小分子藥物篩選技術研究現狀及其應用進展

武瑞君,李瑋琦,楊陽,王晶,張鑫,方子寒,張小奕,蘇月

(中國生物技術發展中心,北京 100039)

近年來,以抗體藥物為代表的生物大分子藥物研究熱度持續增高,但小分子藥物因具有分子量小、給藥途徑多、免疫原性低、可以穿透細胞膜、研發成本低、生產工藝成熟、易于儲存和運輸等優勢[1],依然是創新藥物研發的主戰場。先導化合物的發現與優化在小分子藥物研發過程中處于至關重要的環節,高質量的活性先導化合物能夠大大縮短藥物研發周期、節約成本、提高研發成功率[2]。隨著生命組學、系統生物學、結構生物學等新興學科以及高性能計算、大數據分析、人工智能等信息技術深度融入藥物研發,小分子藥物篩選新技術伴隨著藥物的發現正在不斷更新和拓展,在基于已知活性化合物(Known)的藥物發現和高通量篩選(high-throughput screening,HTS)[2]等傳統篩選技術的基礎上,基于結構的藥物發現(structure-based drug discovery,SBDD)、基于片段的藥物發現(fragment-based drug discovery,FBDD)、DNA編碼化合物庫(DNA encoded compound library,DEL)、蛋白降解靶向聯合體(proteolysis targeting chimeras,PROTAC)等藥物篩選新技術應運而生[3-7]。筆者在本文將介紹目前小分子藥物篩選技術整體現狀,系統綜述HTS、SBDD、FBDD、DEL、PROTAC等技術平臺及其優劣勢,分析小分子藥物篩選新技術研發的重要性,為小分子藥物篩選新技術的未來發展提供參考。

1 小分子藥物篩選技術整體發展現狀

新藥研發具有周期長、投入大、風險高等特點。以小分子藥物為例,研發周期平均需要約10年,包括發現苗頭化合物(Hit)并經過層層結構優化得到先導化合物的藥物發現階段(2～4年)、針對候選化合物(candidate)的臨床前研究階段(1～3年)和臨床階段(3～7年)。其中,藥物發現階段是小分子藥物研發中最重要的基礎環節,且藥物篩選技術直接關系到先導化合物質量、研發效率、研發成本以及成藥可能性,是新藥研發持續進行的關鍵。1985年之前,先導化合物的發現主要是通過人工進行,每周處理的樣本數僅有數百個[8]。隨著分子生物學、結構生物學等現代科學的快速發展,小分子藥物發現進入基于靶點的藥物設計時代,傳統藥物篩選方法如基于Known的藥物發現由于效率低、較難研發出原創性成果、容易陷入專利陷阱等缺點,無法滿足新藥研發需求,藥物篩選新技術不斷更新迭代,HTS大大縮短先導化合物開發在藥物研發中的時間,SBDD、FBDD等也逐漸成為小分子藥物研發的常見手段[2-5]。通過對2022年至今在JournalofMedicinalChemistry期刊上發表的文章進行分析統計,結果發現基于HTS、SBDD、FBDD、DEL和PROTAC的應用占比分別約為17.4%、51.2%、19.5%、4%、6.3%,在一定程度上反映目前SBDD、FBDD等新策略在新藥研發領域發揮越來越重要的作用。

2 不同小分子藥物篩選技術的最新研究進展與應用

2.1HTS HTS技術出現于20世紀80年代末和90年代初,是指以分子水平和細胞水平的實驗方法為基礎,以微板形式作為實驗工具載體,以自動化操作系統執行試驗過程,以靈敏快速的檢測儀器采集實驗結果數據,運用計算機對實驗數據進行分析處理,并以相應的數據庫支持運轉的技術體系。該技術可在短時間內對數以千萬的樣品進行檢測,具有高度標準化、篩選速度快、靈敏度高、自動化程度高、特異性強、所需樣品量小等優點[9]。經過幾十年的發展,HTS已經發展成為目前主流的小分子藥物篩選方法之一,大量獲批藥物均由該技術篩選得到,例如治療糖尿病的二肽基肽酶4(dipeptidyl peptidase-4,DPP-4)抑制劑西格列汀(sigliptin)、治療乳腺癌的酪氨酸激酶抑制劑拉帕替尼(lapatinib)、治療胃腸道基質腫瘤和轉移性腎細胞癌的酪氨酸激酶抑制劑舒尼替尼(sunitinib)等[10]。但該技術仍具有篩選成本較高、耗時較長、分子多樣性受制于化合物篩選庫、較難對某些復雜靶點進行篩選等缺點。目前各研發團隊仍在積極創新HTS技術,并廣泛應用于創新藥物研發。

