基于非靶向代謝組學的平菇子實體發育過程中菌絲體差異代謝物分析

劉芹 黃保 胡素娟 牛森園 吳杰 周奧碩 孔維麗

摘? ? 要：為了解平菇生長發育過程中子實體形成的代謝物基礎，采用超高效液相色譜-電噴霧串聯四級桿質譜（UPLC-ESI-MS/MS）技術結合多變量統計分析方法對發菌完成期（MM）、原基期（MP）及子實體分化期（MF）的平菇菌絲體進行代謝組學分析。結果表明，主成分（PCA）模型分析結果顯示3個時期平菇菌絲體中的代謝產物具有明顯差異。通過正交偏最小二乘判別分析（OPLS‐DA），以VIP（varible importance in the projection）>1和差異倍數值（fold change）≥ 2或 ≤ 0.5為條件對MM vs MP、MM vs MF和MP vs MF中的差異代謝物進行比較分析，分別獲得139個、147個和67個差異代謝物，變化倍數最大的物質包括氨基酸及其衍生物、脂質、生物堿、有機酸等，說明這些差異代謝物對平菇子實體發育具有重要影響。KEGG分析表明，苯丙氨酸代謝、色氨酸代謝、嘌呤代謝等20條代謝通路表現活躍。在子實體發育過程中，脂質、有機酸、核苷酸及其衍生物、氨基酸及其衍生物之間明顯相關。以上研究結果為平菇子實體發育機制和標準化栽培提供了理論依據。

關鍵詞：平菇；代謝組學；菌絲體；差異代謝物；子實體發育

中圖分類號：S646.1+4 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2024）01-045-11

Analysis of differential metabolites during fruiting body development of Pleurotus ostreatus based on untargeted metabolomics

LIU Qin1，HUANG Bao1，HU Sujuan1，NIU Senyuan2，WU Jie3，ZHOU Aoshuo4，KONG Weili1

（1. Key Laboratory of Evaluation and Utilization of Germplasm Resources of Edible Fungi in Huang-Huai-Hai Region， Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Institute of Edible Fungi， Henan Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou 450002， Henan， China; 2. College of Life Science and Technology， Henan Institute of Science and Technology， Xinxiang 453003， Henan， China; 3. College of Life Sciences， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， Henan， China; 4. Zhengzhou Financial School， Zhengzhou 450007， Henan， China）

Abstract： In order to understand the metabolite basis of fruiting body formation during the growth and development of Pleurotus ostreatus， ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry interfaced with electro-spray ionization （UPLC-ESI-MS/MS） combined with multivariate statistical methods was used to analyze the differences of intracellular metabolites in mycelia of P. ostreatus at the spawning completion stage， primordium stage and fruiting body differentiation stage. The results showed that principal component （PCA） model revealed significant differences （p<0.05） among metabolites in mycelia of P. ostreatus at the three periods. Through orthogonal partial least squares discriminant analysis （OPLS‐DA）， 139， 147 and 67 differential metabolites were screened and identified in MM vs MP， MM vs MF and MP vs MF under the conditions of VIP （varible importance in the projection） > 1 and fold change ≥ 2 or ≤ 0.5. Amino acids and derivatives， lipids， alkaloids and organic acids were substances with the maximum fold change values， which indicated that these differential metabolites played important roles in the fruiting body development. KEGG analysis showed that phenylalanine metabolism， tryptophan metabolism， purine metabolism and other metabolic pathways were active. During the growth and development of P. ostreatus， the contents of lipids， organic acids， nucleotides and their derivatives， and amino acids and their derivatives were significantly correlated. The results of this study provided theoretical basis for the mechanism of fruiting body development and standardized cultivation of P. ostreatus.

