超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定5種抗逆轉錄病毒藥物血藥濃度*

張曉穎,葉珍潔,吳靈潔,原津津,俞曉玲,4

(福建醫科大學孟超肝膽醫院 1.精準藥學實驗室;2.重點實驗室;3.感染科;4.藥學部,福州 350025)

據世界衛生組織(World Health Organization,WHO)估計,截至2022年底,全球現存活獲得性人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染/艾滋病患者3 900萬例,艾滋病相關死亡的人數達4 040萬例,有2 980萬例正在接受抗病毒治療(antiretroviral therapy,ART),ART全球覆蓋率達到76%[1],ART是國際上公認的防治艾滋病最有效的方法。目前,應用于臨床的抗逆轉錄病毒藥物分為6大類,①核苷類逆轉錄酶抑制劑:以拉米夫定(lamivudine,3TC)、替諾福韋(tenofovir,TDF)為代表;②非核苷類逆轉錄酶抑制劑:如奈韋拉平、依非韋倫(efavirenz,EFV)等;③蛋白酶抑制劑:如克力芝、利托那韋等;④融合抑制劑:艾博韋泰;⑤CC趨化因子受體5拮抗劑;⑥整合酶抑制劑:以多替拉韋(dolutegravir,DTG)、拉替拉韋(raltegravir,RAL)為代表[2]。其中多替拉韋、拉替拉韋、依非韋倫、拉米夫定和替諾福韋是治療HIV的一線藥物,國內外艾滋病診療指南均推薦拉米夫定+替諾福韋+多替拉韋/拉替拉韋/依非韋倫作為成人艾滋病初治患者的ART方案之一[3-4]。然而,大部分抗HIV藥物的血藥濃度具有顯著的個體間差異,往往因為療效不足或無法忍受的不良反應調整劑量甚至停藥。基因多態性、肝/腎功能不全、年齡、食物和藥物相互作用均會導致抗病毒藥血藥濃度范圍變異性大[5]。多替拉韋、拉替拉韋、依非韋倫、拉米夫定和替諾福韋的血漿谷濃度與療效、不良反應顯著相關,谷濃度過高易發生不良反應,濃度不足則易出現病毒學失敗或病毒耐藥變異[6]。故指南[3]和文獻[6]均明確指出需對抗HIV病毒藥物開展治療藥物監測(therapeutic drug monitoring,TDM),指導個體用藥劑量,從而達到增效減毒的目的。

在抗病毒藥的藥動學或TDM研究中,超高效液相色譜-串聯質譜(ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)法因其高效、高選擇性、高靈敏度、適用范圍廣等優點,越來越廣泛應用于體內生物樣品分析領域。此外,MS/MS能夠實現多個成分同時定性、定量分析,降低樣品用量與分析檢測時間,大大提升檢測效率,現已成為血藥濃度檢測的“金標準”。目前,國內外僅有一項研究采用LC-MS/MS法同時測定本研究的5種抗HIV病毒藥物及其他抗病毒藥[7],但該方法分析時間較長(>6 min),樣品制備過程耗時長(>10 min)。鑒于此,本研究旨在建立UPLC-MS/MS法同時測定多替拉韋、拉替拉韋、依非韋倫、替諾福韋和拉米夫定血藥濃度,并應用于臨床樣本檢測,為TDM提供技術依據。

1 材料與試藥

1.1儀器 LC-30A超高效液相色譜儀(日本Shimadzu公司);AB SCIEX TRIPLE QUAD TM 5500三重四級串聯質譜儀(美國AB SCIEX公司);IKA VIBRAX VXR BASIC圓周振蕩器(德國IKA公司);Eppendorf centrifuge 5810R高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司);KQ3200E超聲波清洗器(昆山市超聲儀器廠);MSE225S-CE電子分析天平(德國Sartorius公司,感量:0.01 mg)。

