冬瓜枯萎病菌的分離、鑒定及冬瓜種質抗性鑒定

曾莉莎 陳康麗 杜彩嫻 李洪波 苗兵兵 莫偉欽 呂順

摘? ? 要：冬瓜在瓜類蔬菜生產中占有重要地位，而枯萎病嚴重威脅冬瓜的安全生產。通過病原菌致病力測定、形態學特征觀察、培養特性比較，以及基于翻譯延伸因子（TEF-1α）的系統發育分析，對采自廣東、廣西等地的冬瓜枯萎病病原菌進行鑒定，將引起冬瓜枯萎病的病原鑒定為尖孢鐮刀菌冬瓜?；停‵usarium oxysporum f. sp. benincasae）。在此基礎上，選取致病力較強的冬瓜枯萎病菌株，以不同冬（節）瓜資源為材料，采用苗期灌根接種法對所收集的26份小冬瓜資源、47份節瓜資源和74份大冬瓜資源進行抗病性鑒定。結果表明，147份冬（節）瓜資源的抗性鑒定結果差異相對較大，且不同冬（節）瓜資源間的枯萎病發病率存在顯著差異，其中26份小冬瓜資源中沒有1份高抗材料；47份節瓜資源中有2份高抗材料（JG-25和JG-33），占比4.26%；74份大冬瓜資源中有4份高抗材料（DDG-19、DDG-32、DDG-40和DDG-74），占比5.41%。研究結果為抗枯萎病冬瓜種質資源的篩選及瓜類枯萎病抗性遺傳育種提供參考。

關鍵詞：冬瓜；節瓜；枯萎??；病原菌; 抗性鑒定；

中圖分類號：S642.3 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2024）01-064-12

Isolation and identification of Fusarium wilt pathogen from wax gourd and identification of resistance of wax gourd germplasm

ZENG Lisha， CHEN Kangli， DU Caixian， LI Hongbo， MIAO Bingbing， MO Weiqin，Lü Shun

（Dongguan Agricultural Research Centre， Dongguan 523000， Guangdong ，China）

Abstract： Wax gourd is one of the major vegetable crops in Cucurbitaceae family， and the Fusarium wilt disease seriously threatens the safety of wax gourd production. The pathogenicity， morphological characteristics， and cultural characteristics of phytopathogen based on translation elongation factor （TEF-1a）through phylogenetic analysis were compared in this study， the Fusarium wilt pathogens of wax gourd collected from Guangdong， Guangxi and other regions were identified， and the pathogen causing Fusarium wilt of wax gourd was identified as Fusarium oxysporum f.sp. benincasae. On this basis， the strong pathogenic ability strains were selected as the inoculum， and using different wax gourd resources as materials， we analyzed the disease resistance of 26 small wax gourd resources， 47 chieh-qua resources， and 74 large wax gourd resources by seedling root-irrigation inoculation method. There were relatively significant differences in the disease resistance results of 147 wax gourd and chieh-qua resources， and there were significant differences in the incidence of Fusarium wilt among different wax gourd and chieh-qua resources. None of 26 small wax gourd resources had high resistance to Fusarium wilt; two（JG-25 and JG-33） of the 47 Chieh-qua resources showed high resistance， accounting for 4.26%; four（DDG-19， DDG-32， DDG-40， and DDG-74）of the 74 large wax gourd resources showed high resistance， accounting for 5.41%. This study provides reference for the selection of resistant germplasm resources of wax gourd and the genetic breeding of Fusarium wilt resistance in Cucurbitaceae crops.