Key words： Pleurotus ostreatus; Metabonomics; Mycelia; Differential metabolites; Fruiting body development

食用菌因具有豐富的營養、獨特的風味以及廣泛的生物學活性而被認定為“新一代食物”[1]。食用菌具有熱量低、膳食纖維和蛋白質含量高的優點，并且還含有各年齡段人群所需要的氨基酸、礦物質和維生素等，而這些通常是植物來源食品中所缺乏的[2]。此外，食用菌還具有調節免疫力、抗炎、抗腫瘤、抗病毒和抗氧化等功能[3]。因此，食用菌常被用作營養豐富的食品、補充劑、保健品以及醫藥制品等的原料[4]。中國是食用菌生產大國。目前，我國可栽培食用菌大約有967種，幾乎占世界可栽培食用菌種類的50%，其中已實現商業化栽培的有60多種[5]。2021年我國食用菌年產量達到4 133.94萬t，比2020年增長了1.79%，總產值達到3 475.63億元，比2020年增長0.29%[6]。食用菌已經是我國繼糧、菜、果、油之后的第五大農作物[5]。

食用菌子實體的形成與自身發育的分子機制密切相關，對食用菌的產量和品質有重要影響[7]。食用菌在生長發育過程中，菌絲通過分解培養料中的木質纖維素、蛋白質、多糖等高分子物質，產生大量的低分子代謝物以滿足子實體所需[8]。據報道，有10萬多種特有代謝物如多糖、黃酮、脂質、萜類、酚類等廣泛存在于各種食用菌菌絲體中，作為食用菌營養來源或生長發育調控物質[9]。研究表明，谷氨酸在亞洲蘭茂牛肝菌原基發育中起重要調控作用[10]。羊肚菌營養生長過程中，脂肪酰基類物質在羊肚菌菌絲體內的主要功能為能量貯存，胺類物質參與羊肚菌生長發育、子實體成熟，吡啶類物質可提高羊肚菌的抗病能力[9]。L-精氨酸可能參與牛樟芝的解毒、保肝作用[11]。因而，有必要對食用菌菌絲生長發育過程中的代謝產物進行深入研究。

平菇是我國第三大食用菌栽培種類，具有經濟價值高、栽培技術簡單、栽培原料來源廣泛的優點[12]。目前我國平菇栽培主要是以玉米芯、棉籽殼、秸稈等為主料制成的栽培袋對平菇生長進行營養供應[8]。栽培袋營養供應不足會導致平菇出菇率低、子實體發育受限；營養供應過剩可能會導致資源浪費或增加其他雜菌的污染概率。因此，明確平菇菌絲生長對養分的需求規律，了解各個代謝物在平菇生長發育中的作用，有助于精準化控制平菇所需栽培料，為找到平菇適宜栽培代料或混配配方提供理論依據。

代謝組學是對一個生物系統的所有代謝物進行定性和定量的全面分析，并能揭示生物系統的一門科學[9]。代謝組學的出現使人們更好地理解作物在受到刺激或生長發育過程中代謝過程的變化，通過標志性代謝的挖掘與驗證，可以從代謝物角度找到調節作物生長發育的重要調控劑[13-14]。因此，筆者通過非靶向代謝組學對發菌完成期、原基期及子實體分化期的平菇菌絲體進行代謝組學分析，以明確平菇生長發育過程中子實體形成的代謝物基礎，探索平菇子實體發育機制，為平菇栽培提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

豫黑平16（品種權號：CNA20191002079），保藏于河南省食用菌種質資源庫。

1.2 樣品收集

平菇栽培試驗于2022年2－5月在河南現代農業試驗示范基地進行。栽培配方為棉籽殼88%、10%麩皮、石灰2%。參考Du等[13]的方法，收集培養30 d（發菌完成期，MM）、40 d（原基期，MP）和42 d（子實體分化期，MF）的菌絲體（圖1），每9個栽培袋收集的樣品置于1個無菌離心管中，作為1個試驗重復，共設置3次重復。樣品用液氮速凍，-80 ℃保存備用。

1.3 樣品處理

將冷凍干燥的樣品置于2 mL研磨管中，加入2顆鋼珠，研磨機（MM-400，Retsch，德國）30 Hz研磨1.5 min。稱取100 mg凍干粉加入1.2 mL 70%甲醇（-20 ℃預冷，色譜級），渦旋振蕩，樣本置于4 ℃冰箱過夜。離心（4 ℃，12 000 r?min-1，10 min）收集上清液，經0.22 μm膜過濾后用于UPLC-ESI-MS/MS分析。

