麥冬多糖對破骨細胞分化的影響研究

易 倩,張合富,李官翔,樊麗莎,鄧加加,張伶燕,張 健

(1.貴州中醫藥大學藥學院,貴州 貴陽 520025;2.貴州中醫藥大學實驗動物研究所,貴州 貴陽 520025)

骨骼作為維持機體運動的重要器官,在體內發揮著運動、支持、保護、造血、貯存礦物質等功能。正常情況下,機體內成骨細胞介導的骨形成能與破骨細胞介導的骨吸收保持動態平衡,維持骨骼的正常功能[1]。中老年人,尤其是絕經后的婦女,其破骨細胞過度激活、骨吸收增加,使得骨量降低、骨骼脆性增加,在微觀結構上呈現疏松多孔狀態,即骨質疏松癥。因此,抑制破骨細胞分化成為防治骨量丟失、治療骨質疏松癥的重要靶點。麥冬是我國使用廣泛的傳統中藥。據張錫純《醫學衷中參西錄》中記載,麥冬具有養陰潤肺、益胃生津、清心除煩等功效。麥冬多糖(OPS)是麥冬的主要成分,在麥冬中的提取率高達35%,這可能與麥冬的功效有關[2]。近期研究發現,OPS的作用更加廣泛,具有抗炎、抗氧化、抗衰老、降血糖、保護心肌、提高機體免疫力等多種功效[2-7]。研究發現,OPS通過降低氧化應激對巨噬細胞的損傷,減少細胞凋亡,從而起到保護巨噬細胞的作用[8],但其在骨代謝領域的功能尚未揭示。破骨細胞起源于骨髓單核巨噬細胞(BMMs),是體內唯一具有骨吸收能力的終末分化細胞。本研究探討了OPS對核因子-κB受體活化因子配體(RANKL)和巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)誘導的BMMs破骨分化、骨吸收的影響及潛在機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 6～8周SPF級C57BL/6j雌性小鼠10只,體重18～22 g,購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[SCXK(湘)2022-0011],飼養于貴州中醫藥大學實驗動物研究所動物房[SYXK(黔)2021-0005],溫度20～25 ℃,濕度40%～60%,自由采食及飲水,相關飼養及實驗操作經貴州中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準(20220131)。麥冬購于張家港市綠色中藥飲片有限公司(批號：190115)。

1.2主要試劑與儀器 α-MEM培養基、胎牛血清(美國Gibco公司),M-CSF、RANKL(美國Peprotech公司)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色試劑盒(美國Sigma公司),TRAP活性檢測試劑盒、細胞活性試劑盒、青-鏈霉素雙抗、RNAeasyTM動物RNA抽提試劑盒、BeyoRTTMⅢ cDNA合成試劑盒、BeyoFastTMSYBR Green定量聚合酶鏈式反應(PCR)試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)。多功能酶標儀(上海閃譜生物科技有限公司),相差顯微鏡(日本Olympus公司),T100TMPCP儀(美國Bio-Rad公司),實時熒光定量PCR儀(杭州博日科技有限公司),NanoDrop微量分光光度計(美國Thermo Fisher公司)。

1.3方法

1.3.1OPS提取 參照張靖等[9]介紹的方法對麥冬中的OPS進行提取,主要步驟為：取麥冬1 000 g加95%乙醇浸泡后,經水浴回流提取2次,隨后藥渣加9倍量水煎煮3次,所有藥液合并濃縮至1 L,進一步經醇沉、乙醚、丙酮洗滌后,60 ℃下干燥OPS粗粉末。隨后采用三氯乙酸法去除蛋白質,以苯酚-硫酸法測定OPS水平。根據OPS測定結果(實測值：88.76%)將其制備成含糖量為1 mg/mL的母液,經高壓滅菌后,于4 ℃保存備用。