1.2藥品與試劑 多替拉韋對照品(含量:98%,批號:1-TIM-1-1)、拉替拉韋對照品(含量:96%,批號:27-MJC-148-1)、依非韋倫對照品(含量:97%,批號:7-ARD-114-5)、拉米夫定(含量:98%,批號:2-SEH-171-1)、替諾福韋(含量:96%,批號:1-JMO-90-1)均購自Toronto Reseach Chemicals Inc;同位素內標:多替拉韋-D5(含量:97.5%,批號:13576)、拉替拉韋-D4(含量:96.9%,批號:13765)、依非韋倫-D5(含量:94.6%,批號:13656)、拉米夫定-13C-15N2(含量:96.2%,批號:13575)、替諾福韋-D7(含量:99.8%,批號:13574)均購自于Quality Control Solutions Inc;甲酸(AR級,西隴科學股份有限公司);甲醇、乙腈(HPLC級,德國Merck KGaA);去離子水由我院血透室超純水凈化儀制。

2 方法與結果

2.1LC-MS/MS分析條件

2.1.1色譜條件 色譜柱Shim-pack XR-ODS Ⅲ(2.0 mm×50 mm,1.6 μm),預柱Shim-pack GIST-HP(G)C18(2.1 mm×10 mm,2 μm) ;流動相:A為0.1%甲酸,B為0.1%甲酸乙腈,梯度洗脫程序如下(0—0.5 min,5%B;0.5—1.0 min,5% → 90%B;1.0—4.0 min,90%B;4.0—4.01 min,90%→5%B;4.01—5.0 min,5%B);流速為0.3 mL·min-1,進樣量為2 μL,自動進樣器溫度為4 ℃,柱溫箱溫度為40 ℃。

2.1.2質譜條件 采用電噴霧離子源(electric spray ion source,ESI),正離子模式掃描,離子源電壓為5 500 V,離子源溫度為550 ℃,氣簾氣壓力、碰撞氣壓力、輔助氣1壓力和輔助氣2壓力分別設置為40、9、50、50。掃描方式為多反應監測模式(multiple reaction monitoring mode,MRM),5個分析物及內標的質譜參數見表1。

2.2對照品儲備液及工作液的配制 精密稱取2份多替拉韋、拉替拉韋、依非韋倫、拉米夫定、替諾福韋對照品適量,均加入50%甲醇溶解,轉移至10 mL棕色量瓶中,定容至刻度,并儲存于-30 ℃冰箱保存備用。多替拉韋的校準曲線和QC儲備液濃度分別為179.7、214 μg·mL-1、拉替拉韋儲備液濃度分別為375.6、151 μg·mL-1、依非韋倫儲備液濃度分別為252.6、114.7 μg·mL-1、拉米夫定儲備液濃度分別為256、343.7 μg·mL-1、替諾福韋儲備液濃度分別為125、117.3 μg·mL-1。

精密吸取各分析物的標準曲線儲備液適量,加入50%甲醇稀釋混合,制成系列濃度的標準曲線工作液(多替拉韋:0.625、1.25、2.5、5、10、15、20、30 μg·mL-1;拉替拉韋、拉米夫定、替諾福韋:0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、2.5、3.2、5 μg·mL-1;依非韋倫:1.25、2.5、5、10、20、30、40、60 μg·mL-1)。同時,精密吸取各分析物的QC儲備液適量,按照上述方法配制定量下限(lower limit of quantitation,LLOQ)、低(QL)、中(QM)、高(QH)四水平質控樣品工作液,多替拉韋質控質量濃度分別為0.625、1.5、6、24 μg·mL-1;拉替拉韋、拉米夫定、替諾福韋:0.1、0.25、1、4 μg·mL-1;依非韋倫:1.25、3、12、48 μg·mL-1。上述工作液均儲存于-30 ℃冰箱保存備用。

