王俊乾 周靈杉 朱友琦 乙成成 白明

目的：分析亞低溫在I型干擾素（干擾素-α2b） 誘導的人心肌細胞AC16 凋亡過程中的作用及分子機制。

方法：不同濃度的干擾素-α2b 在不同時間點刺激人心肌細胞AC16，CCK-8 檢測心肌細胞增殖；流式細胞儀檢測干擾素-α2b 刺激心肌細胞后常溫、亞低溫對細胞的影響；線粒體Mito-Tracker 綠色熒光探針染色激光共聚焦成像觀察線粒體形態的變化；流式細胞儀檢測不同干預條件下線粒體膜電位變化情況；通過線粒體Mito-Tracker 綠色熒光探針染色激光共聚焦成像評估線粒體動力相關蛋白1（Drp1）與線粒體的共定位情況及不同干預條件對線粒體的影響；使用蛋白免疫印跡法檢測不同干預條件下，磷酸化Drp1 Ser616、Drp1、核酶多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1（PARP1）、剪切型PARP1（cleaved-PARP1）蛋白表達變化。

結果：CCK-8 及流式細胞儀檢測發現干擾素-α2b 抑制AC16 細胞增殖，并可誘導AC16 細胞凋亡，亞低溫干預發揮心肌保護作用；不同干預條件下，AC16 細胞線粒體損傷程度不一， 表現為亞低溫干預細胞具有較好的線粒體形態和更高的線粒體膜電位；Mito-Tracker 綠色熒光探針檢測發現心肌細胞損傷時Drp1 從胞漿轉移至線粒體中參與線粒體分裂，且亞低溫干預發揮抑制作用；蛋白免疫印跡法檢測發現亞低溫干預后磷酸化Drp1 Ser616/Drp1 和cleaved-PARP1/PARP1 顯著降低，且線粒體分裂抑制劑1（Mdivi-1）預處理可部分逆轉上述現象。

結論：亞低溫干預通過改善線粒體功能抑制I型干擾素-α2b 誘導的人心肌細胞AC16 凋亡。

心肌炎是以炎癥浸潤為主的心肌病變，并發癥嚴重且預后較差[1]。柯薩奇病毒B3（CVB3）等病毒感染是心肌炎的主要原因[2]。病毒感染機體會誘導心肌細胞產生大量I 型干擾素，包括干擾素-α、干擾素-β 等多種類型，干擾素可激活免疫系統以限制病毒感染[3]。然而，異常和過量的I型干擾素產生也會導致心肌炎癥損傷[4-5]，目前臨床治療手段有限。線粒體穩態對于維持正常心肌生理功能至關重要，近年來，有研究發現，線粒體損傷參與了心肌炎的發病過程[6]。生理條件下，心肌細胞中線粒體不斷融合和分裂以適應外部環境。當心肌細胞受到病毒、炎癥因子、氧化應激因子、鈣離子超載等因素刺激后，會引起線粒體損傷，受損的線粒體通過線粒體裂變發生斷裂，最終依靠自噬實現自身降解[7]。線粒體裂變主要由線粒體動力相關蛋白1（Drp1）介導，Drp1 過表達可促使線粒體的分裂增多，導致線粒體裂變，促進了細胞凋亡[8]。Caspase-3 是細胞凋亡的關鍵執行蛋白。核酶多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1（PARP1）是與DNA 修復密切相關的一種酶，Caspase-3 主要剪切PARP1。剪切型PARP1（cleaved-PARP1）被認為是細胞凋亡的重要指標[9]。低溫治療可通過控制性降低患者核心溫度以保護器官免受損傷影響，根據溫度不同，有輕度低溫（33℃～35℃）、中度低溫（28℃～32℃）、深度低溫（17℃～27℃）及超深度低溫（＜16℃）。在臨床中，輕度低溫又稱為亞低溫。有研究表明，亞低溫治療對心臟的保護作用由多種機制參與，包括代謝需求減少，心排血量需求減少，同時，亞低溫能夠減少活性氧釋放，另外，可通過線粒體途徑抑制細胞凋亡[10]。因此，我們推測亞低溫可能抑制I型干擾素誘導的人心肌細胞AC16 凋亡，且這個過程與線粒體穩態調節有關。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