Key words： Wax gourd; Chieh-qua; Fusarium wilt ; Pathogen; Disease resistance identification

冬瓜（Benincasa hispida Cogn．）屬葫蘆科冬瓜屬一年生蔓性草本植物，起源于中國和東印度，在我國已有2000多年的栽培歷史，主要分布于廣東、廣西、海南等地區[1-2]。冬瓜營養豐富，富含多種人體必需營養元素和各種維生素[3]，加之冬瓜具有易栽培、產量高、耐貯運等優點，已成為近年來各地助力產業振興的優選蔬菜種類[2]。然而，隨著冬瓜復種指數的提高、資源單一化和種植地區集中化，病害的發生日益突出，尤其是枯萎病，部分冬瓜產區的枯萎病發病率高達70%，嚴重的甚至絕收，給農戶帶來了巨大損失，枯萎病已成為冬瓜可持續健康發展的瓶頸[4]。

葫蘆科瓜類枯萎病尖孢鐮刀菌共存在8個?；蚚5]。尖孢鐮刀菌的鑒定主要包括形態學觀察、致病性檢測和分子生物學鑒定3種方法[6]。一般使用通用引物 ITS1 和 ITS4 擴增分離物鑒定DNA，將菌株 rDNA-ITS 序列在GenBank核酸數據庫中進行比對。目前，NCBI 數據庫中有大量的鐮刀菌 ITS序列，盡管rDNA-ITS序列在鐮刀菌屬不同種間的鑒別能力較強，但不能把菌株與種內的其他專化型菌株區分成不同類群。TEF-1α是目前尖孢鐮刀菌系統發育研究中應用最多的基因片段，O’Donnell等[7]采用TEF-1α和IGS兩個基因片段對來源于植物和人類的病原尖孢鐮孢菌（F. oxysporum）進行了系統分析，認為TEF-1α是適用于Fusarium群體遺傳多樣性分析的基因片段，但是目前我國還未見利用TEF-1α等基因片段對引起瓜類枯萎病的尖孢鐮刀菌進行鑒定或系統發育研究的報道。

針對冬瓜枯萎病的防治，目前有化學防治、選育抗病資源、嫁接換根、輪作等防治措施[8-9]，其中以化學防治為主。常見防治冬瓜枯萎病的藥劑有惡霉靈、精甲咯菌腈、多菌靈可濕性粉劑等藥劑[10-11]。但化學防治有一定弊端，可以殺死病菌，也會殺死土壤中大量的有益微生物，使土壤的自我修復能力降低，甚至喪失土壤修復能力。化學防治還具有使病菌產生抗藥性、蔬菜殘留農藥和污染土壤環境等副作用。因此，選育抗枯萎病冬瓜（節瓜）品種尤為重要。目前市場上的冬瓜（節瓜）資源大部分以中抗和中低抗枯萎病品種為主，高抗品種較少。康德賢等[4]采用自然病圃法對36份冬瓜種質資源進行抗枯萎病鑒定，結果表明，僅7份材料表現高抗，占總數的19.40%。梁少麗等[12]采用苗期接種鑒定法對東莞市16份冬瓜種質資源進行枯萎病抗性鑒定，結果表明，僅1份材料表現高抗，占總數的6.25%。彭家柱等[13]采用浸根法對20份節瓜資源（經多代自交、分離并最終穩定的自交系）進行枯萎病抗性鑒定，結果表明，無材料表現高抗[13]。謝大森等[14]采用人工接種法對84份冬瓜種質資源進行枯萎病抗性鑒定，結果表明，僅5份黑皮冬瓜材料表現高抗，占總數的5.9 %。

筆者從廣東、廣西等冬瓜主栽區采集罹患枯萎病的冬瓜病株，采用組織分離法，從發病植株莖基部上分離病原菌，從病菌的形態學特征、培養特性、TEF-1α序列及致病性等方面進行分析鑒定。然后采用苗期接種法對從華南地區收集的26份小冬瓜資源、47份節瓜資源和74份大冬瓜資源進行枯萎病抗性鑒定，篩選出高抗資源，以期為不同抗病性冬瓜資源的合理布局和冬瓜枯萎病的生物生態防治提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗于2020年春秋兩季在東莞市農業科學研究中心萬江基地實驗室對具有典型感病癥狀的材料進行病原物分離。供試病原菌包括采自廣東、廣西不同地區具有代表性的6個冬瓜枯萎病菌株，其來源及編號見表1。