2.3內標儲備液及工作液的配制 取內標多替拉韋-D5、拉替拉韋-D4、依非韋倫-D5、拉米夫定-13C-15N2、替諾福韋-D7適量溶于10 mL棕色量瓶中,加50%甲醇溶解并定容,配制成質量濃度為均為100 μg·mL-1的內標儲備液。取上述5種內標儲備液適量,用50%甲醇繼續稀釋,配制成含多替拉韋-D5、拉替拉韋-D4、依非韋倫-D5、拉米夫定-13C-15N2、替諾福韋-D7的質量濃度分別為10、0.8、30、1.6、2.5 μg·mL-1的混合內標工作液。

2.4血漿樣品預處理 取待測血漿樣品100 μL(標準曲線工作液/質控工作液10 μL+空白血漿90 μL),加入內標工作液10 μL,先后加入純水100 μL和乙腈500 μL,渦旋振蕩1 min,4 ℃、12 000×g離心5 min后,取上清液300 μL,加入乙腈-水(50：50)300 μL稀釋,振動30 s,混勻后過孔徑0.45μm微孔濾膜,取2 μL進樣分析。

2.5方法學考察

2.5.1專屬性實驗 取6份不同來源的空白血漿,以等體積50%甲醇替代內標工作液,按“2.4節”下方法操作,得到空白血漿色譜圖;另取6份空白血漿制成含分析物的標準血漿溶液,按“2.4節”下方法操作,獲得含分析物與內標樣品的色譜圖。空白血漿中干擾組分的響應低于分析物定量下限響應的20%,并低于內標響應的5%[8-10]。結果見圖1所示,5個分析物及同位素內標的峰型良好,且空白血漿中干擾組分的響應遠低于分析物定量下限響應的20%、內標響應的5%,證實了所開發的方法對分析物和同位素內標具有選擇性和特異性。

圖1 空白血漿(A)、LLOQ樣品中分析物(B)和內標的色譜圖(C)

2.5.2標準曲線及LLOQ 取空白血漿90 μL置于1.5 mL EP 管中,加入系列含分析物的標準曲線工作液10 μL,配制成系列標準曲線樣品和質控樣品,按“2.4節”下方法操作。以分析物與內標峰面積比值(Y)為縱坐標,分析物濃度(X,ng·mL-1)為橫坐標,采用加權1/x2最小二乘法進行線性回歸分析,獲得各分析物的線性回歸方程。結果表明,DTG、EFV、RAL、3TC和TDF血藥濃度分別在62.5～3 000、125～6 000、10～500、10～500、10～500 ng·mL-1范圍內線性關系良好,相關系數(R2)在0.998～0.999。5個分析物的各濃度水平準確性均為89.8%～109.9%范圍內,各分析物LLOQ的S/N均>5,符合“生物樣品定量分析方法驗證指導原則”的要求[8],色譜圖見圖1。

2.5.3準確度與精密度 取空白血漿90 μL,加入質控工作液10 μL,配制 LLOQ、QL、QM、QH 4個濃度的質控樣品,每種濃度平行制備6份,按“2.4節”下方法操作,計算日內準確度和精密度,連續測定3 d,確定日間準確度和精密度(RSD)。各質控樣本(除LLOQ外)日內和日間的準確度、RSD一般應在標示值的±15%內,LLOQ的準確度、RSD應在標示值的±20%范圍內[8-10]。DTG、RAL、EFV、3TC和TDF的日內、日間準確度和精密度結果見表2,5個分析物各濃度水平的日內及日間精密度RSD值均<7%,日內和日間各濃度水平的準確度為94.0%～109.3%,符合“生物樣品定量分析方法驗證指導原則”的要求[8]。