根據待測樣品的種類,HTS可分為分子水平篩選和細胞水平篩選兩大類。分子水平的篩選主要是檢測受體功能的改變、蛋白質結合的抑制以及受體-配體結合的結構、動力學和親和力等,常見的檢測方法有熒光法(熒光偏振、熒光共振能量轉移、酶聯免疫吸附等)和非熒光法[表面等離子體共振(surface plasmon resonance,SPR)、核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)、質譜分析(mass spectrum,MS)等]。中國醫學科學院醫藥生物技術研究所聯合皖南醫學院開發一種基于熒光偏振和生物素-親和素反應的新冠病毒主蛋白酶(Mpro)小分子抑制劑高通量篩選方法。研究團隊合成一種異硫氰酸熒光素和生物素雙標記的小分子肽(FITC-S-Biotin)作為熒光偏振示蹤劑和Mpro的水解底物,活性化合物可以通過抑制Mpro對FITC-S-Biotin的水解作用,改變熒光強度。研究團隊應用該模型從天然產物化合物庫中篩選到新冠病毒Mpro競爭性抑制劑二鵝掌菜酚(Dieckol),半數抑制濃度(IC50)為(4.5±0.4) μmol·L-1[11]。上?？萍即髮W研究團隊建立一種高通量、無標簽的親和質譜篩選技術,用于篩選靶向G蛋白偶聯受體(G protein-coupled receptors,GPCR)的小分子配體,通過對4 333個化合物進行篩選,發現了1個5-羥色胺(5-ydroxytryptamine,5-HT)受體拮抗劑和4個胰高血糖素樣肽-1受體(glucagon-like peptide-1 receptor,GLP-1R)陽性變構調節劑[12]。

細胞水平的篩選是在細胞個體水平完成的檢測,常見的檢測方法有離子通道檢測、報告基因檢測和細胞增殖檢測,分別用于原發性電障礙等離子通道類疾病、瑞特綜合征(rett syndrome,RTT)和阿爾茲海默病等腦部疾病、腫瘤和病毒感染等疾病的藥物篩選[13]。中國科學院上海藥物研究所研究人員利用表達鉀離子通道蛋白家族KCNQ2的倉鼠卵巢細胞(CHO),建立一種改進的HTS方法,通過鉈通量測定法從80 000個化合物中篩選出565個比陽性化合物活性更強的KCNQ2通道激動劑,然后使用384孔自動化膜片鉗和傳統膜片鉗,篩選得到ZG1732和ZG208,半數有效濃度(EC50)分別為(31.04±0.18),(1.37±0.06)μmol·L-1[14]。麻省理工學院懷特黑德生物醫學研究所研究人員使用CRISPR-Cas9基因編輯技術,將熒光素酶報告基因插入人胚胎干細胞內源性K+/Cl-共轉運蛋白2(KCC2)基因位點中,通過檢測熒光強度,從900個化合物中篩選得到14個KCC2表達增強化合物(KEECs),有望用于RTT的治療[15]。美國默克公司研究團隊以β干擾素(IFN-β)的分泌為表型,在單核細胞系THP-1中進行高通量篩選,發現口服非核苷酸干擾素基因刺激因子(stimulator of interferon genes,STING)激動劑MSA-2,能夠以二聚體形式結合并激活STING,靶向腫瘤組織發揮持久高效的抗腫瘤免疫活性[16]。

