亡[10]。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性去乙酰化酶Sirtuin 3通過減輕有缺陷的線粒體自噬引起的線粒體功能障礙來促進血管生成,改善心肌纖維化[10]。高血壓導致的心肌肥厚是對負荷增加的一種代償性反應,持續的心臟壓力負荷過大會導致心臟功能惡化和心力衰竭。自發性高血壓大鼠的線粒體分裂蛋白Drp1減少,而融合蛋白OPA1增加,分別介導線粒體自噬和生物發生的Parkin和SIRT1/AMPK-PGC1α信號轉導減少。這些研究結果表明,自發性高血壓大鼠左心室線粒體功能障礙可能是線粒體動力學、自噬和生物發生受損的結果。在肺動脈高壓的生理病理機制中研究發現缺氧條件可以激活PINK1/Parkin介導的線粒體自噬途徑,誘導肺動脈平滑肌細胞過度增殖,導致肺血管重塑和肺動脈高壓。

Tab 1 Parkin-mediated ubiquitination regulates progression of cardiovascular diseases

2.2 Parkin泛素化調節線粒體穩態在冠心病中的作用冠心病主要由于冠狀動脈發生動脈粥樣硬化,血管狹窄或堵塞,導致心肌缺血缺氧或壞死而引起的心臟病。眾所周知,年齡是動脈粥樣硬化發生發展的獨立危險因素,有研究報道,在高脂飲食的老齡小鼠中觀察到,在主動脈老化中,可通過增加白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)導致線粒體功能發生障礙,加重主動脈粥樣硬化,同時Parkin水平增加,線粒體自噬也增加,對主動脈病變起代償作用[11]。Parkin通過調節線粒體自噬,起到保護心肌細胞作用。缺乏Parkin基因的小鼠線粒體網紊亂,線粒體明顯變小,對心肌梗死更加敏感,表現在Parkin-/-小鼠線粒體自噬障礙,受損線粒體累積,心肌梗死面積增加,小鼠死亡率增高。在細胞水平,Parkin基因在離體的心肌細胞中過度表達顯著減少缺氧導致的細胞死亡現象。另外,在缺氧的H9C2細胞中發現WDR26通過促進Parkin聚集在線粒體從而增加線粒體外膜蛋白泛素化,調節線粒體自噬,小鼠心臟缺血后引起WDR26升高,對心臟起保護作用[12]。

對小鼠造模心肌梗死后給予胰高血糖素樣肽-1受體激動劑DMB觀察到小鼠左心室重塑和心功能下降得到顯著改善,這是由于DMB增強了Parkin介導的線粒體自噬[13]。受體相互作用蛋白3 (receptor-interacting protein 3,RIPK3)在梗死組織中高表達,RIPK3表達的升高抑制了腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)AMPK通路和Parkin介導的自噬,線粒體通透性過渡孔開放增加,最終導致心肌細胞壞死[14]。由此可見心肌梗死后增強Parkin相關的線粒體自噬和線粒體生物發生是緩解心臟不良重塑的一個潛在可行性靶點。ROS可誘導內皮細胞凋亡[15],線粒體靶向抗氧化劑MitoQ可通過減少心肌細胞凋亡和ROS產生、增加細胞活力、線粒體膜電位水平和PINK1/Parkin表達來證明通過上調線粒體自噬對缺血/再灌注損傷具有保護作用[16]。

VSMCs的異常增殖是動脈粥樣硬化發病機制的關鍵因素之一。線粒體自噬通過誘導人類VSMCs凋亡,對抗動脈粥樣硬化形成,是一種保護機制。因此線粒體自噬是動脈粥樣硬化斑塊的潛在靶點。Apelin是G蛋白偶聯受體APJ的內源性配體,APJ是一種與血管緊張素Ⅱ 1型受體非常相似的受體,Apelin-13不僅增加了Drp1的表達,還減少了Mfn1、Mfn2和OPA1的表達,Apelin-13通過PINK1/Parkin介導的線粒體自噬激活p-AMPKα,進而促進人主動脈VSMCs增殖,并加劇動脈粥樣硬化病變的進展[17]。

2.3 Parkin泛素化調節線粒體穩態在心力衰竭中的作用心力衰竭時心臟不能充分泵出足夠的血液來滿足機體對營養和氧氣的需求,因此,能量代謝的改變是心臟衰竭的特征。線粒體功能障礙,ATP產生減少,加速ROS的產生和細胞色素c的釋放,促進心肌細胞損傷和死亡。另外心衰患者會發生線粒體解偶聯,這種解偶聯可能會減少ROS的產生,對心臟起保護作用。雙特異性酪氨酸調節激酶1B(dual specificity tyrosine phosphorylation regulated kinase 1B,DYRK1B)通過損害線粒體生物能,導致線粒體功能發生障礙,促進心肌肥厚和心力衰竭的發生發展[18]。