用于致病力測定的冬瓜材料是XDG-7、 XDG-8，均為穩定的多代自交系，據多年田間觀測，田間表現為中低抗枯萎病。

待鑒定冬（節）瓜資源 ：在2021年，結合全國冬瓜產業大會，從廣東、廣西、福建及湖南等冬瓜主產區引進收集了26份小冬瓜、47份節瓜和74份大冬瓜資源，共計147份資源，大部分為雜交種F1代，少數為自交多代的穩定自交系。其中XDG1～26是小冬瓜，JG1～47是節瓜，DDG1～74是大冬瓜。本文中的冬瓜資源為2021年全國冬瓜產業大會中面向冬（節）瓜育種研究單位、品種推廣部門以及種業銷售公司征集的新優冬（節）瓜品種，由廣州種子商會征集并提供。

1.2 病原菌的分離、純化及形態鑒定

采用組織分離法，從發病植株莖基部上分離病原菌，用2%次氯酸鈉消毒60 s，75%乙醇消毒3 次，隨后用無菌水洗滌，再用滅菌過的吸水紙吸干水分，置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基上28 ℃培養。待長出菌絲后，挑取部分菌絲接種在PDA平板上，經3次純化后，采用稀釋法進行單孢分離和培養，觀察其生長性狀，在顯微鏡條件下觀察氣生菌絲上小型分生孢子的著生狀態、大小、形狀，分生孢子座上的大孢子以及厚垣孢子的形態。據柯赫氏法則將菌株回接冬瓜幼苗上，接種18株，3次重復，無菌水為對照。對發病冬瓜幼苗進行病原物的再分離，與原接種菌株比較，進行柯赫氏法則驗證。

1.3 致病菌的TEF-1α序列分析

采用CATB法進行菌體基因組DNA的提取。用鐮刀菌（Fusarium）種類鑒定通用引物翻譯延伸因子（TEF-1α）擴增病原菌基因組總DNA。引物序列為EF1H（ATGGGTAAGGAAGACAAGAC）和EF2T（GGAAGTACCAGTGATCATGTT）。使用 MEGA version 7.0構建系統發育樹，進化距離分析采用鄰位相連法（neighbor-joining，NJ），用 Bootstrap 1000次重復進行系統樹的檢驗。將菌株TEF-1α序列在 GenBank 核酸數據庫（ http： / / www. ncbi. nlm. nih. gov / BLAST）及Fusarium MLST database（https：//fusarium.mycobank.org/）中進行 BLASTN 比對和同源性分析。

1.4 育苗

冬（節）瓜種子播種前用溫湯浸種6 h，然后置于28 ℃條件下催芽，2～3 d 后播于滅過菌的穴盤中。待幼苗長出真葉后，用于苗期人工接種。

1.5 冬瓜枯萎病菌孢子懸浮液的制備

選取致病力強且生長旺盛的冬瓜枯萎病菌絲接種于液體培養基中，于28 ℃條件下震蕩培養3～5 d。將培養液用雙層紗布過濾去掉菌絲，濾液離心后，去除上清液。用血球計數器計算病菌孢子的濃度，小孢子接種濃度為1×106 個·mL-1。

1.6 苗期人工接種枯萎病鑒定與病情分級標準

選取長勢健壯、大小基本一致、株高為10～15 cm的冬（節）瓜實生苗用栽培基質種植于盆缽中，7 d 后用1×106 個·mL-1的冬瓜枯萎病菌孢子懸浮液傷根澆灌接種（澆灌前在距根際1 cm 的4個方向各切一刀），每株澆灌10 mL，以清水處理為對照，每個處理組分別接種30株瓜苗[15-16]。接種溫度22～25 ℃，用無色塑料膜保濕24 h，保濕后的植株置于白天25 ℃左右、夜晚18 ℃左右的溫室內正常管理。接種7 d后開始調查發病情況，統計并記錄147份冬（節）瓜資源枯萎病發病率，采用SPSS 23.0進行統計和差異顯著性分析。

