蟛蜞菊內(nèi)酯通過(guò)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的影響*

劉素連,謝凱,葉冬寧,李汶靜,陳杰,許靜

(1.南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院藥劑科,廣州 510091;2.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部,廣州 510080)

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是一種慢性炎癥性疾病,主要有氧化損傷、氧化應(yīng)激等病理過(guò)程,不良反應(yīng)事件風(fēng)險(xiǎn)增加[1]。近年來(lái),已發(fā)現(xiàn)自噬與AS密切相關(guān)[2]。適度的自噬對(duì)AS具有保護(hù)作用,細(xì)胞通過(guò)自噬降解細(xì)胞內(nèi)受損的結(jié)構(gòu)[3],使其能夠適應(yīng)氧化應(yīng)激等環(huán)境,防止細(xì)胞凋亡和壞死[4]。但過(guò)度的自噬活動(dòng)可能引起細(xì)胞死亡,稱為自噬性細(xì)胞死亡,也稱為Ⅱ型程序性死亡[5]。PI3K/Akt/mTOR是一條參與調(diào)節(jié)細(xì)胞重要生理過(guò)程的經(jīng)典信號(hào)通路[6],同樣是一條重要的抗自噬通路。研究發(fā)現(xiàn),通過(guò)Ⅲ類PI3K/Beclin-1和Ⅰ類PI3K/Akt通路過(guò)表達(dá)自噬相關(guān)基因LC3Ⅱ以減少ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷和凋亡[7]。蟛蜞菊內(nèi)酯(wedelolactone,WEL)[8]為墨旱蓮主要成分之一,能抗炎、降脂和保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞等藥理作用[9-10]。近年來(lái),WEL因廣泛的藥理作用而引起關(guān)注[4]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)WEL可以抑制脂多糖(LPS)所致的RAW264.7細(xì)胞生成白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-6、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α,TNF-α)等炎性細(xì)胞因子,并能抑制肝纖維化,呈現(xiàn)較好的護(hù)肝作用[11]。另外,WEL對(duì)過(guò)氧化氫(hydrogen peroxide,H2O2)誘導(dǎo)人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷有保護(hù)作用。但其是否通過(guò)調(diào)節(jié)自噬抑制動(dòng)脈粥樣硬化內(nèi)皮細(xì)胞損傷發(fā)生發(fā)展尚不清楚。筆者基于PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路研究WEL對(duì)人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞自噬的作用,為臨床治療AS提供理論參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)(武漢普諾賽生命科技有限公司,貨號(hào):CP-H082)。

1.1.2藥物與試劑 WEL(美國(guó)TargetMol,批號(hào):T3384,含量:99.4%);內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基ECM(Sciencell,批號(hào):1001);噻唑藍(lán)(MTT)檢測(cè)試劑盒(碧云天,批號(hào):C0009S);BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒(碧云天,批號(hào):P0012S);Ad-mcherry-p62(碧云天,批號(hào):C3016)。β-actin抗體(批號(hào):AF7018),Bcl-2抗體(批號(hào):AF6139),BAX抗體(AF0120),PI3K抗體(AF6241),p-PI3K抗體(批號(hào):AF3241),Akt抗體(批號(hào):AF6259),p-Akt抗體(批號(hào):AF0016),mTOR抗體(批號(hào):AF6308),p-mTOR抗體(批號(hào):AF3308)均購(gòu)自Affinity公司;SOD1抗體(Cell Signaling Technology,批號(hào):2770S)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(碧云天,批號(hào):A0208);C11-BODIPY 581/591(ABclonal,批號(hào):RM02821)。

1.1.3儀器 全自動(dòng)倒置熒光顯微鏡(德國(guó)Leica公司,型號(hào):Dmi8);電泳和電轉(zhuǎn)系統(tǒng)、ChemiDoc Touch化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)、Multiskan MK3型酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2方法

