姜黃素對糖尿病小鼠皮膚創(chuàng)面愈合的影響*

張津,崔新剛,朱彥兆,蘇夢,貝穎,黃玉,李美運,武艷

(1.牡丹江醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,牡丹江 157000;2.牡丹江醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室,牡丹江 157000;3.上海大學(xué)溫州研究院,溫州 325000)

糖尿病是臨床上常見的一種代謝性疾病,預(yù)計到2045年,全球糖尿病患者將達(dá)到7.002億例[1]。糖尿病創(chuàng)面是糖尿病常見的并發(fā)癥之一,其炎癥持續(xù)時間長、氧化應(yīng)激反應(yīng)強烈、傷口愈合慢等,對患者的預(yù)后及生活質(zhì)量帶來嚴(yán)重影響[2]。傳統(tǒng)的治療方法主要包括局部給予抗菌藥物、傷口清創(chuàng)、傷口包扎等,但高血糖所導(dǎo)致的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)難以清除[3-4],傳統(tǒng)治療無法滿足糖尿病創(chuàng)面愈合的需求[5-6]。姜黃素是姜黃的生物活性成分,具有抗炎、抗感染、抗氧化和低毒等特點[7-11],還可促進肉芽組織的形成,加速傷口的收縮和上皮化[12-13]。最近,許多研究已經(jīng)開發(fā)出多種姜黃素的新劑型,以在創(chuàng)傷部位遞送姜黃素,并表現(xiàn)出良好的促進創(chuàng)面愈合的效果[14-15]。糖尿病患者特殊的體內(nèi)環(huán)境干擾創(chuàng)面的愈合,高血糖環(huán)境中大量產(chǎn)生的活性氧(reactive oxygen species,ROS),促炎因子的持續(xù)釋放等,這些都會導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的損傷,創(chuàng)面愈合難度增加。目前大多數(shù)研究主要針對姜黃素對于普通創(chuàng)面的促愈合效果,對糖尿病創(chuàng)面作用機制的研究很少且沒有進行系統(tǒng)的討論。因此,筆者在本研究從基礎(chǔ)研究方面著手,對姜黃素的藥物安全、抗炎和抗氧化進行研究,并評估姜黃素促糖尿病創(chuàng)面修復(fù)效果。

1 材料與方法

1.1實驗細(xì)胞與動物 實驗細(xì)胞:NIH-3T3成纖維細(xì)胞(批號:CC-Y2070)和RAW 264.7 巨噬細(xì)胞(批號:CC-Y2084)購自上海酶研生物科技有限公司。實驗動物:無特定病原體(SPF)級雄性ICR小鼠,7～8周齡,體質(zhì)量25～28 g,用于構(gòu)建糖尿病創(chuàng)面模型,小鼠購于遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司,飼養(yǎng)于牡丹江醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心,實驗動物使用許可證號:SYXK(黑)2019-003,飼養(yǎng)條件:溫度(22±2) ℃,相對濕度(50±10) %,12 h交替照明,自由進食進水。本研究動物實驗流程經(jīng)牡丹江醫(yī)學(xué)院動物倫理委員會審查批準(zhǔn)。

1.2試劑及主要儀器 姜黃素(批號:SC8050,純度≥98%)和鏈脲佐菌素(批號:S8050)購于北京索萊寶科技有限公司;達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco's modified Eagle's medium,DMEM)高糖培養(yǎng)基(批號:8121326),胎牛血清(批號:10091148)購自美國Gibco公司;噻唑藍(lán) (MTT)(批號:ST316)、脂多糖(Reagent grade,LPS)(批號:ST1470)、過氧化氫(H2O2)(批號:S0038-3)、ROS檢測試劑盒(批號:S0033S)和DAPI染色液 (批號:C1002)購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司;CD86引物、CD206引物、ARG1引物、白細(xì)胞介素(IL)-6引物及β-actin引物購于上海生工生物工程公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號:0489703001)和SYBR Green Master Mix(批號:04913914001)購自美國Roche公司,RNA提取試劑盒(批號:R6812-02)購自O(shè)mega Bio-k公司,異氟烷(批號:R510-22-10)購于深圳瑞沃德公司,OCT包埋劑(批號:4583)購于北京索萊寶科技有限公司,抗CD206抗體(批號:DF4149)和抗CD86抗體(批號:DF6332)購自中國Affinity Biosciences,抗平滑肌α-肌動蛋白抗體(批號:19245)購自美國Cell Signaling Technology,二氧化碳培養(yǎng)箱(Forma)購自美國Thermo Fisher 公司,熒光定量PCR 儀(StepOne)購自美國ABI公司,酶標(biāo)儀(Spectra Max M2)購自美國Molecular Devices公司,共聚焦顯微鏡(Olympus FV1000)購自日本Olympus公司。