1.4 UPLC分析

采用裝備有電噴霧離子源3重4極桿線性離子阱（electrospray ionization-triple quadrupole-linear ion trap，ESI-Q TRAP）（Nexera X2，Shimazdu，日本）的超高效液相色譜-電噴霧離子源串聯質譜儀（ultra performance liquid chromatography‐electrospray ionization-mass spectrometry/mass spectrometry，UPLC-ESI-MS/MS）對樣品進行分析。色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18（1.8 μm，2.1 mm×100 mm）（安捷倫科技有限公司，美國），柱溫40 ℃，進樣量4 μL。流動相為0.1%甲酸的水（溶劑A）和乙腈（溶劑B）。流動相梯度：0～9.0 min，95%～5% A；9.0～10.1 min，5% A；10.1～11.1 min，5%～95% A；11.1～14.0 min，95% A，流速0.3 mL·min-1。

1.5 ESI-Q TRAP-MS/MS分析

AB4500 Q TRAP UPLC-MS/MS系統與ESI Turbo離子噴霧接口耦合，在負離子和正離子模式下由Analyst 1.6.3軟件（AB Sciex）控制。電噴霧離子源，渦輪噴霧溫度550 ℃，離子噴霧電壓為-4500 V（負離子模式）和5500 V（正離子模式）。離子源氣體I、II（GSI、GSII）和幕氣（curtain gas，CUR）的壓力分別為50、60和6.9 kPa（25 psi）；碰撞激活解離（collision-activated dissociation，CAD）設置為高。以氮氣為中間碰撞氣體，采用多重反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）進行3重4極掃描試驗。對單個多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）躍遷進行了進一步的聚類勢（declustering potential，DP）和碰撞能（collision energy，CE）優化。根據各時期代謝物的洗脫情況，檢測出一組特定的MRM離子對。

1.6 數據分析

基于MVDB（metware database）和代謝物信息公共數據庫，根據二級譜信息對代謝物進行定性，并利用3重4極桿質譜的MRM模式進行定量。得到的質譜數據采用Analyst 1.6.3軟件處理，色譜峰的積分和校正采用MultiaQuant軟件[15]。數據分析采用SPSS 22.0軟件，代謝物組間顯著性差異分析采用Student’s t-test方法。皮爾遜相關系數（Pearson’s correlation coefficient，PCC）作為生物學重復相關性的評估指標，利用R 3.1.2軟件的內置cor函數進行計算。采用R 3.1.2軟件進行無監督主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least squaresdiscriminant analysis，OPLS-DA）。分層聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）和PCC分析結果可視化均采用pheatmap包。根據OPLS-DA獲得的變量重要性投影（variable importance in projection，VIP）評分，將VIP≥1和差異倍數值≥2或≤0.5的代謝物定義為差異代謝物，同時將得到的相應差異代謝物提交到KEGG數據庫網站進行注釋，獲得代謝物參與的代謝途徑。差異代謝物相關性分析采用R 3.1.2軟件，可視化分析采用Gephi 0.9.2軟件。

2 結果與分析

2.1 數量質量評估

檢驗測序結果的可靠性以及樣本選擇的合理性主要通過樣品的重復相關性來判斷。樣品間的生物學重復采取相關性分析來評估，組內樣品相對組間樣品的相關系數越高，說明獲得的差異代謝物越可靠。在筆者的研究中，樣品間的生物學重復的相關性采用皮爾遜相關系數（Pearson’s correlation coefficient）r作為評估指標。由圖2可知，MM、MP和MF 3組樣品間的相關系數均接近1，說明3組樣品間的重復性好，可以用作后續分析。

由圖3可知，對獲得的代謝物進行聚類熱圖分析，根據平菇子實體發育過程中菌絲體中代謝物的差異，MM、MP和MF組樣本被明顯分為3類，但是MP和MF距離較近，說明兩者的代謝輪廓更為相似。

2.2 主成分分析和正交偏最小二乘法判別分析

采用無監督主成分分析（Principal component analysis，PCA）的方法來評估所有樣本之間的總體分布和整個分析過程的穩定性。由圖4可知，3組樣品被明顯區分開，PC1解釋了總變量的60.29%，PC2解釋了總變量的18.47%，PC3解釋了總變量的7.92%。這說明3組樣品間的代謝產物具有明顯的差異。所有質控（mix）樣品聚類在一起，具有良好的分析穩定性和試驗重現性。