實驗時間為2022 年9 月至2022 年5 月。人心肌細胞AC16 購自寧波明舟生物科技有限公司。CCK-8、膜聯蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（FITC）細胞凋亡檢測試劑盒、線粒體綠色熒光探針（Mito-Tracker Green）試劑盒、羊抗兔IgG 購自上海碧云天生物技術有限公司。BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，cleaved-PARP1兔單克隆抗體、PARP1 兔單克隆抗體、Drp1 兔單克隆抗體、磷酸化Drp1 Ser616 兔單克隆抗體、羊抗兔IgG 預吸附二抗購自英國Abcam 公司，ECL 化學發光劑購自北京普利萊基因技術有限公司。干擾素-α2b、線粒體分裂抑制劑1（Mdivi-1）均購自美國MCE 公司。

1.2 細胞培養與增殖檢測

細胞培養：將人心肌細胞AC16 培養在含有10%胎牛血清和雙抗的DMEM 培養基中，待細胞長到80%～90%時傳代。細胞貼壁后用不同劑量干擾素-α2b（25、50、100、200、400 ng/ml）處理AC16 細胞4 h。

CCK-8 檢測AC16 細胞活力：取對數生長期的AC16 細胞，在96 孔板中接種約5000 個細胞/孔，培養至細胞完全貼壁后按前述不同濃度的干擾素-α2b 處理細胞4 h，換液后繼續培養24、48、72 h。向每孔加入10 μl CCK-8 反應液，孵育2 h 后用酶標儀測定450 nm 處的吸光度。

1.3 細胞分組和處理

將細胞放置于恒溫培養箱培養，待細胞密度達70%～80%時分成7 組： 常溫組、常溫+干擾素-α2b組、常溫+干擾素-α2b +Mdivi-1 組、亞低溫組、亞低溫+干擾素-α2b 組、亞低溫+干擾素-α2b+ Mdivi-1 組。常溫組為（37.0±0.5）℃，亞低溫組為（33.0±0.5）℃。

常溫條件下，常溫+干擾素-α2b +Mdivi-1 組和亞低溫+干擾素-α2b + Mdivi-1 組首先加入1μmol/L Mdivi-1 預處理AC16 細胞3 h，其余組正常培養。常溫+干擾素-α2b 組、常溫+干擾素-α2b+Mdivi-1 組、亞低溫+干擾素-α2b 組、亞低溫+干擾素-α2b + Mdivi-1 組細胞分別加入200 ng/ml干擾素-α2b，且細胞開始按照不同溫度環境培養4 h；隨即此四組細胞更換為常規培養液，繼續在不同溫度下培養48 h。常溫組和亞低溫組始終使用常規培養液，常溫組始終常溫培養，亞低溫組則跟隨亞低溫+干擾素-α2b 組、亞低溫+干擾素-α2b+ Mdivi-1 組的時間點進行亞低溫培養。

1.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡

用0.25%胰酶[不含乙二胺四乙酸（EDTA）]消化的細胞，1 500 轉/min 離心5 min 后棄去上清，收集細胞；用預冷磷酸緩沖鹽溶液（PBS）重懸細胞2次，1500 轉/min 離心5 min，洗滌細胞；按照說明書分別用Annexin V 和PI 染色，于避光條件下室溫孵育10 min 后檢測細胞凋亡。

1.5 Mito-Tracker Green 檢測活細胞線粒體形態

按照說明書配制檢測試劑，去除細胞培養液后，加入Mito-Tracker Green 染色工作液，置于37℃培養箱共孵育15～45 min。使用37℃預熱的新鮮細胞培養液更換工作液后，用共聚焦顯微鏡觀察。

1.6 流式細胞儀定量檢測線粒體膜電位水平

以1×105個/孔密度將細胞接種于六孔板中，過夜后按上述分組處理細胞。胰酶消化后將細胞重懸于0.5 ml 細胞培養液中，加入0.5 ml JC-1 染色緩沖液混勻。置于37 ℃培養箱中孵育20 min 后，4 ℃條件下以600 g 轉速離心3～4 min，取細胞沉淀。按照說明書配制適量JC-1 染色緩沖液（1×）后置于冰浴盒，使用預冷的JC-1 染色緩沖液（1×）洗滌沉淀2 次后重懸細胞，上機分析。