1.3實驗方法

1.3.1姜黃素對成纖維細(xì)胞活性影響 使用胰酶消化對數(shù)期生長的成纖維細(xì)胞,將其制備為細(xì)胞懸液,按每孔細(xì)胞懸液100 μL(含細(xì)胞5 000個)接種于96孔板中,培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h,待細(xì)胞貼壁后,將孔中培養(yǎng)基吸棄,加入提前配置好的5、10、20、40、80 mol·L-1的姜黃素溶液,并設(shè)置對照組(不做任何處理),每組設(shè)置復(fù)孔6個。在培養(yǎng)箱中孵育24 h后,吸棄孔中培養(yǎng)基,在避光條件下每孔加入MTT試劑(0.5 mg·mL-1)100 μL。細(xì)胞在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,將孔中液體吸棄,每孔加入二甲亞砜100 μL。搖床振蕩15 min,用酶標(biāo)儀在波長490 nm檢測各孔吸光度(A值),采用公式計算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%)=(實驗組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)×100。

1.3.2姜黃素抗氧化效果 使用胰酶消化對數(shù)期生長的成纖維細(xì)胞,用二氯熒光素二乙酸酯(2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA)制備為細(xì)胞懸液。在共聚焦小皿培養(yǎng)細(xì)胞(每孔細(xì)胞3×105個),待細(xì)胞貼壁后,分組為:未經(jīng)過任何處理的細(xì)胞作為對照組、H2O2組(600 mol·L-1)、H2O2(600 mol·L-1)+姜黃素組(5、10、20 mol·L-1),共同在培養(yǎng)箱孵育24 h,然后除去培養(yǎng)基,用10 mol·L-1的DCFH-DA自由基溶液代替,繼續(xù)在培養(yǎng)箱孵育30 min。再次清洗細(xì)胞,用DAPI轉(zhuǎn)染細(xì)胞核10 min。最后通過共聚焦顯微鏡進行分析。

使用胰酶消化對數(shù)期生長的成纖維細(xì)胞,將其制備為細(xì)胞懸液。在黑色96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)細(xì)胞(每孔細(xì)胞5 000個),待細(xì)胞貼壁后,培養(yǎng)箱孵育24 h,然后除去培養(yǎng)基,用10 mol·L-1的DCFH-DA自由基溶液代替,繼續(xù)在培養(yǎng)箱孵育30 min。再次清洗細(xì)胞,通過熒光酶標(biāo)儀進行檢測。

1.3.3姜黃素對RAW 264.7巨噬細(xì)胞中炎癥相關(guān)基因mRNA的表達(dá) 使用胰酶消化對數(shù)期生長的RAW 264.7巨噬細(xì)胞,將其制備為細(xì)胞懸液。在6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)細(xì)胞(每孔細(xì)胞5×105個),待細(xì)胞貼壁后,分組為:未經(jīng)過任何處理的細(xì)胞作為對照組、LPS組(1 g·L-1)、LPS(1 g·L-1)+姜黃素組(5、10、20 mol·L-1),培養(yǎng)箱孵育24 h,然后吸棄培養(yǎng)基,收集6孔板內(nèi)細(xì)胞。按照OMEGA RNA 提取試劑盒提細(xì)胞總RNA。檢測總RNA 濃度,運用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA合成cDNA。用熒光染料SYBR Green及合成的cDNA產(chǎn)物和引物進行擴增,以β-actin作為內(nèi)參基因,用ΔΔ-CT方法計算與對照組的相對基因表達(dá)。目的基因及引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3.4構(gòu)建糖尿病小鼠創(chuàng)面模型及分組 取ICR小鼠,禁食12 h后,腹腔注射鏈脲佐菌素(100 mg·kg-1),連續(xù)3 d。2 周后用全自動血糖監(jiān)測儀測定血糖,當(dāng)連續(xù)2 d的血糖水平≥16.7 mmol·L-1認(rèn)為糖尿病小鼠造模成功[16]。小鼠背部用打孔器打出兩個直徑6 mm的創(chuàng)面后,以隨機數(shù)字表法分為A、B、C共3組(每組6只),A組涂抹磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)溶液100 μL,5 d,B組涂抹15 mg·mL-1姜黃素溶液100 μL,5 d,C 組涂抹30 mg·mL-1姜黃素溶液100 μL,5 d。每只小鼠單籠飼養(yǎng),避免老鼠之間互相影響愈合速度。