參照康德賢等[4]的方法進行抗性分級，將冬瓜資源對枯萎病的抗性分為4個等級：高抗（HR），枯萎病發病率低于20%；中抗（MR），枯萎病發病率21%～50%；輕抗（LR），枯萎病發病率51%～80%；感?。⊿），枯萎病發病率81%～100%。采用SPSS 23.0對數據進行統計和差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 冬瓜枯萎病菌的分離與純化

將分離純化后的菌株接種于PDA平板內，28 ℃培養3 d 后，肉眼觀察菌落形態，發現其菌絲致密絮狀，白色至淡紫色。顯微鏡下觀測其小型分生孢子呈長橢圓形、紡錘形、直或略彎曲成腎形等，假頭生，大型分生孢子呈鐮刀形，多為3～5分隔。厚垣孢子較易形成，數量多，球形或亞球形。以上形態學特征符合尖孢鐮孢菌（F. oxysporum）的形態描述（圖1）。

2.2 分離的枯萎病菌致病性鑒定

將分離得到的尖孢鐮刀菌孢子懸浮液接種于冬瓜幼苗上，結果表明，該菌株對冬瓜具有強致病性。冬瓜幼苗于接種7 d時，開始出現輕微萎蔫癥狀；接種10 d 左右，植株大部分葉片出現萎蔫癥狀；接種20 d 后，植株表現為黃葉、萎蔫甚至死亡癥狀；病害后期常能看到藤蔓中下部至莖基部出現紅褐色縱裂條紋，在潮濕條件下表皮腐爛，剖開病株可發現其維管束變成褐色；但清水處理（CK）的植株正常生長，無萎蔫癥狀（圖 2）。重新分離接種的病原菌再回接到健康的冬瓜植株上，均獲得與接種時相同的病原物；清水對照（CK）未分離到病原物。

2.3 TEF-1α序列測定

從 GenBank 數據庫中下載27株鐮刀菌菌株的TEF-1α序列，與供試菌株的TEF-1α序列采用MEGA 7.0 軟件進行一致性比對，構建系統發育樹。從圖3可以看出，6個冬瓜枯萎病菌株NLDG-10-1、NLDG-10-4、NLDG-5-3、YLDG-1-2、YLDG-2-6和DGDG-1-4與尖孢鐮刀菌不同專化型聚在一起（支持率為 99%），且與引起葫蘆科瓜類枯萎病的尖孢鐮刀菌西瓜專化型 F. oxyspoorum f. sp. niveum、尖孢鐮刀菌黃瓜?；?F. oxyspoorum f. sp. cucumerinum、尖孢鐮刀菌甜瓜?；?F. oxyspoorum f. sp. melonis和尖孢鐮刀菌瓜類專化型 F. oxyspoorum f. sp. cucurbitacearum親緣關系最近，進一步支持了分離致病菌為尖孢鐮刀菌冬瓜專化型（Fusarium oxysporum f. sp. benincasae）。

從聚類分析結果可以看出，TEF-1α序列在鐮刀菌屬不同種間的鑒別能力較強，且能把冬瓜枯萎病菌株與尖孢鐮孢菌（Fusarium oxysporum species complex，FOSC）種內的其他?；途陞^分成不同類群，能較好地反映FOSC內菌株間的親緣關系。

2.4 26份小冬瓜資源枯萎病發病率和抗性鑒定結果分析

如表2所示，26份小冬瓜資源有3種類型，其中黑皮小冬瓜10份，占比38.46%；粉皮小冬瓜8份，占比30.77%；青皮小冬瓜8份，占比30.77%。經分析，26份小冬瓜資源的抗性鑒定結果差異相對較大，且不同小冬瓜資源間的枯萎病發病率存在顯著差異。26份小冬瓜資源枯萎病平均發病率為70.48%，其中XDG-17粉皮小冬瓜枯萎病發病率最高，達100.00%，XDG-13粉皮小冬瓜枯萎病發病率最低，為30.00%。26份小冬瓜資源中沒有1份小冬瓜的抗性鑒定結果為高抗；4份小冬瓜資源（XDG-4、XDG-6、XDG-8和XDG-13）的抗性鑒定結果為中抗，占比15.39%；17份小冬瓜資源的抗性鑒定結果為輕抗，占比65.38%；剩余5份小冬瓜資源的抗性鑒定結果為感病，占比19.23%。