1.7 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測磷酸化Drp1 Ser616、Drp1、cleaved-PARP、PARP 蛋白表達水平

制備樣品并檢測蛋白濃度，上樣后跑膠。切膠后于65 V 電壓轉膜2 h。室溫封閉1 h 后，加入對應一抗并置于4℃冰箱搖動過夜；室溫孵育二抗1 h 后，顯色并曝光，目的蛋白與內參蛋白的比值為相對蛋白含量。PARP1 抗體、cleaved-PARP1 抗體、Drp1 抗體、磷酸化Drp1 Ser616 抗體的稀釋比例分別為1 : 1 000、1 : 5 000、1 : 1 000、1 : 1 000。

1.8 免疫細胞熒光評估Drp1 易位

細胞爬片后進行線粒體的熒光標記；使用3%甲醛溶液室溫固定10～15 min，用PBS 洗滌3 次。將標本放置于12 孔板，用1% Triton-X 100 進行打孔穿透，室溫孵育5～10 min。用PBS 洗滌3 次。在封口膜劃分操作區域，每個樣本位點加適量3%牛血清白蛋白（BSA）封閉液，室溫封閉30 min。按1 : 250 的濃度稀釋Drp1 抗體，置于濕盒4℃封閉過夜，PBS 洗滌3 次。按1 : 500 的濃度稀釋山羊抗兔IgG 預吸附二抗和4’，6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽（Dapi）混合液，避光室溫孵育30～60 min 后用PBS 洗滌3 次。封片固定后使用共聚焦顯微鏡觀察拍照。

1.9 統計學方法

采用GraphPad 7.0 軟件進行統計分析。所有數據以±s表示。組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用Tukey 方法。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 常溫組和常溫+干擾素-α2b 組的心肌細胞活力的比較

24 h 時，常溫組與常溫+干擾素-α2b 組（干擾素-α2b 劑量25、50、100、200、400 ng/ml）的心肌細胞活力的差異均無統計學意義。48 h、72 h 時，常溫組與常溫+干擾素-α2b 組（干擾素-α2b 劑量25 ng/ml）的心肌細胞活力差異無統計學意義。從干擾素-α2b 劑量50 ng/ml 開始，隨著干擾素-α2b劑量（100、200、400 ng/ml）的增加，常溫+干擾素-α2b 組在48 h、72 h 時的細胞活力均低于常溫組（P均＜0.05）。

2.2 心肌細胞凋亡的比較（圖1）

圖1 流式細胞儀檢測細胞凋亡

與常溫組相比，常溫+干擾素-α2b 組、亞低溫+干擾素-α2b 組細胞凋亡率升高，亞低溫組細胞凋亡率降低，差異均有統計學意義（P均＜0.01）；與常溫+干擾素-α2b 組相比，亞低溫組、亞低溫+干擾素-α2b 組的細胞凋亡率明顯降低，差異均有統計學意義（P均＜0.01）；與亞低溫組相比，亞低溫+干擾素-α2b 組細胞凋亡率明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.01）。由此可見，亞低溫能夠抑制干擾素-α2b 誘導的細胞凋亡。

2.3 心肌細胞線粒體形態的比較（圖2）

常溫組細胞線粒體呈梭形；常溫+干擾素-α2b組細胞線粒體腫脹；常溫+干擾素-α2b + Mdivi-1組細胞線粒體腫脹變形得到緩解；亞低溫組細胞線粒體細長，其面積和周長指數更大，圓形度顯著降低；亞低溫+干擾素-α2b 組細胞線粒體腫脹程度減輕；亞低溫+干擾素-α2b + Mdivi-1 組細胞線粒體大部分正常。