進一步采用有監督的判別分析統計方法正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least squaresdiscriminant analysis，OPLS-DA）對數據進行分析，以更充分地提取3組樣品間的差異信息，篩選差異代謝物（圖5）。一般來說，R2Y和Q2越接近1，建立的模型穩定性和可信度越高。MM vs MP、MM vs MF、MP vs MF的R2Y均是1，Q2分別為0.98、0.97和0.95，均比較接近1，說明建立的OPLS?DA模型具有穩定性和可靠性，能夠反映樣本的真實情況。

2.3 差異代謝物篩選及分析

基于OPLS-DA結果，以變量重要性投影（variable importance in projection，VIP）≥ 1和差異倍數值（fold change）≥ 2或≤ 0.5相結合的方法來篩選差異代謝物。MM vs MP篩選出139個差異代謝物，其中上調40個，下調99個；MM vs MF篩選出差異代謝物147個，其中上調63個，下調84個；MP vs MF篩選出67個差異代謝物，其中上調48個，下調19個（圖6）。這說明由菌絲期到原基期，菌絲體中的大部分差異代謝物下調，而由原基期到子實體分化期，菌絲體中的大部分差異代謝物上調。差異代謝物類型主要包括：生物堿、核苷酸及其衍生物、有機酸、酚酸類、氨基酸及其衍生物、脂質以及其他類化合物。

根據代謝物的差異倍數大小取對數進行排序，選取上調和下調倍數最大的前10個差異代謝物進行分類與統計。由圖7所示，較為活躍的物質包括氨基酸及其衍生物、脂質、生物堿、有機酸等。MM vs MP中上調的物質包括3，4'-二羥基-3'-甲氧基苯戊酸（3，4'-dihydroxy-3'-methoxybenzenepentanoic acid）、鳥苷3'，5'-環單磷酸（guanosine 3'，5'-cyclic monophosphate）、N-γ-乙酰基-N-2-甲酰基-5-甲氧基犬尿氨酸（N-γ-acetyl-N-2-formyl-5-methoxykynurenamine）、丙酮酸（pyruvic acid）、延胡索酸（fumaric acid）等；下調的物質包括溶血磷脂酰膽堿18∶1（2n異構）[lysoPC 18∶1（2n isomer）]、溶血磷脂酰乙醇胺18∶3（lysoPE 18∶3）、溶血磷脂酰乙醇胺18∶2（lysoPE 18∶2）、溶血磷脂酰乙醇胺18∶2（2n異構）[lysoPE 18∶2（2n isomer）]、環（脯氨酸-脯氨酸）[cyclo（Pro-Pro）]等。大部分差異物質為脂質，主要集中在下調物質中，分為溶血磷脂酰膽堿和溶血磷脂酰乙醇胺兩種。MM vs MF中上調的物質包括鳥苷3'，5'-環單磷酸（guanosine 3'，5'-cyclic monophosphate）、3，4'-二羥基-3'-甲氧基苯戊酸（3，4'-dihydroxy-3'-methoxybenzenepentanoic acid）、D-阿拉伯糖醇（D-arabitol）、丙酮酸（pyruvic acid）、N-γ-乙酰基-N-2-甲酰基-5-甲基犬尿氨酸（N-γ-acetyl-N-2-formyl-5-methoxykynurenamine）等；下調的物質包括溶血磷脂酰膽堿18∶1（2n異構）[lysoPC 18∶1（2n isomer）]、溶血磷脂酰乙醇胺18∶3（lysoPE 18∶3）、溶血磷脂酰乙醇胺18∶2（lysoPE 18∶2）、溶血磷脂酰乙醇胺18∶2（2n異構）[lysoPE 18∶2（2n isomer）]、環（脯氨酸-脯氨酸）[cyclo（Pro-Pro）]。MP vs MF中上調的物質包括D-阿拉伯糖醇（D-arabitol）、D-（-）-蘇阿糖（D-（-）-threose）、E，E，Z-1，3，12-十九碳三烯-5，14-二醇（E，E，Z-1，3，12-nonadecatriene-5，14-diol）、N-乙酰-L-苯丙氨酸（N-acetyl-L-phenylalanine）、肉桂酰酪胺（cinnamoyltyramine）等；下調的物質包括L-谷氨酰胺（L-glutamine）、N-單甲基-L-精氨酸（N-monomethyl-L-arginine）、N'，N''，N'''-對香豆酰肉桂酰咖啡酰亞精胺（N'，N''，N'''-p-coumaroyl-cinnamoyl-caffeoyl spermidine）、2，4-二羥基喹啉（2，4-dihydroxyquinoline）、吡咯啉（pyrroline）等。主要分為脂質、氨基酸及其衍生物、生物堿等。說明這些差異代謝物可能與平菇子實體發育存在一定的相關性，這些差異代謝物參與到平菇子實體發育過程中，并在其中發揮重要的作用。