1.3.2小鼠BMMs分離和培養 小鼠BMMs分離和培養步驟：(1)小鼠麻醉后脫頸處死,浸泡于75%乙醇中,置于超凈工作臺上;(2)迅速解剖小鼠并分離出雙側股骨,剔除附著物,用含雙抗的無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次后,剪除股骨近、遠端,暴露骨髓腔;(3)使用1 mL注射器抽取PBS反復沖洗骨髓腔,吹出骨髓組織,重懸于α-MEM完全培養基,1 200 r/min離心8 min后,棄上清液;(4)使用含50 ng/mL M-CSF完全培養基重懸后,接種于100 mm細胞培養皿中,過夜;(5)棄培養基,用無菌PBS沖洗3次后,加10 mL含50 ng/mL M-CSF完全培養基,隔天換液;(6)重復步驟(5)操作直至細胞呈短梭形,密度達80%～90%;(7)培養好的細胞使用PBS沖洗3次,用移液槍吹落后混勻備用,即為BMMs。后續BMMs培養時使用含50 ng/mL M-CSF完全培養基,進行破骨分化誘導時采用含 0 ng/mL RANKL、50 ng/mL M-CSF完全培養基。

1.3.3BMMs細胞活性檢測 按每孔3×103個細胞的密度將BMMs接種于96孔板中,按實驗設計分為對照組和3個不同水平OPS處理組。對照組使用含50 ng/mL M-CSF完全培養基(即0 μg/mL OPS),OPS處理組在此基礎上加入2.5、10.0、或40.0 μg/mL OPS(A、B、C組)。在給藥后48、96 h,每孔加入10 μL CCK-8試劑,繼續培養2 h后,使用酶標儀在450 nm波長處測定每孔吸光度(OD)值,計算細胞活性。

1.3.4BMMs破骨分化誘導 將BMMs按每皿1×105個細胞的密度接種到35 mm培養皿中,過夜后,使用破骨誘導分化完全培養基(α-MEM+10%胎牛血清+1%雙抗+1%谷氨酰胺+50 ng/mL RANKL+50 ng/mL M-CSF)進行破骨分化誘導,隔天換液。5 d后,在顯微鏡下可見BMMs開始匯聚、融合,出現多核細胞,7 d可見邊界清晰、巨大的成熟破骨細胞。

1.3.5破骨細胞TRAP活性檢測 為研究OPS對TRAP活性的影響,將BMMs按每皿1×105個細胞的密度接種到35 mm培養皿中,過夜、貼壁。隨后,按實驗設計更換為含不同水平OPS(0、2.5、10.0、40.0 μg/mL)的誘導培養基,隔天換液,7 d后誘導為成熟的破骨細胞。收集各培養孔細胞,并按照TRAP活性檢測試劑盒說明書測定破骨細胞TRAP活性及蛋白水平。

1.3.6破骨細胞形成檢測 將BMMs誘導為成熟的破骨細胞后,棄培養基,用PBS潤洗2次,每孔加500 μL 4%多聚甲醛,固定10 min。棄甲醛、用PBS沖洗2遍后,按照試劑盒說明書介紹方法進行TRAP染色。使用倒置顯微鏡拍攝染色圖,TRAP陽性且細胞核數目大于或等于3個的細胞計為破骨細胞,并通過ImageJ軟件進行破骨細胞相對大小的計算,破骨細胞相對大小=各組破骨細胞大小/對照組中破骨細胞大小的平均值。

1.3.7破骨細胞骨吸收能力檢測 將BMMs按每孔3×103個細胞的密度接種到骨培養板中,誘導為成熟破骨細胞后,棄培養基,用0.1%次氯酸鈉溶液漂白骨培養板。生物顯微鏡下觀察骨陷窩形成情況,獲取骨吸收圖像,并用Image Pro6.0軟件分析圖像。