2.4 心肌細胞線粒體膜電位水平（圖3）

圖3 流式細胞儀檢測線粒體膜電位水平

與常溫組相比，常溫+干擾素-α2b 組及常溫+干擾素-α2b+Mdivi 組細胞線粒體膜電位紅色熒光強度明顯減弱，綠色熒光強度均明顯增強，線粒體膜電位均明顯降低（P均＜0.01）。與亞低溫組相比，亞低溫+干擾素-α2b 組、亞低溫+干擾素-α2b+Mdivi組線粒體膜電位均明顯降低（P均＜0.01）。與亞低溫+干擾素-α2b 組相比，亞低溫+干擾素-α2b+Mdivi組細胞線粒體膜電位紅色熒光強度明顯增強，綠色熒光強度明顯減弱，線粒體膜電位明顯升高（P＜0.05）。這些結果表明，亞低溫及Mdivi-1 干預能夠上調干擾素-α2b 誘導的線粒體膜電位。

2.5 cleaved-PARP1/PARP1、 磷酸化Drp1 Ser616/Drp1 的蛋白表達水平（圖4）

圖4 蛋白免疫印跡法檢測心肌細胞cleaved-PARP1/PARP1 以及磷酸化Drp1 Ser616/Drp1 的蛋白表達水平

與常溫組相比，常溫+干擾素-α2b 組、常溫+干擾素-α2b+Mdivi 組磷酸化Drp1 Ser616/Drp1、cleaved-PARP1/PARP1 蛋白表達水平均明顯上調（P均＜0.01）。與常溫+干擾素-α2b 組比較，常溫+干擾素-α2b+Mdivi 組磷酸化Drp1 Ser616/Drp1、cleaved-PARP1/PARP1 蛋白表達水平明顯下調（P＜0.05）。與亞低溫組相比，亞低溫+干擾素-α2b 組、亞低溫+IFN-α2b+Mdivi 組磷酸化Drp1 Ser616/Drp1、cleaved-PARP1/PARP1 蛋白表達水平均明顯上調（P均＜0.01）。與亞低溫+干擾素-α2b 組比較，亞低溫+干擾素-α2b+Mdivi 組磷酸化Drp1 Ser616/Drp1、cleaved-PARP1/PARP1 蛋白表達水平明顯下調（P＜0.01）。

2.6 免疫細胞熒光評估心肌細胞中Drp1 易位情況（圖5）

圖5 免疫細胞熒光評估心肌細胞中Drp1 易位情況

常溫組細胞質中Drp1 熒光弱，細胞線粒體幾乎未募集到Drp1；常溫+干擾素-α2b 組細胞Drp1熒光最強，Drp1 向線粒體易位最強，表明在常溫狀態下干擾素對心肌細胞具有更強的損傷作用；常溫+干擾素-α2b+Mdivi-1 組細胞Drp1 熒光較常溫+干擾素-α2b 組減弱，向線粒體的遷移受限制；亞低溫組Drp1 熒光最弱，細胞線粒體未觀察到Drp1易位；亞低溫+干擾素-α2b 組細胞Drp1 熒光線粒體募集的Drp1 較少；亞低溫+ 干擾素-α2b+Mdivi-1組細胞線粒體募集的Drp1 進一步減少。

3 討論

病毒可以觸發免疫反應產生I型干擾素，對限制病毒感染至關重要，但異常和過量的I型干擾素產生會導致心肌炎癥損傷[4]。干擾素-α 誘導的心肌細胞是心肌炎體外模型的常用方法[5]。本文探討了亞低溫對I型干擾素（干擾素-α2b）誘導的人心肌細胞AC16 中線粒體相關功能的調控作用和機制，發現亞低溫干預能夠明顯抑制干擾素-α2b 誘導的心肌細胞凋亡，且與顯著增加的線粒體膜電位水平相關。先前的研究表明，治療性低溫32℃～34℃可能對新生兒缺氧缺血性腦病或心臟驟停患者的神經系統發揮保護作用[11-12]。也有研究表明，亞低溫能夠降低細胞的鈣負荷，維持心肌細胞能量代謝和調節組織水平的葡萄糖，也可清除活性氧[13]。另外，亞低溫可增強心肌細胞的小分子泛素相關修飾物（small ubiquitin-related modifier，SUMO）化修飾（SUMOylation），使心肌細胞中SUMO1 與靶蛋白結合的能力顯著提高，從而抑制凋亡相關蛋白的表達發揮拮抗心肌凋亡的作用[14]。亞低溫對心肌細胞的保護作用在本研究中也達到證實。