2.2SBDD SBDD技術起源于20世紀末,是指從配體和靶點的三維結構出發,以分子識別為基礎而進行的藥物設計方法,主要目的是預測與靶點結合位點產生最佳相互作用的化合物,可分為基于受體結構的藥物設計和基于配體結構的藥物設計兩大類。其中,基于受體結構的藥物設計是根據受體大分子的三維結構,通過計算機輔助藥物設計(computer aided drug design,CADD)等方法,確定小分子與受體的結合構象,評價結合活性,篩選出有潛力的配體小分子;基于配體結構的藥物設計是依據現有藥物的結構、理化性質與活性關系的分析,建立定量構效關系或藥效基團模型,設計新的化合物或具有新骨架的活性分子[17]。1995年,基于該策略有2個藥物首次獲得美國食品藥品管理局(FDA)批準,分別為用于降低開角型青光眼和高眼壓癥眼壓增高的碳酸酐酶抑制劑多佐胺、治療艾滋病的人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)蛋白酶抑制劑沙奎那韋[18]。在CADD等技術的輔助下,SBDD顯著提高了藥物篩選命中率,具有開發成本較低、可從少量化合物篩選獲得先導化合物、可直接預測受體和配體結合能力等優點。截至目前,FDA批準的藥物大多基于該技術演化而來。但該技術需要受體完整的三維立體結構,且僅考慮受體和配體的結合強度而不能預測藥效。

隨著結構生物學、人工智能與深度學習等不斷突破,SBDD也在快速發展。麻省理工學院研發團隊使用含有2 335個已知抗菌活性的分子集合訓練深度神經網絡,該算法無需對藥物進行標記,就可以分析化合物的分子結構并篩選潛在的抗生素。研究人員利用該算法篩選出的抗生素Halicin,與傳統抗生素結構不同,顯示出對包括結核分枝桿菌和碳青霉烯類耐藥腸桿菌科在內的廣泛病原菌系統發育譜的殺菌活性,并能有效治療小鼠模型中難辨梭狀芽孢桿菌和泛耐藥鮑曼不動桿菌感染。Halicin是首次在沒有任何人為假設的前提下,從零開始發現的全新抗生素[19]。印度TCS公司研發團隊利用深度學習開發一種由圖注意力網絡和遞歸神經網絡組合形成的條件生成模型,該模型利用圖注意力網絡學習活性位點的殘基結構和相互作用,在藥物靶向親和力預測模型的指導下產生特定于靶向活性位點的小分子。研究人員在Janus激酶2(JAK2)和多巴胺受體D2(DRD2)上驗證該方法,生成類似已知蛋白抑制劑的分子[20]。

2.3FBDD 1981年JENCKS等[21]提出FBDD技術的概念和理論框架,認為某個類藥性分子可以視為兩個或多個具有生物活性小分子碎片的疊加。FBDD是利用NMR、SPR、X-射線單晶衍射(X-ray)以及TSAs等方法篩選出與靶蛋白具有相互作用的小分子弱活性片段,然后基于其結構信息對活性片段進行優化,得到具有更高活性的先導化合物的方法。該技術主要包括片段庫的構建、活性小片段的篩選、片段的結構優化等步驟。其中,在構建片段庫階段,ERLANSON等[22]在先導化合物設計類藥“五原則”的基礎上,提出構建片段庫的“三法則”,即片段的分子量<300,脂水分配系數<3,氫鍵供體與受體的數量分別<3。除此之外,片段庫的大小需要根據所選擇的篩選方法進行考慮,例如采用NMR或X-ray時,片段庫的大小通常為1×102～1×103;采用SPR時,因其具有高通量的特點,片段庫大小可以達到1×105。片段的篩選是FBDD技術的核心,由于片段與靶點的結合作用較弱,因此需要高靈敏度和高穩定性的篩選方法檢測,以滿足所需的靈敏度和穩定性。隨著技術的發展,微量熱泳動、熱遷移分析(TSAs)、弱親和色譜等檢測手段對NMR、SPR、X-ray等經典方法進行補充。通常經過篩選得到的初始片段活性很低,所以篩選后的關鍵是通過片段自組、片段連接或片段生長對片段進行結構優化,改善片段對靶標的選擇性、生物利用度、生物轉化等性質,使之成為候選藥物,這也是FBDD技術最具挑戰的環節[22]。