2.5 47份節瓜資源枯萎病發病率和抗性鑒定結果分析

47份節瓜資源的抗性鑒定結果如表3所示，差異相對較大，且不同節瓜資源間的枯萎病發病率存在顯著差異。47份節瓜資源枯萎病平均發病率為51.68%，其中JG-36節瓜枯萎病發病率最高，達90.00%，JG-33節瓜枯萎病發病率最低，達10.90%。47份節瓜資源中有2份節瓜（JG-25和JG-33）資源的抗性鑒定結果為高抗，占比4.26%；20份節瓜資源的抗性鑒定結果為中抗，占比42.55%；21份節瓜資源的抗性鑒定結果為輕抗，占比44.68%；剩余4份節瓜資源的抗性鑒定結果為感病，占比8.51%。

2.6 74份大冬瓜資源枯萎病發病率和抗性鑒定結果分析

如表4所示，74份大冬瓜資源有2種類型，其中黑皮大冬瓜67份，占比90.54%；粉皮大冬瓜7份，占比9.46%。經分析，74份大冬瓜資源的抗性鑒定結果差異相對較大，且不同大冬瓜資源間的枯萎病發病率存在顯著差異。74份大冬瓜資源枯萎病平均發病率為52.24%，其中DDG-23黑皮大冬瓜枯萎病發病率最高，高達96.97%，DDG-19黑皮大冬瓜枯萎病發病率最低，達5.90%。74份大冬瓜資源中有4份大冬瓜資源（DDG-19、DDG-32、DDG-40和DDG-74）的抗性鑒定結果為高抗，占比5.41%；31份大冬瓜資源的抗性鑒定結果為中抗，占比41.89%；32份大冬瓜資源的抗性鑒定結果為輕抗，占比43.24%；剩余7份大冬瓜資源的抗性鑒定結果為感病，占比9.46%。

3 討論與結論

冬瓜枯萎病是一種土傳真菌性、由土壤傳播、從植株根或根莖部侵入、在維管束內寄生的系統性病害，致病菌為尖孢鐮刀菌冬瓜?；停‵usarium oxysporum f. sp. benincasae）[17]。20世紀90年代，Gertagh 等[18]首次報道了尖孢鐮刀菌冬瓜?；偷拇嬖凇?994年，中國學者謝雙大等[19]報道了尖孢鐮刀菌冬瓜?；偷拇嬖?，表明該病原菌致病專化性較強，僅侵染瓜類作物，引致冬瓜和節瓜嚴重枯萎，且致病性與黃瓜、西瓜、絲瓜、苦瓜等專化型有明顯差異，尖孢鐮刀菌冬瓜?；褪菍е露峡菸“l生的真菌?；汀?/p>

據文獻報道，瓜類枯萎病菌至少存在8個專化型，即尖孢鐮刀菌西瓜?；?F. oxyspoorum f. sp. niveum、尖孢鐮刀菌黃瓜專化型 F. oxyspoorum f. sp. cucumerinum、尖孢鐮刀菌甜瓜?；?F. oxyspoorum f. sp. melonis、尖孢鐮刀菌葫蘆專化型 F. oxyspoorum f. sp. lagenariae、尖孢鐮刀菌冬瓜專化型 F. oxysporum f. sp. benincasae、尖孢鐮刀菌苦瓜?；?F. oxyspoorum f. sp. momodicase、尖孢鐮刀菌絲瓜?；?F. oxyspoorum f. sp. luffae 和尖孢鐮刀菌瓜類?；?F. oxyspoorum f. sp. cucurbitacearum，各?；蛯项愖魑锏闹虏⌒源嬖诿黠@差異[5]。目前對我國瓜類枯萎病的病原種群多樣性及致病力分化情況還沒系統研究，筆者從病原菌的形態學特征、培養特性、TEF-1α序列及致病性等方面對引起廣東、廣西、湖南冬瓜主栽區枯萎病的病原菌進行鑒定，結果表明，致病菌的形態學特征符合尖孢鐮孢菌（F. oxysporum）的形態描述，引起冬瓜和節瓜嚴重枯萎，且TEF-1α序列分析結果顯示致病菌與尖孢鐮刀菌冬瓜?；偷挠H緣關系最近。因此，將引起廣東、廣西、湖南冬瓜主栽區枯萎病的病原菌鑒定為尖孢鐮刀菌冬瓜?；?。