近年來，一些研究認為線粒體損傷參與了心肌炎的發病機制[6,15]。在生理條件下，線粒體融合和裂變通常保持動態平衡，以適應細胞環境[16]。而在病理狀態下，病毒感染、高糖、高脂、炎癥、氧化應激、鈣超載等多種危險因素都可能導致線粒體損傷。受損的線粒體通過線粒體裂變分離并通過自噬降解，而健康部分通過融合重新形成新的線粒體。線粒體動力學的不平衡會導致線粒體形態異常伸長或斷裂，最終導致細胞凋亡[17]。線粒體裂變主要Drp1 介導，該蛋白在激活時易位到線粒體外膜，通過翻譯后修飾，活性受到嚴格調控，包括磷酸化、棕櫚酰化、蘇甲酰化、S-亞硝基化和泛素化[8]。在細胞發生凋亡前，Drp1 從胞質溶膠到線粒體的易位主要受兩個關鍵位點的磷酸化調節：一個導致絲氨酸 616 的活化，另一個導致絲氨酸 637 的失活[18]。Drp1 從胞質轉移到線粒體，導致線粒體通透性轉換孔（MPTP）打開，通過這些孔道，線粒體內細胞色素C （Cyt-C）等促凋亡因子釋放后與凋亡蛋白酶活化因子1（APAF-1） 結合激活細胞凋亡蛋白酶-9（Caspase-9）。活化后的Caspase-9 可以使下游Caspase-3 酶原活化轉變為Caspase-3。它是激活凋亡的主要效應物，作用于不同的靶分子，最終導致細胞分解和程序性細胞死亡[19]。我們的研究發現， 干擾素-α2b 誘導的人心肌細胞AC16 Drp1蛋白ser616 位點表達水平升高，表明干擾素-α2b促進心肌線粒體分裂，而亞低溫干預部分延緩了了這一病理生理學過程。另一方面，本研究檢測干擾素-α2b 誘導的人心肌細胞AC16 中cleaved-PARP1與總PARP1 的表達占比，觀察到cleaved-PARP1 占比增高，表明與干擾素-α2b 誘導的細胞凋亡有關，同時上述過程可能與DNA 損傷有關。

亞低溫治療能夠減弱 Cyt-C 的釋放并且可以降低Caspase-9 的表達從而抑制線粒體誘導的細胞凋亡[20-21]。本研究發現，亞低溫干預能明顯減輕干擾素-α2b 導致的線粒體損傷，包括改善線粒體的形態，以及降低線粒體的凋亡率。對于線粒體膜電位，亞低溫干預能增加膜電位水平。另外，目前許多研究提示抑制 Drpl 激活以及抑制 Drp1 向線粒體膜上轉移可以抑制過度的線粒體分裂從而減輕缺血再灌注損傷后的細胞凋亡。而亞低溫對 Drp1 活性的影響仍少見報道，本研究發現，亞低溫能夠降低Drp1 蛋白的表達水平，減少Drp1 向線粒體易位。Mdivi-1是Drp1 的關鍵抑制劑。既往研究示，Mdivi-1 預處理可通過抑制Drp1 表達上調，減輕心肌細胞死亡[22]。此外，Mdivi-1 能夠通過抑制線粒體膜電位耗散、改善線粒體ATP 能量產生、減輕ROS 過度產生和保護氧化應激誘導的細胞損傷，改善線粒體功能障礙[23]。本研究發現，Mdivi-1 可降低Drp1 蛋白的表達水平，減少Drp1 向線粒體易位，并使線粒體膜電位恢復。

綜上所述，亞低溫干預通過改善線粒體功能抑制干擾素-α2b 誘導的人心肌細胞AC16 凋亡，表明治療性低溫有望成為病毒性心肌炎治療的有效手段。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突