1.2.1HUVECs細(xì)胞培養(yǎng)及傳代 HUVECs使用ECM完全培養(yǎng)基培養(yǎng),每500 mL ECM培養(yǎng)基含F(xiàn)BS25 mL、P/S 5 mL、ECGs 5 mL,于37 ℃、5%二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2HUVECs氧化損傷模型制備 參照文獻(xiàn)[12]。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVECs細(xì)胞,0.25%胰酶消化后,將細(xì)胞數(shù)量調(diào)整至1×106個(gè)·mL-1,貼壁生長(zhǎng)至70%,進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。設(shè)置分組為正常對(duì)照組:正常培養(yǎng);溶媒對(duì)照組:0.1%二甲亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)培養(yǎng);H2O2組:200 μmol·L-1H2O2;WEL小、中、大劑量組(10,20,40 μmol·L-1)與200 μmol·L-1H2O2共處理HUVECs細(xì)胞24 h,根據(jù)MTT檢測(cè)結(jié)果最終選取20 μmol·L-1WEL進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3MTT檢測(cè)HUVECs細(xì)胞存活率 給藥前1 d,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVECs細(xì)胞,用ECM完全培養(yǎng)基配成單個(gè)細(xì)胞懸液,以每孔3 000個(gè)接種到96孔板中,置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。H2O2及WEL處理24 h后,加入5 mg·mL-1MTT溶液10 μL,37 ℃孵育4 h,棄上清液。每孔DMSO 150 μL,搖床低速振搖10 min,多功能酶標(biāo)儀波長(zhǎng)570 nm測(cè)定吸光度(A)值。

1.2.4Ad-mCherry-p62腺病毒檢測(cè)細(xì)胞自噬情況 6孔板接種HUVECs細(xì)胞,分為3組。對(duì)照組,H2O2組:200 μmol·L-1H2O2處理24 h,WEL組:200 μmol·L-1H2O2+ 20 μmol·L-1WEL,處理24 h。將Ad-mCherry-p62腺病毒置于冰上解凍,并計(jì)算感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)為20的病毒量。從培養(yǎng)箱取出細(xì)胞,棄培養(yǎng)基,每孔加入新鮮ECM 1.2 mL,并加入MOI為20值的病毒液。Ad-mCherry-p62腺病毒感染24 h后,除去含有病毒的培養(yǎng)基,每孔加入新鮮ECM 2 mL,繼續(xù)觀察24 h。感染48 h,除去培養(yǎng)基,Hoechst33258染色液加入0.5 mL,孵育5 min,磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)洗2次×3 min,熒光顯微鏡下觀察p62的表達(dá)情況。

1.2.5ROS的檢測(cè) 將1 mg C11 BODIPY 581/591溶于DMSO 198.2 μL中,制備10 mmol·L-1的C11 BODIPY 581/591儲(chǔ)存液。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞,胰酶消化后使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),將細(xì)胞接種到6孔板中,經(jīng)H2O2或WEL給藥對(duì)應(yīng)時(shí)間后加入終濃度為10 μmol·L-1的C11 BODIPY 581/591適量,避光孵育1 h。用PBS清洗細(xì)胞2次以除去多余的染料。細(xì)胞用0.25%胰酶消化,每孔加入培養(yǎng)基1 mL終止消化。細(xì)胞懸液收集至15 mL離心管中,室溫,1 000 r·min-1,離心3 min,離心后棄上清液,細(xì)胞團(tuán)重懸在5%FBS的PBS中,注意避光。利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)ROS熒光探針的熒光值,再用波長(zhǎng)488 nm激光器激發(fā),在FL1通道測(cè)量505～550 nm對(duì)應(yīng)的信號(hào),在FL2通道測(cè)量波長(zhǎng)>580 nm的信號(hào)。根據(jù)流式細(xì)胞儀FL1和FL2通道信號(hào)分別制作直方圖,根據(jù)直方圖熒光信號(hào)算數(shù)平均值±SEM,來(lái)量化脂質(zhì)過(guò)氧化細(xì)胞比例。

1.2.6免疫印跡(Western blotting)法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 提取細(xì)胞總蛋白,BCA法定量蛋白含量,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)電泳,轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上,5% BSA室溫封閉1 h,加入一抗4 ℃孵育過(guò)夜,洗滌3次后加入二抗,室溫孵育1 h。電致化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence,ECL)發(fā)光液顯影。