與HTS比較,FBDD有以下優點,一是收集、維護和篩選片段庫比化合物庫更加容易,且篩選包含幾千個片段的片段庫就可以達到篩選化合物庫的效果,研發周期更短;二是具有更高的篩選命中率,可以實現對復雜靶標尤其涉及蛋白-蛋白相互作用靶點的處理;三是片段的尺寸小、溶解度高,通常具有更好的藥物屬性,后期易于結構優化,有潛力成為活性高、選擇性高的藥物分子。截至目前,共有4個獲批上市的藥物利用FBDD技術篩選得到,分別為治療黑色素瘤的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶B-raf(BRAF)抑制劑維莫非尼(vemurafenib)、治療慢性淋巴細胞白血病的B細胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)抑制劑維奈克拉(venetoclax)、治療尿路上皮癌的成纖維細胞生長因子受體(fibroblast growth factor receptor,FGFR)抑制劑厄達替尼(erdafitinib)、治療腱鞘巨細胞瘤的集落刺激因子1/干細胞因子受體(CSF1R/cKit)抑制劑Pexidartinib,其中維莫非尼從片段篩選到獲批上市僅用6年時間[23-24]。該技術同樣具有一定的局限性,如技術門檻要求較高,需要有較好的片段儲備,且很大程度依賴于靶蛋白的三維結構信息,對純化蛋白的需求量較大,片段經過結構優化后得到的先導化合物可能與片段分子結合位點不同,對篩選所需檢測手段的靈敏度要求較高。

各研發團隊仍在積極開展相關研究工作。上海科技大學和復旦大學研究人員構建一種基于親和質譜的FBDD篩選技術,與基于SPR或NMR的FBDD比較,該技術通過使用親和質譜富集特定結合物,可減少2～4倍目標蛋白質和片段庫化合物的使用量,分析速度可以提高2～3倍。研究人員利用該技術成功篩選到一種潛在的GPCR負變構調節劑Fg754,Fg754能夠與鈉離子變構位點特異性結合,且結合模式不同于已知的負變構調節劑[25]。印度昌迪加爾醫學教育研究所研究人員以新冠病毒Mpro為靶點,利用FBDD技術對一個含有約20萬化合物片段的片段庫進行篩選,并將任何與相鄰子口袋具有高親和力的片段進行連接,最終得到17個與Mpro關鍵結合位點具有較高結合活性的分子,為新冠病毒候選藥物研發提供更多選擇[26]。

2.4DEL DEL技術是一項基于組合化學和DNA技術的藥物篩選方法,于1992年由美國Sydney Brenner和Richard Lerner提出,主要包括DNA編碼化合物庫的構建、DEL篩選以及先導化合物的產生等步驟[27]。該技術首先將每個化合物與一段特定的DNA分子序列進行連接,進行DNA編碼,用作可擴增的識別條形碼,構建經DNA編碼的化合物庫;然后將活性靶蛋白和經DNA編碼的化合物庫進行親和篩選,洗脫除去與靶蛋白親和力弱或不結合的化合物,得到親和力強的化合物集合;由于化合物與DNA編碼信息一一對應,篩選完成后利用高通量測序對篩選出化合物連接的DNA序列進行識別,確定編碼對應的化合物分子;最后重新合成不帶DNA標簽的化合物進行活性驗證及結構優化,得到先導化合物[28]。

DEL技術使用DNA標簽作為條形碼,可構建和篩選規模達幾百萬至數十億種化合物的化學文庫,具有庫容量巨大、分子多樣性好、對靶標蛋白需求量少等優點,DEL技術并非傳統的一對一篩選,是將靶蛋白和整個編碼化合物庫同時孵育,具有顯著的時間和成本優勢,篩選周期為3～6個月,每個化合物篩選成本平均0.002美元。但DEL技術要求較高,暫無利用該技術獲批上市的藥物,且大體積的DNA編碼標簽以及組合化學在一定程度上增加篩選的復雜性和不確定性,需要進一步開發和優化與DNA相容的化學反應以保持化合物的類藥性和庫的純度。此外,該技術的篩選對象主要針對純化的生物靶點,對于難以表達的靶點或者活細胞體系等功能性靶點篩選較為困難[28-29]。