1.3.5姜黃素對創(chuàng)面大體形態(tài)及愈合率的影響 觀察小鼠創(chuàng)面恢復(fù)情況,直到創(chuàng)面完全愈合為止。于第0、7、14天測量創(chuàng)面面積,采用隨機數(shù)字表法選取3只,進行測量,用ImageJ軟件計算創(chuàng)面閉合率。創(chuàng)面愈合率(%)=(初始創(chuàng)面面積-各時間點創(chuàng)面面積)/初始創(chuàng)面面積×100。用虛線框出創(chuàng)面區(qū)域,并用ImageJ軟件計算創(chuàng)面長度。

1.3.6姜黃素對創(chuàng)面組織愈合情況的影響 用剪刀取創(chuàng)面皮膚組織,放入4%多聚甲醛中,經(jīng)乙醇脫水、石蠟包埋等步驟后,將其切為厚度5 μm的組織切片,進行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)、Masson染色,鏡下觀察皮膚愈合情況。

1.3.7姜黃素對創(chuàng)面組織平滑肌α-肌動蛋白、CD86及CD206表達(dá)的影響 皮膚組織放入OCT包埋劑中,置于-80 ℃冰箱保存,冰凍切片機切成厚5 μm冰凍切片,固定,封閉,一抗(Anti-α-SMA 1：200、Anti-CD86 1：200、Anti-CD206 1：200) 孵育,二抗(羅丹明標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)1：200) 孵育,轉(zhuǎn)染DAPI,封片,用共聚焦顯微鏡觀察并拍攝。ImageJ軟件計算圖像熒光陽性表達(dá),進行半定量分析。

2 結(jié)果

2.1成纖維細(xì)胞活性的影響 不同濃度姜黃素處理24 h后細(xì)胞活性變化,結(jié)果見圖1。與對照組比較,5、10、20 mol·L-1姜黃素組細(xì)胞活性無明顯變化,40、80 μmol·L-1姜黃素組細(xì)胞活性顯著降低(P<0.05),顯示高濃度的姜黃素對成纖維細(xì)胞的增殖有顯著抑制作用。

①與對照組比較,t=3.24,3.32,P<0.05。

2.2細(xì)胞抗氧化效果 結(jié)果見圖2A和2B。與H2O2組比較,加入10、20 μmol·L-1姜黃素后,綠色熒光信號急劇下降,ROS水平明顯降低(P<0.01),這表明姜黃素具有較強的ROS清除活性。此外,用熒光酶標(biāo)儀對細(xì)胞內(nèi)熒光的相對強度進行定量分析(圖2C),與熒光圖像數(shù)據(jù)的趨勢一致,表明姜黃素減弱H2O2刺激導(dǎo)致的氧化應(yīng)激反應(yīng),具有抗氧化作用。

a.對照組;b.H2O2組;c.5 mol·L-1姜黃素組;d.10 mol·L-1姜黃素組;e.20 mol·L-1姜黃素組;①與對照組比較,t=15.41,25.49,P<0.01;②與H2O2組比較,t=12.14～17.13,P<0.01。

