超聲波萃取苦荬菜葉中β-谷甾醇的工藝優化及其動態積累

閆雨婷,郝俊峰,榮 榮,賈玉山,王志軍,格根圖*

(1.內蒙古農業大學草原與資源環境學院,農業農村部飼草栽培、加工與高效利用重點實驗室,草地資源教育部重點實驗室,內蒙古 呼和浩特 010019; 2.興安盟林業和草原局,內蒙古 烏蘭浩特 137400)

苦荬菜(LactucaindicaL.),別名山萵苣、苦菜、鵝菜、涼麻等,是菊科萵苣屬的一年生或多年生草本植物,野生種分布遍及全國[1-3]?？噍げ藢Νh境的適應性極強,具有耐寒耐旱、耐鹽堿和耐瘠薄等優點,在我國分布較廣[4],東三省及內蒙古地區均大面積種植[5]?？噍げ藸I養價值豐富,是一種適口性極好的高產優質的青綠飼料。其葉量大,脆嫩多汁帶苦味,鮮草可直接飼喂各種畜禽和草食性魚類,也可打漿添加草粉、米糠等飼喂[6-7]。此外,苦荬菜還具有較高的藥用價值,其富含黃酮類、脂類、萜類、甾醇類等活性物質,具有清熱解毒、消炎止痛、抗氧化、抗衰老和抗腫瘤等生物活性[8-9]。

蒙早苦荬菜(LactucaindicaL.cv. Mengzao)含有豐富的活性物質,包括甾醇類物質,且多集中于開花初期的葉片中[4,10]。作為蒙早苦荬菜中主要的活性物質,天然甾醇存在于各種植物中,目前植物甾醇已應用于食品、化妝品、醫藥、工業等領域[11]。植物甾醇主要包括豆甾醇、菜油甾醇、β-谷甾醇、谷甾烷醇等。而β-谷甾醇是植物甾醇的主要成分,占總量60%～90%[12]。在醫療領域,植物甾醇作為一組植物來源的化合物,能夠降低血液中有害膽固醇的水平和動脈粥樣硬化的風險[13]。采用β-谷甾醇對小鼠進行干預治療,可以達到抑制神經炎癥、神經細胞凋亡和氧化應激的效果,改善小鼠的認知功能[14]。王凱等[15]研究發現β-谷甾醇對肝癌細胞的凋亡有促進作用,可抑制肝癌細胞的增殖。在養殖業領域,β-谷甾醇的促生長、抑菌、抗炎和免疫調節等生物學特性使它在無抗養殖中具有良好的應用前景[16]。日糧中添加β-谷甾醇能改善肉雞飼料效率[17]。

目前,關于植物甾醇的提取方法有多種,常見的提取方法有溶劑結晶法、絡合法、皂化法、蒸餾法(簡單蒸餾法、分子蒸餾法)、吸附法(柱吸附法、高壓流體吸附法)、超臨界CO2萃取法、酶提取法等[18-19]。對于植物甾醇提取工藝的研究中,大部分采用熱水浸提法、乙醇回流法等[20],這類工藝有提取時間較長、提取溫度較高、提取率較低的缺點。而超聲波法具有時間短、提取率高、不需加熱(不破壞熱敏有效成分)等優點[21],現如今關于植物甾醇提取的研究也多圍繞此方法進行[22-24]。本研究以蒙早苦荬菜葉片為材料,通過超聲波提取法,研究不同時間、溫度、超聲頻率、料液比對蒙早苦荬菜葉中提取量的影響,并探究其動態積累規律。通過本研究,可為苦荬菜的精深加工提供方向,也為進一步開發和利用β-谷甾醇奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為蒙早苦荬菜,是內蒙古農業大學培育的飼草品種。2018年6月—2018年9月,選取不同生育期(幼嫩期、營養生長期、開花初期、開花中期、開花末期和結實期)的蒙早苦荬菜葉片,分別采集不同植株葉片,將采集的新鮮葉片沖洗并自然晾干表面水分,用植物粉碎機粉碎,過60目標準篩,備用。

1.2 試劑與儀器

試劑:無水乙醇、甲醇(均為色譜純),甾醇標準品(β-谷甾醇),均購于上海源葉生物科技有限公司。

儀器設備:E2695-2489高效液相色譜紫外聯用儀,沃特世科技(上海)有限公司;C18 4.6×250 mm,5 μm色譜柱,美國安捷倫科技有限公司;VOSHIN-1500C低溫超聲波萃取儀,無錫沃信儀器制造有限公司。