2 結(jié)果

2.1WEL對(duì)HUVECs細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的影響 與對(duì)照組比較,H2O2組細(xì)胞存活率下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),說(shuō)明H2O2對(duì)HUVECs增殖具有抑制作用。與H2O2組比較,WEL小、中、大劑量組細(xì)胞存活率明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),說(shuō)明WEL對(duì)HUVECs的氧化損傷有較好的保護(hù)作用,見圖1。綜合比較選擇20 μmol·L-1進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

A.正常對(duì)照組;B.DMSO組;C.H2O2組;D.WEL小劑量組;E.WEL中劑量組組;F.WEL大劑量組。①與正常對(duì)照組比較,t=9.686,P<0.05;②與H2O2組比較,t=3.091,10.09,6.851,P<0.01。

2.2WEL抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞自噬 用Ad-mCherry-p62腺病毒感染細(xì)胞后,細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中通常存在紅色點(diǎn)狀或較為彌散的斑塊狀熒光。在自噬被抑制的情況下,紅色點(diǎn)狀或斑塊狀變大,而且數(shù)目會(huì)變多。熒光檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,p62蛋白在200 μmol·L-1的H2O2誘導(dǎo)24 h后表達(dá)下調(diào),紅色點(diǎn)狀變小且數(shù)目明顯減少,而使用WEL進(jìn)行干預(yù)后,斑塊狀紅色熒光分布增多,說(shuō)明H2O2誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞自噬可以被WEL抑制(圖2)。

A.對(duì)照組;B.H2O2組;C.WEL組;①與對(duì)照組比較,t=4.355,P<0.05;②與H2O2組比較,t=5.183,P<0.01。

2.3WEL對(duì)HUVECs氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響 流式檢測(cè) C11-BODIPY 581/591的平均熒光強(qiáng)度,結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,H2O2組ROS顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與H2O2組比較,WEL組ROS減少,提示W(wǎng)EL干預(yù)可以減少ROS的產(chǎn)生,緩解細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)(圖3)。

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)是細(xì)胞內(nèi)天然的抗氧化酶,對(duì)維持細(xì)胞氧化還原平衡具有重要作用[13]。為了確定WEL對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞有抗氧化特性,檢測(cè)抗氧化應(yīng)激保護(hù)因子SOD酶的活性。圖3結(jié)果表明,WEL處理顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞中SOD1活性的降低。H2O2顯著增強(qiáng)細(xì)胞ROS生成,減弱細(xì)胞抗氧化能力,表現(xiàn)為SOD1蛋白表達(dá)降低,WEL處理可以阻斷H2O2誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞,發(fā)揮抗氧化作用。

2.4WEL對(duì)HUVECs凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 HUVECs在200 μmol·L-1的H2O2誘導(dǎo)24 h后,檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白BAX、Bcl-2及Caspase3的表達(dá)情況,結(jié)果見圖4。與對(duì)照組比較,H2O2組BAX蛋白的表達(dá)上調(diào),而Bcl-2蛋白下調(diào);與H2O2組比較,WEL組BAX蛋白表達(dá)下調(diào),而Bcl-2蛋白上調(diào),且各組之間BAX/Bcl-2的值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.855,P<0.05)。結(jié)果提示,WEL能抑制H2O2致HUVECs細(xì)胞凋亡,發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。

2.5WEL對(duì)H2O2刺激的HUVECs細(xì)胞中p-I3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表達(dá)的影響 Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5。與對(duì)照組比較,H2O2組p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表達(dá)水平明顯減少(P<0.01);與H2O2組比較,WEL組中p-PI3K(Tyr607)、p-Akt(Ser473)、p-mTOR(Ser2448)蛋白表達(dá)水平顯著增加(P<0.01),mTOR蛋白在各組表達(dá)水平無(wú)明顯變化。結(jié)果提示,WEL能抑制H2O2致HUVECs細(xì)胞自噬作用。