2.3巨噬細(xì)胞炎癥因子基因表達(dá) 結(jié)果見圖3。與對照組比較,LPS刺激巨噬細(xì)胞后CD86、IL-6的mRNA水平明顯升高(P<0.01),CD206,ARG1的mRNA水平明顯降低(P<0.01),顯示巨噬細(xì)胞炎癥模型構(gòu)造成功。與LPS組比較,當(dāng)加入5 mol·L-1姜黃素后,CD86、IL-6的mRNA水平降低(P<0.05);當(dāng)加入10、20 mol·L-1姜黃素后,CD86、IL-6的mRNA水平顯著降低(P<0.01);CD206、ARG1的mRNA水平顯著升高(P<0.05,P<0.01)。本結(jié)果說明姜黃素降低了在巨噬細(xì)胞中LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng),具有抗炎作用。

①與對照組比較,t=6.62～14.07,P<0.01;②與LPS組比較,t=3.78～5.34,P<0.05;③與LPS組比較,t=6.34～11.89,P<0.01。

2.4創(chuàng)面愈合情況評估 結(jié)果見圖4,表2。與對照組比較,給予姜黃素兩組愈合速度加快,愈合效果更好(均P<0.01)。在第14天時,姜黃素(30 mg·mL-1)組創(chuàng)面呈現(xiàn)完全愈合的狀態(tài),說明此組愈合速度最快,愈合效果最好。

A.對照組;B.15 mg·mL-1姜黃素組;C.30 mg·mL-1姜黃素組。

2.5創(chuàng)面愈合組織的病理學(xué)變化 新生皮膚的厚度和分化狀況以及傷口區(qū)域的長度在各組之間存在很大差異,結(jié)果見圖5。與對照組比較,姜黃素組創(chuàng)面的肉芽組織形成明顯增加,傷口長度明顯變短,新血管形成更多,其中姜黃素(30 mg·mL-1)組傷口愈合最好(P<0.01),姜黃素(15 mg·mL-1)組次之(P<0.01)。此外,Masson染色顯示,姜黃素組創(chuàng)面膠原蛋白(細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分)的沉積物明顯增多。對照組創(chuàng)面顯示出稀疏和無序的低水平膠原蛋白沉積。而姜黃素組的膠原蛋白沉積增加,膠原纖維排列整齊致密。

A.對照組;B.15 mg·mL-1姜黃素組;C.30 mg·mL-1姜黃素組;①與對照組比較,t=4.51～7.39,P<0.01。

2.6姜黃素對皮膚組織修復(fù)的影響 在創(chuàng)面愈合過程中,肉芽組織中的成纖維細(xì)胞被分化為肌成纖維細(xì)胞,在肉芽組織的收縮和成熟中起主要作用。如圖6A顯示,對創(chuàng)面進行α-SMA染色,檢測肉芽組織中肌成纖維細(xì)胞。圖6B顯示,與對照組、姜黃素(15 mg·mL-1)組比較,姜黃素(30 mg·mL-1)組創(chuàng)面中α-SMA陽性細(xì)胞的數(shù)量顯著增加(P<0.01)。為了進一步驗證姜黃素組對體內(nèi)巨噬細(xì)胞的極化作用,如圖6A所示,對創(chuàng)面皮膚進行CD86和CD206免疫熒光染色。圖6C、6D顯示,與對照組比較,姜黃素組的M1表型巨噬細(xì)胞(CD86)的顯著減少(P<0.01),M2表型巨噬細(xì)胞(CD206)的顯著增加(P<0.01)。

A.對照組;B.15 mg·mL-1姜黃素組;C.30 mg·mL-1姜黃素組;①與30 mg·mL-1姜黃素組比較,t=6.33,P<0.01;②與對照組比較,t=7.45～14.19,P<0.01。

3 討論

由于血液循環(huán)不良,促炎細(xì)胞因子的持續(xù)釋放,ROS的過度產(chǎn)生等因素,糖尿病創(chuàng)面極易發(fā)展成慢性難愈合創(chuàng)面[17-19]。減壓、組織清創(chuàng)、抗感染和手術(shù)恢復(fù)血液循環(huán)是治療糖尿病創(chuàng)面的主要臨床方法,但創(chuàng)面愈合效果仍然不佳[20]。姜黃素是從姜黃獲得的多酚化合物,已被用于治療多種疾病[10,17]。研究表明姜黃素在體內(nèi)和體外均可降低ROS和炎癥[7-8,21],而這也正是影響糖尿病創(chuàng)面難愈合的關(guān)鍵因素。