目前,DEL技術已被國內外制藥公司廣泛應用,成為篩選先導化合物的重要手段,國內外DEL技術較為成熟的公司有4家,分別為英國葛蘭素史克公司(GSK)、美國X-Chem公司、成都先導公司和丹麥Nuevolution公司。其中,GSK是對DEL技術應用最為成熟的企業,DEL庫達幾十億量級,分子庫篩選的靶點種類繁多,幾乎涵蓋所有疾病類型,但其DEL庫的化學結構類型只有一種,為三嗪類雜環化合物,其技術僅供自用。GSK已有3個在研藥物處于Ⅱ期臨床試驗階段,分別為用于治療糖尿病或心腦血管疾病等的可溶性環氧化物水解酶抑制劑GSK2256294、用于治療銀屑病或類風濕關節炎以及潰瘍性結腸炎的ATP競爭型受體相互作用蛋白1(RIP1)抑制劑GSK2982772、用于治療胰腺癌的RIP1抑制劑GSK3145095,其中GSK2256294是第一個由DEL技術發現并進入臨床試驗的小分子化合物[30]。成都先導公司是國內首個開展DEL研究的制藥公司,目前已建立一個基于DEL的早期藥物開發平臺,該DEL庫分子數量已超過1.2萬億,合成分子骨架的種類超過6 000種,已有3個在研藥物進入臨床試驗階段,分別為用于治療骨髓瘤或實體瘤的組蛋白去乙?；?HDAC)抑制劑HG146、用于治療晚期實體瘤的STING激動劑HG381、用于治療具有神經營養受體酪氨酸激酶(NTRK)或C-ROS原癌基因1酪氨酸激酶(ROS1)基因融合的原肌球蛋白受體激酶(TRK)抑制劑HG030。美國貝勒醫學院和德克薩斯兒童醫院研究人員致力于篩選人類蛋白溴域和末端外亞群(BET)中第一個溴域(BD1)的特異性抑制劑,BD1是癌癥等疾病的潛在靶標。該團隊利用DEL技術,在一個試管中同時對40億個DNA編碼分子進行篩選,得到對BD1具有高度選擇性的化合物CDD-724,該化合物抑制BD1的能力約是抑制其他人類溴化結構域的2 000倍[31]。

2.5PROTAC PROTAC是將靶向蛋白募集到E3泛素連接酶進行泛素化標記,然后通過泛素-蛋白酶體系統(UPS)將其降解的新型藥物分子體系的方法。UPS是細胞內蛋白質降解的主要途徑,參與細胞內80%以上蛋白質的降解。該系統由泛素(Ub)、3種泛素化酶(泛素活化酶E1,泛素結合酶E2s,泛素連接酶E3s)、蛋白酶體及其底物蛋白質等構成,在ATP供能的情況下,蛋白通過一系列酶的作用,被標記上多泛素化并轉移到蛋白酶體內進行降解。PROTAC就是利用UPS原理設計的一種雙功能小分子,由3部分構成,中間的連接體(Linker)一端連接可靶向目標蛋白的配體,另一端連接E3泛素連接酶配體分子,利用UPS識別、結合并降解疾病相關的靶蛋白[32]。該技術是一種全新藥物設計策略,理論上可以將任何過表達和突變的致病蛋白清除,達到治療疾病的目的[33]。PROTAC的發展經歷了第1代基于多肽片段的設計,到2008年開始的第2代小分子PROTAC設計,降解的靶蛋白包括甲硫氨酰氨肽酶2、雄激素受體、細胞視黃酸結合蛋白、雌激素受體、Tau微管相關蛋白、激酶類等,涉及的疾病包括癌癥、類風濕疾病、神經退行性疾病等[32]。