1.3.8采用逆轉錄實時熒光定量PCR(RT-qPCR)法測定破骨細胞分化標志基因mRNA表達 將BMMs按每孔1×104個細胞的密度接種于6孔板中,過夜、貼壁后,按1.3.3分組培養細胞。7 d后棄培養基,用預冷的PBS沖洗1次后,每孔加入300 μL總RNA提取試劑,按照RNAeasyTM動物RNA抽提試劑盒說明書的方法提取細胞總RNA后,用NanoDrop微量分光光度計測定總RNA水平。隨后,按BeyoRTTMⅢ cDNA合成試劑盒說明書中介紹的方法逆轉錄合成cDNA,檢測碳酸酐酶2(Car2)、組織蛋白酶K(CTSK)、基質金屬蛋白酶9(MMP-9)、TRAP、液泡型H+-ATP酶(V-ATPase) mRNA表達水平。RT-qPCR所用引物序列見表1。

表1 破骨細胞分化標志基因的引物序列

2 結 果

2.1不同水平OPS對BMMs細胞活性的影響 A、B、C組48、96 h時OD值比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 不同水平OPS對BMMs細胞活性的影響

2.2不同水平OPS對破骨細胞分化的影響 細胞培養7 d后,經固定、TRAP染色,在倒置顯微鏡下觀察可見,對照組中出現大量多核、肥大、煎餅樣的成熟破骨細胞。與未添加OPS的對照組相比,添加OPS會顯著抑制破骨細胞生成。B組成熟破骨細胞數目顯著下降,C組只有極少量破骨細胞生成。見圖2。與對照組(1.00±0.15)比較,B組成熟破骨細胞數目降低至(0.61±0.06)(P<0.05),而C組成熟破骨細胞數目為(0.31±0.03)(P<0.05)。見圖3。

圖2 倒置顯微鏡下觀察各組破骨細胞分化情況(TRAP染色,100×)

圖3 不同水平OPS對破骨細胞分化的影響

2.3不同水平OPS對破骨細胞TRAP活性的影響 與對照組相比,B、C組5 d時破骨細胞TRAP活性顯著降低(P<0.05)。A、B、C組7 d時破骨細胞TRAP活性顯著低于對照組(P<0.05)。見圖4。

圖4 不同水平OPS對破骨細胞TRAP活性的影響

2.4不同水平OPS對破骨細胞骨吸收能力的影響 對照組中出現大量骨吸收陷窩,A組骨吸收陷窩明顯減少,C組僅可見少量骨吸收陷窩。見圖5。以對照組骨吸收面積為1,進一步統計分析顯示,A、B、C組骨吸收面積僅為對照組的71%、40%和6%(P<0.05)。見圖6。

圖5 骨吸收圖(100×)

圖6 不同水平OPS對破骨細胞骨吸收能力的影響

2.5不同水平OPS對破骨細胞相關基因mRNA表達水平的影響 與對照組比較,B、C組Car2、CTSK、MMP-9、TRAP、V-ATPase mRNA表達水平顯著降低(P<0.01)。見圖7。

圖7 不同水平OPS對Car2、CTSK、MMP-9、TRAP、V-ATPase mRNA表達水平的影響

3 討 論

麥冬是一種廣泛使用的傳統中草藥,OPS作為麥冬的主要成分,具有抗炎、抗氧化、降血糖、保護心肌、提高機體免疫力等功效。王曉穎[10]研究發現,麥冬糖漿能顯著降低放射性肺炎模型小鼠血漿中白細胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、轉化生長因子β1、肺組織的脯氨酸、超氧化物歧化酶、MMP-2及其組織抑制物蛋白水平。OPS還能夠調節單胺氧化酶B、IL-2、TNF-α、IL-6、γ干擾素及IL-10 mRNA表達,增強機體免疫力[11]。最近研究發現,OPS還具有抗腫瘤作用,羧甲基化修飾的OPS能有效地抑制癌細胞增殖[12]。且給S-180荷瘤小鼠灌胃2.0 g/kg OPS,可顯著提高巨噬細胞吞噬能力及血清IL-1β、TNF-α水平[13]。然而,OPS對骨吸收的影響鮮有報道。