1.3 測定指標及方法

1.3.1超聲波輔助提取法

①單因素試驗設計:以70%乙醇為提取溶劑,以超聲時間、溫度、頻率、料液比為四因素設計單因素試驗,重復3次。

時間:固定溫度30℃、頻率20 KHz、料液比1∶10 g·mL-1,分別考察不同提取時間(min)對苦荬菜主要活性物質提取量的影響。

溫度:固定時間20 min、頻率20 KHz、料液比1∶10 g·mL-1,分別考察不同提取溫度(℃)對苦荬菜主要活性物質提取量的影響。

頻率:固定時間20 min、溫度30℃、料液比1∶10 g·mL-1,分別考察不同提取頻率(KHz)對苦荬菜主要活性物質提取量的影響。

料液比:固定時間20 min、溫度30℃、頻率20 KHz,分別考察不同料液比(g·mL-1)對苦荬菜主要活性物質提取量的影響。

②正交試驗設計:在單因素試驗基礎上,采用超聲波輔助提取法,以70%乙醇為提取溶劑,將時間、溫度、頻率、料液比為四因素,按L9(34)正交試驗進行苦荬菜活性物質的提取,重復3次。

③驗證試驗:基于正交試驗結果,稱取1.00 g粉碎樣品,在最適提取條件下,平行試驗3次。

1.3.2色譜條件 流動相:100%甲醇等度洗脫。流量:1.0 mL·min-1。進樣量:20 μL。檢測波長:205 nm。柱溫:30℃。甾醇高效液相色譜圖見圖1,其A為β-谷甾醇標準品溶液,B為樣品溶液。

1.3.3對照品溶液制備 稱取β-谷甾醇2.95 mg,精密稱取至100 mL容量瓶中,用70%甲醇稀釋溶解定容至25 mL,搖勻靜置15 min,分別取2 mL,4 mL,6 mL,8 mL,10 mL,12 mL配制成23.13 μg·mL-1,46.26 μg·mL-1,69.39 μg·mL-1,92.52 μg·mL-1,115.65 μg·mL-1,138.78 μg·mL-1的標準溶液,在色譜條件下進行分析,以濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標,繪制標準曲線。

1.3.4方法檢驗

①線性關系:在相同色譜條件下,將不同質量濃度的對照品溶液分別進樣10 μL,色譜峰面積為縱坐標,對照品質量濃度為橫坐標,得回歸方程Y=54.289x-260.36,R2=0.999 9,對照品在β-谷甾醇質量濃度23.13～138.78 μg·mL-1范圍內有良好線性關系。

②精密度試驗:將最低濃度的照品溶液進樣10 μL,在擬定的色譜條件下連續進樣6次,記錄峰面積。相對標準偏差(Relative standard deviation,RSD)=0.13%(n=6),表明儀器精密度良好。

③穩定性試驗:將供試品溶液在0 h,2 h,4 h,8 h,12 h,24 h時進樣10 μL,平行試驗6次,記錄峰面積,相對標準偏差(RSD)=0.28%(n=6),其供試品溶液在24 h內穩定。

④重復性試驗:精密稱取苦荬菜樣品粉末1.0 g 6份,按供試品溶液制備,在擬訂色譜條件下進樣10 μL,記錄峰面積,RSD=0.95%(n=6),表明重復性良好。

⑤加樣回收試驗:稱取已知提取量的苦荬菜樣品粉末0.25 g左右,6份,用70%乙醇稀釋至10 mL,按供試品溶液處理。加入1 mL β-谷甾醇標準品溶液(2.84 mg·mL-1),相同色譜條件下測定。結果平均回收率為95.66%,RSD為0.06%,表明該測定方法合理。

1.3.5數據統計分析 利用SAS 9.4軟件進行數據統計分析(ANOVA)、使用Excel進行圖表制作、使用SPSS 23軟件建立PROBIT回歸模型。每個試驗均進行3次重復。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果分析

2.1.1提取時間對甾醇提取率的影響 由圖2可知,甾醇在20～80 min范圍內呈先上升再下降的趨勢,在提取時間20 min時最低,并由此開始升高,在提取時間40 min時達到最高,在60～80 min時持續下降。