表2 5個分析物在血漿中的日內、日間精密度和準確度

2.5.4提取回收率和基質效應試驗 按照“2.4節”下方法分別制備高、中、低濃度QC樣品進樣分析,以對照品和內標峰面積比值作為A1;取6批不同來源的空白血漿,按照“2.4節”方法進行血漿樣品前處理,取全部上清液分別加入高、低濃度質控工作液和內標工作液各10 μL,再按“2.4節”下方法稀釋進樣分析,以對照品和內標峰面積的比值作為A2;以純水代替空白血漿,按“2.4節”操作配制成高、低QC水平進樣分析,以對照品和內標峰面積的比值作為A3。A1/A2 為提取回收率(extraction recovery,ER),A2/A3 為基質效應(matrix effect,ME)。同時,采用同樣的方法分析溶血及高脂血漿的基質效應。分別計算5個分析物及其同位素內標的基質效應,進而計算內標校正的基質效應,6批基質內標校正的基質效應變異系數≤15%[8-10]。結果見表3,5個分析物及其內標的提取回收率為98.7%～104.5%,RSD均<5%;6批不同來源正常血漿的基質效應為98.1%～106.0%,RSD均<6%;溶血及高脂血漿的基質效應為95.7%～105.8%,RSD均<5%。因此,空白、溶血及高脂血漿基質效應不影響各分析物的定量。

表3 5個分析物在血漿中的基質效應和提取回收率

2.5.5殘留試驗 在進樣高濃度樣品(ULOQ)后,通過分析空白血漿樣本來估計殘留。根據《中華人民共和國藥典》2020年版規定,分析高濃度樣品之后,空白樣品中的殘留應不超過LLOQ的20%,且不超過內標的5%[8-10]。研究結果顯示,LLOQ中DTG、LMV、TNF的殘留<10%,RAL、EFV并無殘留;所有同位素內標的殘留均<1.3%,故各分析物的殘留不影響檢測的準確度和精密度。

2.5.6稀釋效應 配制高于定量上限濃度的血漿樣本(多替拉韋、拉替拉韋、依非韋倫、拉米夫定及替諾福韋質量濃度分別為80、8、120、8、8 μg·mL-1),并用空白血漿稀釋該樣品,稀釋倍數分別為4、10、40倍(每個稀釋因子平行制備6份)。樣品稀釋不應影響準確度和精密度,稀釋后樣本的準確度和精密度應在±15%之內[8-10]。結果顯示,稀釋4、10、40倍后,樣本的準確度為93.8%～113.3%,精密度為2.4%～5.7%。因此,濃度超過定量上限的血漿樣本可以在樣本前處理和分析前稀釋。

2.5.7穩定性試驗 平行配制QC樣品(QL、QH)各6份,考察多替拉韋、拉替拉韋、依非韋倫、拉米夫定和替諾福韋在不同儲存或工藝條件下的血漿樣品穩定性。

所有的穩定性結果均是通過與0時刻比較而獲得,每個水平的QC濃度均值與標示濃度的偏差應在±15%范圍內[8-10]。各分析物的穩定性結果見表4,5個分析物的血漿樣品在室溫下可穩定放置12 h、4 ℃可放置2 d、-30 ℃可放置20 d、可反復凍融3次、自動進樣室(4 ℃)中可持續放置12 h、重復進樣3次依舊保持穩定,各質控樣品在上述條件下的RSD值均<10%。

表4 5個分析物在血漿中的穩定性

2.6臨床應用 該研究已通過福建醫科大學孟超肝膽醫院倫理委員會批準(倫理號:科審2023_005_01)。通過監測服用多替拉韋、拉替拉韋、依非韋倫、拉米夫定或替諾福韋的HIV患者穩態血漿谷濃度,檢驗本方法的適用性。多替拉韋、拉替拉韋、依非韋倫、拉米夫定和替諾福韋的消除半衰期分別為14、9、52～76、5～7、17 h,以上抗病毒藥在4～5個半衰期后達到穩態血藥濃度。考慮到個體間的藥動學差異,測定服用多替拉韋、拉替拉韋、拉米夫定或替諾福韋至少1周后的穩態血漿谷濃度及依非韋倫至少16 d后的穩態血漿谷濃度。患者血藥濃度達穩態后,在下一次給藥前30 min抽取靜脈血2 mL于EDTA2K采血管中,3 000×g離心5 min,將上清液轉移至1.5 mL EP管中,于-30 ℃下保存至分析檢測。本研究共檢測樣本29例,其血藥濃度結果見表5。本方法的定量濃度范圍可基本覆蓋多替拉韋、拉米夫定、替諾福韋的臨床樣本檢測需求。后續會繼續收集更多的臨床樣本進行檢測,為HIV患者制定個體化治療提供參考。