ROS是氧的單電子還原產(chǎn)物,包括超氧陰離子、過氧化氫、自由基等多種過氧化物,具有氧化蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等物質(zhì)的功能[22-23]。對于糖尿病創(chuàng)面來說,持續(xù)的高血糖和激活的免疫系統(tǒng)都會導(dǎo)致創(chuàng)面環(huán)境中ROS顯著增加[24-25]。本實驗與前人的研究結(jié)果相似[6],姜黃素可以通過清除ROS減少氧化應(yīng)激,維持細(xì)胞正常生理狀態(tài)。巨噬細(xì)胞是炎癥引發(fā)、維持的基礎(chǔ),是人體固有免疫系統(tǒng)中重要組成部分[16,26],也是組織修復(fù)所必需的,在傷口愈合中發(fā)揮重要作用[27-28]。M1型巨噬細(xì)胞在炎癥早期階段釋放促炎因子,延緩皮膚愈合;M2型巨噬細(xì)胞可以釋放抗炎因子,在組織修復(fù)和重建、血管生成等方面均有促進作用[29]。既往研究表明,姜黃素可以減輕巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥[30]。筆者在本研究中采用LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥模型,選擇CD86、CD206等炎癥相關(guān)指標(biāo)進行驗證,結(jié)果顯示姜黃素降低了促炎因子的表達(dá),增加了抗炎因子的釋放。

在體內(nèi)實驗中將姜黃素應(yīng)用于糖尿病小鼠創(chuàng)面,具有良好的促創(chuàng)面愈合的效果。創(chuàng)面修復(fù)的增殖期主要是肉芽組織形成、細(xì)胞外基質(zhì)重塑、膠原蛋白沉積和新血管形成的過程[31]。細(xì)胞外基質(zhì)由各種蛋白質(zhì)和多糖組成,為細(xì)胞提供支持,是創(chuàng)面愈合的先決條件[32]。膠原蛋白是皮膚細(xì)胞外基質(zhì)中的主要蛋白質(zhì),其形成和沉積是加強創(chuàng)面修復(fù)的關(guān)鍵因素。本實驗對小鼠創(chuàng)面愈合過程中第7天和第14天皮膚組織進行組織學(xué)染色分析,發(fā)現(xiàn)對照組肉芽組織形成較少,細(xì)胞外基質(zhì)重塑較少,新血管形成較少,顯示出低水平的膠原蛋白的沉積。而姜黃素組(尤其是大劑量組) 創(chuàng)面的細(xì)胞外基質(zhì)重塑增多、新血管形成增多、膠原蛋白沉積增加,傷口加速愈合。另外,肌成纖維細(xì)胞的增殖在傷口收縮過程中起到重要作用[33],姜黃素組(尤其是大劑量組)皮膚創(chuàng)面中的α-SMA表達(dá)明顯增多,表明肌成纖維細(xì)胞明顯增多。為了驗證炎癥反應(yīng)對創(chuàng)面愈合的影響,對小鼠創(chuàng)面愈合組織進行免疫熒光染色,結(jié)果顯示,姜黃素組M1型巨噬細(xì)胞數(shù)量減少,M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量增加。這證實姜黃素體內(nèi)有效的抗炎作用,可能有助于縮短炎癥階段,并有效促進創(chuàng)面愈合。

創(chuàng)面修復(fù)是一個多因素參與的過程,涉及細(xì)胞防御機制繁多,而姜黃素通過增強抗炎和抗氧化的作用,加速糖尿病小鼠創(chuàng)面的愈合。本實驗證明姜黃素具有優(yōu)異的促糖尿病創(chuàng)面修復(fù)作用,在細(xì)胞層面,小劑量的姜黃素展現(xiàn)優(yōu)異的效果,但高劑量的姜黃素同時也會影響細(xì)胞生存;在實驗動物層面,稍高劑量的姜黃素效果更為優(yōu)異。目前,已有多種姜黃素的制劑、佐劑、輔料被研發(fā),如納米細(xì)胞囊泡,纖維膜等。它們改善姜黃素結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,溶解性差等問題,但是其生物毒性以及新型材料的安全性問題仍然是重點關(guān)注的方向。因此,我們將對姜黃素與新型載體結(jié)合后的安全性及利用率問題進行進一步研究。