圖2 提取時間對β-谷甾醇物質提取量的影響Fig.2 Effect of extraction time on extraction of β-sitosterol

2.1.2提取溫度對甾醇提取率的影響 由圖3可知,甾醇提取率在40℃～70℃范圍內呈先上升再下降的趨勢,在40℃時最低,在40℃～60℃時持續上升,在60℃時最高,在60℃～70℃時下降,并在70℃條件下達到相對較低值。

圖3 提取溫度對β-谷甾醇物質提取量的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction of β-sitosterol

2.1.3料液比對甾醇提取率的影響 由圖4可知,甾醇提取率在1∶10～1∶40 g·mL-1范圍內呈先上升再下降的趨勢,在1∶10～1∶20 g·mL-1時上升,在1∶20 g·mL-1時呈最高值,在1∶20～1∶40 g·mL-1時下降,1∶20～1∶30 g·mL-1時下降幅度較大,1∶30～1∶40 g·mL-1時下降幅度較小,在1∶10 g·mL-1時最低。

圖4 料液比對β-谷甾醇物質提取量的影響Fig.4 Effect of material-liquid ratio on extraction of β-sitosterol

2.1.4提取頻率對甾醇提取率的影響 由圖5可知,甾醇提取率在40～100 KHz范圍內呈上升-下降-上升趨勢,在40～60 KHz時上升,在60 KHz時最高,在60～80 KHz時下降,并在80 KHz時最低,在80～100 KHz時繼續上升,100 KHz時達到相對較高值。

圖5 提取頻率對β-谷甾醇物質提取量的影響Fig.5 Effect of extraction ultrasonic frequency on extraction of β-sitosterol

2.2 正交試驗結果分析

根據單因素試驗,β-谷甾醇為研究對象,提取時間、提取溫度、超聲頻率、料液比為因素,每一個因素設置三個水平,設計正交試驗。正交試驗結果如表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Orthogonal test factor level table

由表2可知,β-谷甾醇提取量在提取條件A1B3C3D3時最高,即提取時間20 min、溫度60℃、頻率80 KHz、料液比為1∶30 g·mL-1,提取量為12.08 mg·g-1,與其他組相比差異顯著(P<0.05)。由R值可知,各因素對苦荬菜甾醇提取量的影響大小順序為:D>A>C>B,即料液比>時間>頻率>溫度。根據K值,最佳提取條件為A1B1C3D3,與甾醇提取量為最高的試驗組條件不一致,需進一步驗證試驗。

表2 超聲波輔助提取法正交試驗設計與結果分析Table 2 Ultrasonic -assisted extraction orthogonal test design and result analysis

β-谷甾醇對照組提取量為2.64 mg·g-1,RSD為1.16%。在提取條件A3B3C3D1下,提取量達到12.08 mg·g-1,RSD為0.05%(表3)。在提取條件A1B1C3D3下,甾醇提取量為12.31 mg·g-1,RSD為0.84%(表3),顯著高于其他兩組(P<0.05)。

表3 驗證試驗結果Table 3 Verification test results

由表4可知,根據F值,甾醇各因素影響均極顯著差異(P<0.01),甾醇正交試驗平方和誤差為0.07。

表4 超聲波輔助提取法正交試驗方差分析Table 4 Analysis of variance of orthogonal test by ultrasonic assisted extraction

2.3 不同生育時期干燥樣品中的活性物質提取量差異

將苦荬菜新鮮葉片干燥處理后,根據正交試驗結果分別提取苦荬菜甾醇物質,分析苦荬菜甾醇物質提取量隨生育時期的變化。

由圖6可知,不同生育期的葉中甾醇提取量差異較大,呈下降-上升-下降的趨勢。在開花初期,甾醇提取量最高,達13.22 mg·g-1。在結實期時最低,僅有6.35 mg·g-1。因此,對葉片甾醇物質的提取最好選擇在開花初期,以便獲得最大量的活性物質。

圖6 蒙早苦荬菜β-谷甾醇提取量隨生育時期變化分析Fig.6 Analysis of the variation of β-sitosterol extraction with fertility period in Lactuca indica L.cv. Mengzao注:圖中不同大寫字母表示差異顯著(P<0.05)Note:Different capital letters in the figure indicate significant differences(P<0.05)