2.4 差異代謝通路分析

不同生物體中各種代謝產物在細胞內相互作用，并通過不同代謝途徑和通路進行表達（KEGG：kyoto encyclopedia of genes and genomes）。差異代謝物的通路富集分析有助于了解和分析代謝途徑的變化機制，通過KEGG Pathway數據（https：//www.kegg.jp/kegg/kegg2.html）注釋檢測代謝通路并進行通路富集分析。KEGG通路富集分析結果顯示，各組的差異代謝物主要分布在20條代謝途徑中（圖8）。MM vs MP中的明顯差異代謝通路有4條，為苯丙氨酸代謝（phenylalanine metabolism）、色氨酸代謝（tryptophan metabolism）、膦酸酯和次膦酸酯代謝（phosphonate and phosphinate metabolism）、單胺菌素生物合成（monobactam biosynthesis）。MM vs MF中的明顯差異代謝通路有6條，為硫胺素代謝（thiamine metabolism）、嘌呤代謝（purine metabolism）、碳代謝（carbon metabolism）、氨基酸生物合成（biosynthesis of amino acids）、維生素B6代謝（vitamin B6 metabolism）和糖酵解/糖異生（glycolysis / gluconeogenesis）。MP vs MF的明顯差異代謝通路僅有1條，為嘌呤代謝（purine metabolism）。

2.5 差異代謝物相關性分析

對平菇子實體發育過程中發生顯著相關（|r|＞0.8，p＜0.01）的代謝物間代謝網絡情況進行了分析。如圖9所示，共有214個代謝物間呈顯著相關，且主要呈正相關，占總相關性的81.78%。主要存在于脂質、有機酸、核苷酸及其衍生物以及氨基酸及其衍生物之間，如ASV_39胸腺嘧啶與ASV_132 S-烯丙基-L-半胱氨酸（r=1，p=0）、ASV_152 1-甲基黃嘌呤（r=0.98，p=6.43×10-6）、ASV_436溶血磷脂酰膽堿18∶1（2n異構）（r=0.98，p=6.43×10-6）；ASV_207 2，6-二氨基庚二酸與ASV_360 9，10，13-三羥基-11-十八碳烯酸（r=0.98，p=1.94×10-6）、ASV_379鳥苷3'，5'-環單磷酸（r=0.93、p=2.48×10-4）、ASV_56 L-鳥氨酸（r=0.98、p=4.27×10-6）；ASV_140 2，4-二氧四氫蝶啶與ASV_255 L-賴氨酸丁酸酯（r=1、p=0）、ASV_36 煙酸（r=0.95、p=8.76×10-5）；ASV_89 2-乙酰-2-羥基丁酸與ASV_52 3-脫氫-L-蘇糖酸（r=0.96、p=3.29×10-5）、ASV_238環（脯氨酸-亮氨酸）（r=0.95、p=6.58×10-5）、ASV_402 溶血磷脂酰乙醇胺16∶0（r=0.98、p=4.27×10-6）；ASV_390琥珀酰腺苷與ASV_201 L-甘氨酰-L-異亮氨酸（r=0.97、p=2.16×10-5）、ASV_415溶血磷脂酰乙醇胺18∶0（2n異構）（r=0.98、p=1.94×10-6）、ASV_403溶血磷脂酰乙醇胺16∶0（2n異構）（r=0.97、p=2.16×10-5）、ASV_256 L-丙氨酰-L-苯丙氨酸（r=0.98、p=1.94×10-6）。