當細胞能量代謝發生變化時,AMPK能夠通過PINK1磷酸化激活 PINK1/Parkin介導的線粒體自噬,進而延緩心力衰竭的發展。在TAC誘導或AngⅡ誘導的小鼠心臟重塑過程中發現PINK1和Parkin均下調,抑制線粒體泛素化,加劇心功能障礙。而一些中藥活性成分如黃連素、人參皂苷Rg1等通過上調Parkin蛋白表達,增強線粒體自噬,抑制心肌肥厚和心室重塑,改善心功能。沉默信息調節2同源物1 (silent information regulator 2 homolog 1,SIRT1) 在心肌細胞中較多,SIRT1促進線粒體自噬,有助于改善線粒體功能障礙,因此,SIRT1可能是治療心力衰竭的靶點。持續刺激IL-6會導致ROS增加,線粒體膜電位改變,細胞內產生ATP減少,超氧化物歧化酶SOD活性降低,同時線粒體自噬相關蛋白PINK1、Parkin和Bnip蛋白表達增加,而雷洛昔芬會抑制IL-6,進而使IL-6介導的效應消失,緩解炎癥作用、心臟重塑以及心功能障礙[19]。叉頭轉錄因子家族成員叉頭盒O3a (forkhead box O3a,FOXO3a)蛋白通過轉錄激活Parkin蛋白進而促進線粒體自噬作用,抑制心肌肥厚[20]。Samm50是線粒體外膜蛋白,在心肌肥大模型中直接與PINK1相互作用,通過抑制線粒體自噬發生促進心肌肥大[21]。醛脫氫酶2(aldehyde dehydrogenase 2,ALDH2)可通過激活PINK1/Parkin信號通路抑制心肌細胞凋亡,有利于心力衰竭的恢復[22]。應激誘導蛋白IGF-ⅡRα引起內質網應激,當內質網發生應激,大量鈣離子釋放,線粒體攝取過量鈣離子,而線粒體的鈣超載是已知的導致細胞凋亡的重要因素;同時IGF-ⅡRα導致Parkin蛋白顯著降低,促進細胞凋亡,心肌細胞損傷,加劇心力衰竭發生[23]。

2.4 Parkin泛素化調節線粒體穩態在心肌病中的作用心肌病是由不同病因引起心臟機械和電活動異常的一組異質性疾病,嚴重心肌病會引起心血管性死亡或進展性心力衰竭,是年輕人心臟性猝死的主要病因。其中,擴張型心肌病(dilated cardiomyopathy,DCM)常容易導致心力衰竭,而肌聯蛋白截斷變異(titin-truncating variants,TTNtv)是導致DCM最常見的遺傳因素。在TTNtv性心臟中發現線粒體功能障礙,主要表現為心肌細胞耗氧率降低、ROS水平升高和線粒體蛋白泛素化[24]。線粒體通過產生ATP維持心肌細胞的能量需求,而線粒體功能障礙與線粒體形態改變將導致受損線粒體積累,進而可通過促進氧化應激、鈣穩態失調、代謝重編程、細胞內信號異常和心肌細胞線粒體凋亡來誘導或加重糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DC)。動物實驗與細胞實驗均證明,Mfn1與Mfn2是Parkin泛素化的底物,在DC中,Parkin使Mfn1泛素化并降解Mfn1,從而抑制線粒體融合。Parkin 缺失加重了糖尿病介導的心肌損害,反之,Parkin 過表達則對心肌細胞具有保護作用。

引起糖尿病心肌病的主要病理機制之一是血管內皮細胞(endothelial cells,ECs)功能障礙,有研究表明,ROS對去泛素化酶起負調控作用,線粒體功能障礙產生ROS增多,導致線粒體功能障礙相關蛋白質泛素化減少,阻止蛋白質降解。在2型糖尿病小鼠冠狀動脈ECs內觀察到增強抗氧化酶SOD2蛋白的泛素化使冠狀動脈ECs中線粒體ROS濃度增加,同時冠狀動脈血管松弛度減弱[25]。另外有研究報道泛素特異性蛋白酶USP12 (ubiquitin-specific protease 12)屬于去泛素化酶,作用于促凋亡蛋白Bax的K63位點連接的多聚泛素鏈,但是USP12對Bax的介導作用還未可知,需要進一步探索。

線粒體作為細胞主要的供能場所,線粒體穩態對于維持心肌細胞正常功能和心臟正常收縮與舒張至關重要。線粒體穩態主要受到線粒體動力學(包括線粒體融合與分裂)、線粒體自噬、線粒體生物合成以及線粒體DNA的調節。而泛素化參與線粒體動力學、線粒體自噬的調節,若線粒體穩態失衡,導致心肌細胞死亡和心肌肥厚,引起心室重構,將誘發一系列心血管疾病。

3 結語與展望

線粒體是細胞的一個完整的組成部分,它們的作用無疑與細胞活動有關。而線粒體穩態失衡是導致心肌細胞死亡和心肌肥厚的關鍵病理環節,其中泛素化調節線粒體形態改變以及線粒體自噬對心肌細胞的數量和質量至關重要。因此,需要對線粒體穩態調控機制深入研究,進一步探索更有效的潛在特異性靶向線粒體失衡的治療策略,從而為心血管疾病提供有效的預防和治療措施。