3 討論

超聲輔助提取是一種利用超聲波輻射產生的多級效應加速目標成分進入溶劑,提高提取效率的方法[25]。超聲輔助不僅能降低萃取溫度,加快能量轉移,選擇性萃取,更利于提取熱敏化合物,還可使用多種溶劑[26]。榮榮[4]通過研究得到超聲波輔助提取法與其他兩種提取法相比更適用于苦荬菜甾醇類物質的提取。本研究的最佳工藝條件為時間20 min、溫度40℃、頻率80 KHz、料液比1∶30 g·mL-1,提取量為13.22 mg·g-1。提取量隨提取時間的增加呈先上升后下降的趨勢,是由于隨著超聲時間地增加細胞膜破碎數量越多,破碎程度越大,植物甾醇溶出越多,但超聲時間超過40 min后,細胞破碎程度增大后雜質也相應增多,不利于植物甾醇提取,提取量有所降低[27]。在本研究中,提取量隨提取溫度的增加呈先上升后下降的趨勢,原因可能是,當溫度高于60℃時,溶劑汽化程度變大,減小了溶劑與原料的接觸面積,同時可能造成有效成分的分解,從而降低了植物甾醇的提取量[28]。提取量隨料液比的增加呈上升-下降-平緩的趨勢,隨著溶劑體積增加,原料與提取溶劑接觸面積增大,溶出的植物甾醇隨之增多,其提取量顯著增加,當料液比達到1∶20 g·mL-1時,提取量最大,隨著提取溶劑體積的繼續增加,其他物質會隨著體積增大而相應增加,抑制植物甾醇溶出,植物甾醇含量有所下降,最終趨于平緩。提取量隨超聲頻率的增加呈先上升后下降的趨勢,由于超聲波功率越大,空化作用越強烈,但超聲功率增大到一定程度時(頻率80 KHz)容易產生大量無用的空化泡,增加散射衰減,形成聲屏障,反而會減弱提取效果[29]。夏秋敏等[30]對蘋果籽進行植物甾醇的提取,得出的最佳提取工藝與本研究差異較大。李會珍等[27]對紫蘇中甾醇物質進行提取得出的最佳工藝也與本研究存在差異。因此,不同植物材料需要不同提取工藝條件才可最大限度地提取出活性物質。

本文對蒙早苦荬菜干燥葉片進行了不同生育期活性物質提取量差異的研究。李賽飛等[31]從段木靈芝子中提取活性物質,研究表明在段木靈芝生產過程中,子實體彈射孢子早期之前,采收越早,多糖和三萜含量越高。隨著生育期的推移,植物不斷的生長同時積累營養物質,但當達到營養峰值時,莖葉比例增加,逐漸老化,植株中結構性碳水化合物含量增加,影響化學營養成分含量的變化[32]。在一般條件下,植物的光合作用和酶活性對植物的生長發育和有效成分的積累有影響[33-34]。在本研究中,甾醇類物質的提取量在開花初期達到最高水平,隨后呈現下降趨勢。其原因可能為隨著夏季氣溫的升高,葉片中的養分迅速積累,但隨之被花吸收,葉片中β-谷甾醇含量隨之下降[35]。董金平等人[36]指出,中華苦荬菜中的活性成分在5-7月生長旺盛期提取量達到最高,同樣王璐璐等人[37]從中華苦荬菜中提取有效成分,發現活性提取物提取量在盛花期達到峰值,之后逐漸下降。本研究選擇開花初期獲得了預期成果,這與上述研究結論一致。研究發現在對苦菜各部位進行總黃酮的提取時,各部位中葉片含量最高[38]。馬春梅等人[39]從菊科植物毛菊苣中提取甾醇類物質,發現它們主要集中于花與葉片中。因此,本文選擇葉片部位、開花初期進行試驗是最優選擇。在對植物活性物質類物質進行研究提取時,應優先考慮葉片部位。

4 結果

本研究以蒙早苦荬菜葉片為原料,結合超聲波輔助提取法,利用單因素試驗及正交試驗確定了甾醇類物質最佳提取工藝為提取時間20 min,溫度60℃,頻率80 KHz,料液比1∶30 g·mL-1。在此工藝條件下,甾醇類物質的含量達到最高,為12.08 mg·g-1。各因素對苦荬菜中β-谷甾醇提取量的影響大小順序為:料液比>時間>頻率>溫度。β-谷甾醇提取量最高的生育時期為開花初期,此時高達13.22 mg·g-1。