表5 HIV患者穩態血藥谷濃度

3 討論

國內外已有文獻報道關于5個分析物單獨或與其他藥物同時測定檢測方法,如高效液相色譜-紫外檢測法(HPLC-UV)、毛細管電泳法和UPLC-MS/MS等[11]。但毛細管電泳-UV法[12-13]和HPLC-UV法[14-15]檢測靈敏度均較低,易受基質中雜質干擾、分析時間較長(>20 min),樣品前處理復雜,二者均不適用于HIV患者多種抗病毒藥物的高通量分析。UPLC-MS/MS結合色譜的高分離效率、質譜的高選擇性、高靈敏度等優點,成為臨床上血藥濃度檢測的金標準。SINGH等[16]采用LC-MS/MS法測定人血漿中阿巴卡韋/多替拉韋/拉米夫定的血藥濃度,但該方法使用緩沖鹽作為流動相,配制繁瑣、費時且易加速消耗色譜柱的使用壽命;PENCHALA等[17]采用液液萃取法、固相萃取法進行前處理,但操作復雜,耗時較長且浪費有機溶劑。僅國外一項研究同時檢測5種分析物及其他抗病毒藥[7],但該方法分析時間較長(>6 min),樣品制備過程耗時長(>10 min),且國內尚無5種分析物同時測定的報告。基于此,結合已有的文獻方法,本研究從色譜、質譜條件及血樣前處理方法進行優化。

本研究考察不同流動相及梯度洗脫程序,將純水、0.1%甲酸、2 mmol·L-1乙酸銨水溶液作為水相分別與甲醇、乙腈、0.1%甲酸甲醇、0.1%甲酸乙腈等有機相進行配比,結果顯示甲醇中替諾福韋峰形拖尾,拉米夫定、替諾福韋在不加酸的流動相中不出峰,而拉替拉韋、依非韋倫在加入乙酸銨的流動相中后響應變低,后基線變高,故最終采用0.1%甲酸-0.1%甲酸乙腈作為流動相,確保各分析物峰型良好、響應高及保留時間短。拉米夫定和替諾福韋的極性強,而多替拉韋、拉替拉韋和依非韋倫的極性較弱,故初始流動相水相比例升高有助于增加拉米夫定和替諾福韋保留時間,增大二者響應。在樣本的前處理上,本方法選擇蛋白沉淀法,對比甲醇,乙腈作為沉淀劑,5個分析物的響應更高。但5個分析物的極性差異較大,前處理單純采用乙腈沉淀,拉米夫定和替諾福韋難以達到理想的提取效果,故在乙腈沉淀前加適量純水,增大拉米夫定和替諾福韋的溶解度,可大大提高二者的質譜響應。同時,采用同位素內標來降低血漿中內源性物質對響應造成的直接或間接的影響。相較于其他方法,本方法運行時間短(5 min),以0.1%甲酸-0.1%甲酸乙腈作為流動相,不影響色譜柱的壽命,血漿樣本前處理簡單、低成本,滿足臨床高通量檢測需求。

本研究建立的人血漿中多替拉韋、拉替拉韋、依非韋倫、拉米夫定和替諾福韋同時測定方法簡便、快速、高效、準確度高、線性范圍廣,適用于HIV患者的多替拉韋、拉替拉韋、依非韋倫、拉米夫定和替諾福韋的治療性藥物監測研究,為HIV患者制定個體化的用藥方案提供依據。