破骨細胞來源于單核巨噬細胞系統[14]。破骨細胞的過度激活及伴隨骨吸收功能的過度活化是造成機體骨質疏松的重要原因。破骨細胞的活性主要體現在能否從單核巨噬細胞分化為破骨細胞,以及其溶骨功能的強弱。本研究結果顯示,40.0 μg/mL及以下水平的OPS對BMMs增殖無明顯抑制作用。對RANKL和M-CSF誘導的破骨細胞進行TRAP染色及骨吸收能力檢測,結果顯示,添加OPS能顯著抑制破骨細胞形成,減少骨吸收,且40.0 μg/mL OPS處理的BMMs幾乎不能形成成熟的破骨細胞。因此,OPS是一種潛在的有效抗骨吸收藥物。OPS對破骨細胞的顯著抑制作用可能與其抗氧化和抗炎功能相關。最近研究發現,OPS可有效地清除氧自由基,降低HIH/3T3細胞損傷誘導的單線態氧的產生及炎癥因子表達量[15]。另一方面,麥冬水提物能顯著抑制LPS誘導的小鼠單核巨噬細胞RAW264.7中一氧化氮的分泌和TNF-α蛋白表達,從而發揮抗炎作用[16]。在破骨細胞分化過程中,氧自由基的升高能激活機體的破骨細胞,促進骨吸收[17-19]。多種炎癥因子如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-11等可顯著促進破骨細胞的分化[20]。既然OPS具有有效的抗氧化及抗炎作用,而且活性氧及炎癥因子在破骨細胞分化過程中發揮重要作用,那么OPS對破骨細胞分化功能的抑制也與其抗氧化及抗炎作用相關,具體的機制有待進一步研究。

CTSK作為半胱氨酸蛋白酶家族中的一員,在破骨細胞中溶酶體和細胞質囊泡中大量表達[21],其參與有機骨基質蛋白中Ⅰ型膠原、骨橋接素和骨粘連蛋白的降解,是發揮骨吸收功能的一個關鍵酶[22]。人CTSK突變會導致致密性成骨不全,小鼠CTSK基因敲除會出現骨基質降解障礙[23]。ATPase屬于質子泵的一種,位于破骨細胞膜的褶皺緣處,用于維持破骨細胞封閉區的酸性環境。ATPase基因敲除小鼠的破骨細胞成熟度降低、骨吸收功能受到影響,骨骼硬度增加[24]。Car2主要存在于破骨細胞中的胞漿中,能催化二氧化碳的水合作用,產生質子[21]。TRAP位于破骨細胞的微粒體中,通過褶皺緣分泌進入封閉區,與其他酶一起參與骨基質中礦化物的降解,是骨吸收和破骨細胞活性的良好標志物,但其確切的生理作用還不清楚[25]。MMP-9屬于基質金屬蛋白酶家族中的一員。作為一種胞外蛋白酶,MMP-9在破骨細胞中高度表達,參與細胞外基質的降解,最終通過影響破骨細胞的遷移而影響破骨細胞活性[26-27]。MMP-9能特異性溶解非礦化軟骨,促進破骨細胞活化;MMP-9缺乏會延緩破骨細胞募集,抑制骨吸收,同時MMP-9還可以抑制成骨過程中細胞遷移[28]。因此,可通過檢測破骨細胞分化過程中上述基因表達的變化,探索OPS影響破骨細胞分化的機制。

本研究中,OPS可濃度依賴性地抑制M-CSF和RANKL刺激下參與膠原蛋白降解和骨陷窩形成的CTSK和MMP-9 mRNA表達,提示OPS對破骨細胞的骨吸收功能具有明顯的抑制作用。破骨細胞中,Car2催化產生的質子經V-ATPase轉運至破骨細胞褶皺緣,并維持吸收陷窩的酸性環境。本研究結果顯示,添加OPS可以抑制破骨細胞中Car2和V-ATPase mRNA表達,提示OPS可能會升高骨陷窩pH值,抑制骨吸收酶活性,降低骨吸收。

綜上所述,OPS可顯著抑制破骨細胞分化功能,抑制骨吸收,但其深層機制仍不清楚,有待進一步研究。