3 討論與結論

筆者采用UPLC-ESI-MS/MS結合多元統計學分析方法對發菌完成期、原基期及子實體分化期的平菇菌絲體進行代謝組學分析。結果表明，平菇菌絲體中的大部分代謝物含量在原基期降低，子實體分化后明顯增加。其中，氨基酸及其衍生物、脂質、生物堿、有機酸等變化最為明顯。

氨基酸和有機酸類物質含量在原基期降低，子實體分化期升高。這一現象與真菌菌絲的生長規律一致。擔子菌如平菇、杏鮑菇、金針菇和香菇，可以通過酶降解培養料中的蛋白質或高分子物質，將其轉化為易于吸收利用的氨基酸等低分子物質，然后被真菌菌絲吸收，以促進生長和成熟，這一過程稱為營養吸收進程。在原基形成過程中，由于菌絲代謝的減慢，導致胞外酶水平降低，因此，降解產物的濃度也相應降低[13]。平菇子實體從分化期到完全成熟一般僅需7 d，在此過程中氨基酸參與子實體中新蛋白質合成或為呼吸氧化提供碳架，菌絲體需要大量合成或分解蛋白質為氨基酸，滿足子實體快速生長所需，因而菌絲體中的氨基酸含量在子實體分化期呈上升趨勢[2，16]。磷脂是構成細胞生物膜的基本組成部分，是生物體代謝過程中所必需的營養成分[17]。在平菇菌絲體鑒定出磷脂主要是溶血磷脂酰乙醇胺和溶血磷脂酰膽堿。溶血磷脂是細胞膜中的一類脂質代謝中間產物，主要由磷脂分子被水解后生成，在真核細胞中，溶血磷脂是一種參與多種胞內生物信號調控的重要活性分子[18]。但是，溶血磷脂在食用菌中的生理學功能目前還未被清晰闡釋[19]。在平菇子實體發育過程中，菌絲體中的溶血磷脂含量在原基期主要呈下降趨勢，如原基期菌絲體中的LysoPC 17∶1、LysoPC 18∶3、LysoPE 18∶2、LysoPE 18∶3分別是發菌完成期菌絲體中的3.32×10-4倍、9.82×10-5倍、6.99×10-5倍和8.04×10-5倍；而在子實體分化期呈上升趨勢，如子實體期菌絲體中的LysoPC16∶1 （2n isomer）、LysoPC 16∶1、LysoPE 16∶1 （2n isomer）、LysoPE 15∶1 （2n isomer）、LysoPE 16∶1分別是原基期菌絲體中的14.51倍、14.44倍、8.78倍、8.54倍和8.52倍。這些明顯上調及下調的溶血磷脂可能對平菇子實體的發育起著一定的調控作用，值得今后進一步探究。糖類作為生物體重要的碳源物質為子實體發育提供條件[16]。在本研究中，子實體分化期時菌絲體中的阿拉伯糖醇Arabitol和蘇阿糖Threose含量明顯增加，是原基期菌絲體中的3 296.30倍和1 444.44倍，這些糖類可能作為供能物質或多糖合成原料促進子實體快速生長。

相關性分析表明，脂質、有機酸、核苷酸及其衍生物、氨基酸及其衍生物等相關代謝物之間在子實體發育過程中明顯呈正相關，暗示這些代謝物可能共同參與子實體的發育過程。氨基酸代謝是子實體發育過程中必不可少的[20]，在本研究中，氨基酸與脂質、有機酸、核苷酸等化合物可能一起作用驅動細胞代謝進而促進子實體發育。但是，在平菇子實體發育過程中如何啟動氨基酸、脂質、有機酸、核苷酸等基礎代謝，有待于后續轉錄組學、基因組學等綜合分析，為解析子實體發育機制提供更多依據。

筆者利用非靶向代謝組學研究了平菇子實體發育過程中菌絲體中代謝物含量的差異，對不同發育階段菌絲體中的差異代謝物進行了篩選及代謝通路鑒別，可以為平菇子實體發育機制解析、優良品種選育和標準化栽培提供一定的理論依據，并可推動其他食用菌品種資源的開發利用。

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