TEF-1α是適用于Fusarium群體遺傳多樣性分析的基因片段，本文中基于TEF-1α序列的系統發育分析，表明冬瓜枯萎病菌株與尖孢鐮刀菌不同?；途墼谝黄穑遗c引起葫蘆科瓜類枯萎病的尖孢鐮刀菌西瓜?；?F. oxyspoorum f. sp. niveum、尖孢鐮刀菌黃瓜?；?F. oxyspoorum f. sp. cucumerinum、尖孢鐮刀菌甜瓜專化型 F. oxyspoorum f. sp. melonis和尖孢鐮刀菌瓜類?；?F. oxyspoorum f. sp. cucurbitacearum親緣關系最近。此結果表明，TEF-1α序列在鐮刀菌屬不同種間的鑒別能力較強，且能把冬瓜枯萎病菌株與尖孢鐮孢菌（Fusarium oxysporum species complex，FOSC）種內的其他專化型菌株區分成不同類群，能較好地反映FOSC內菌株間的親緣關系。

冬瓜枯萎病病原菌隨病殘體在土壤或糞肥中越冬，借灌水、氣流、風雨等進行傳播蔓延，加上我國華南地區夏季高溫多雨等氣候條件，極易導致冬瓜枯萎病的暴發[20]。目前生產上針對冬瓜枯萎病以化學防治為主，但長期以來化學防治效果不理想，加上市面上很多針對冬瓜（節瓜）枯萎病的化學藥劑是以預防為主，因此選用抗病性較強的冬瓜品種是解決枯萎病問題最有效的途徑之一[21]。筆者采用苗期接種法對所收集的26份小冬瓜資源、47份節瓜資源和74份大冬瓜資源進行抗病性鑒定，結果表明，從47份節瓜資源中篩選出2份節瓜（JG-25和JG-33）為高抗資源，占比4.26%；從74份大冬瓜資源篩選出4份大冬瓜（DDG-19、DDG-32、DDG-40和DDG-74）為高抗資源，占比5.41%。26份小冬瓜資源、47份節瓜資源和74份大冬瓜資源的抗性結果表現呈正態分布，即高抗和感病資源較少，中抗和輕抗資源較多，與康德賢等[4]、梁少麗等[12]、彭家柱等[13]和謝大森等[14]的研究結果一致。筆者篩選出4份大冬瓜和2份節瓜資源可為利用不同抗枯萎病的冬瓜資源進行合理布局（搭配種植）提供參考。但是，筆者只是基于苗期接種法對部分冬瓜（節瓜）資源的抗病性進行初步鑒定，接下來還需開展更廣泛、更深入的田間抗病性評價試驗，進一步明確不同冬瓜（節瓜）資源的抗感病情況。

綜上所述，通過病原菌致病力測定、形態學特征分析、培養特性比較以及構建的TEF-1α系統發育樹分析，將引起冬瓜枯萎病的病原菌鑒定為尖孢鐮刀菌冬瓜?；汀９P者篩選出在苗期接種鑒定中表現為高抗的4份大冬瓜和2份節瓜資源，為利用不同抗枯萎病的冬瓜資源進行合理布局和抗枯萎病冬瓜種質資源的篩選及瓜類枯萎病抗性遺傳育種提供參考。

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