基于作用機制,PROTAC主要有以下優點:一是PROTAC分子不直接抑制靶蛋白的功能活性,不需要與靶蛋白發生長時間和高強度的結合,可以靶向轉錄因子、支架蛋白和非酶蛋白等對于傳統小分子藥物“無成藥性”的蛋白;二是相比于傳統小分子藥物的“占位驅動”模型,PROTAC分子屬于“事件驅動”,只需要瞬態結合就可以直接催化降解靶蛋白,因此使用催化劑量即可發揮藥物療效,耐藥性更低;三是由于靶蛋白與E3泛素連接酶之間的協同作用,PROTAC分子具有更高的選擇性。盡管PROTAC技術從肽到全小分子有了顯著的提升,但是與傳統的小分子藥物相比,PROTAC分子作為三元復合物,分子量較大,提高水溶性、穩定性、口服生物利用度、血管穿透能力等需進一步研究。此外,由于泛素化標記不僅涉及到蛋白質的降解,還關系到甲基化、乙?；?、磷酸化等過程以及DNA,其脫靶毒性仍是目前面臨的難題[6,32]。

PROTAC作為一種新興的小分子藥物研究領域,吸引了眾多制藥企業和學術機構開展研究。創立于2013年的美國Arvinas公司是該領域的領頭羊,研發管線主要包括抗腫瘤藥物和神經疾病藥物,目前共有Bavdegalutamide(ARV-110)、ARV-471、ARV-766三款候選藥物處于臨床階段。其中,Bavdegalutamide選擇性靶向降解雄激素受體(androgen receptor,AR),主要用于治療轉移性趨勢抵抗性前列腺癌(mCRPC),是全球首個進入臨床試驗的口服PRAOTC小分子藥物,目前處于Ⅱ期臨床試驗階段。2022年2月,Arvinas公布的Ⅱ期臨床試驗結果顯示,Bavdegalutamide展現出持續抗腫瘤活性和患者獲益證據,在攜帶AR T878X/H875Y突變的腫瘤患者中,可以使46%患者的前列腺特異性抗原(prostatic specific antigen,PSA)水平降低≥50%。ARV-471靶向雌激素受體(estrogen receptor,ER),用于治療ER陽性/人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)陰性(ER+/HER2-)的乳腺癌,于2022年12月啟動Ⅲ期臨床試驗,是目前研究進展最快的PRAOTC分子。2022年11月,公布的Ⅱ期臨床試驗初步結果顯示,ARV-471具有良好的耐受性,顯示出38%的臨床獲益率(CBR:確認完全緩解率、確認部分緩解率或疾病穩定率>24周),對于ESR1突變患者,CBR為51.2%[34]。國內多家藥企也在積極開展相關研究,如海思科公司的HSK29116、開拓藥業的GT20029、百濟神州公司的BGB-16673等均處于Ⅰ期臨床試驗階段;珃諾生物公司的RNK05047處于Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗階段,于2022年8月在美國完成首例患者給藥。上述不同技術優劣勢比較見表1。

表1 不同小分子藥物篩選技術對比

3 展望

隨著生物技術的飛速發展,以重組蛋白質藥物、治療性抗體、基因治療、干細胞治療等為代表的生物技術藥物成為新藥研發的熱點,小分子藥物受到一定沖擊,小分子藥物分子類型和多樣性的增速降低。但是,小分子藥物作為最傳統的藥物形式,以其難以替代的優勢,仍是藥物研發領域的重要組成部分。通過對上述小分子藥物篩選技術的發展現狀分析可以發現,美國是該領域的領頭羊,我國雖然在相關領域取得了一定進展,但仍落后于美國。因此,一是要以全面提升我國藥物研發創新能力為導向,持續加強基礎研究,積累原創性成果,提高源頭創新力。二是要以更好的解決小分子藥物研發過程中的共性問題為牽引,對于人工智能藥物設計技術、智能藥物制備技術、氘代藥物開發技術等能夠優化我國新藥創制體系的關鍵共性技術,加強集中攻關,促進我國制藥產業轉型升級。三是要以直擊現階段小分子藥物研發的痛點為目的,對于DEL、PROTAC、小分子輔助受體靶向技術等具有前瞻性、先導性和一定探索性的前沿引領技術,要提前優先布局,并不斷將變革性新技術應用于小分子藥物的研發,為生物醫藥產業發展注入新動力,為未來新藥創制領域技術更新換代和新興產業的發展奠定基礎。