3 討論

3.1WEL拮抗H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡 Caspase-3 是細(xì)胞凋亡早期階段激活的關(guān)鍵蛋白,抑制caspase-3 蛋白的表達(dá),提示細(xì)胞凋亡被抑制。因此,caspase-3的激活可以作為判斷細(xì)胞凋亡嚴(yán)重性的關(guān)鍵指標(biāo)之一[14-15]。研究表明,使用紅景天中提取的生物活性化合物紅景天苷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用,紅景天苷可以增加HUVECs中SOD的活性,及抑制caspase-3的活性發(fā)揮作用[16]。Bcl-2基因具有抑制凋亡的作用,BAX則為Bcl-2家族中細(xì)胞凋亡促進(jìn)基因。Bcl-2可與BAX形成同源的蛋白二聚體作為細(xì)胞死亡信號(hào)通路的分子開關(guān)。本研究結(jié)果顯示,與模型組比較,WEL組HUVECs細(xì)胞caspase-3 蛋白表達(dá)顯著下調(diào),另外WEL組可使BAX蛋白表達(dá)下調(diào)而Bcl-2蛋白上調(diào),進(jìn)而降低BAX/Bcl-2的比值。以上結(jié)果提示W(wǎng)EL可以抑制HUVECs細(xì)胞凋亡,對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。

3.2WEL抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞自噬 細(xì)胞自噬是真核細(xì)胞通過(guò)自噬相關(guān)基因調(diào)控,利用溶酶體降解自身細(xì)胞蛋白和受損細(xì)胞器的過(guò)程。自噬分為正常生理?xiàng)l件下的基礎(chǔ)型自噬和應(yīng)激條件下的誘導(dǎo)型自噬,前者對(duì)細(xì)胞氧化損傷具有保護(hù)作用,但過(guò)度的自噬可以導(dǎo)致代謝應(yīng)激、降解細(xì)胞成分,甚至引起細(xì)胞死亡等[17]。在饑餓、缺氧和營(yíng)養(yǎng)缺乏等應(yīng)激條件下,PI3K/AKT信號(hào)通路通過(guò)介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞中mTOR的表達(dá)來(lái)負(fù)調(diào)控自噬[18]。研究表明,足夠的內(nèi)皮細(xì)胞自噬通量通過(guò)防止內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、衰老和炎癥以限制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成[19]。一方面,自噬的過(guò)度激活可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞死亡和斑塊失穩(wěn)[20]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組比較,p62蛋白在200 μmol·L-1H2O2誘導(dǎo)24 h后表達(dá)下調(diào),紅色點(diǎn)狀變小且數(shù)目明顯減少,而使用WEL進(jìn)行干預(yù)后,斑塊狀紅色熒光分布增多,說(shuō)明H2O2誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞自噬可以被WEL抑制。

mTOR通過(guò)磷酸化使形成的自噬調(diào)節(jié)復(fù)合物失活,進(jìn)而影響自噬小體的形成。PI3K/Akt下游靶點(diǎn)是mTOR,而mTOR的下游轉(zhuǎn)錄因子則包括了HIF-1α、c-MYC、FoxO等明星分子,mTOR信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化和凋亡等生理過(guò)程具有中心調(diào)控的作用,是細(xì)胞內(nèi)一個(gè)重要的信號(hào)途徑。在缺血缺氧等饑餓狀態(tài)下,自噬的發(fā)生主要由mTOR通路調(diào)控。缺氧的信號(hào)使mTOR信號(hào)通路失活,從而引起自噬信號(hào)通路的激活。雷帕霉素是mTOR通路的抑制劑,可抑制mTOR 的磷酸化,誘導(dǎo)和促進(jìn)細(xì)胞自噬的發(fā)生[21]。許多證據(jù)表明 mTOR是自噬關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑,為調(diào)控自噬極具潛力的靶標(biāo)[22]。因此,本研究Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果中顯示,與對(duì)照組比較,H2O2組p-Akt、p-PI3K蛋白表達(dá)量下降。結(jié)果表明H2O2會(huì)抑制PI3K、Akt的磷酸化,誘導(dǎo)自噬。而加入WEL后,可誘導(dǎo) PI3K與生長(zhǎng)因子受體結(jié)合,可使Akt的蛋白結(jié)構(gòu)改變并使其活化,以磷酸化作用抑制下游一系列底物如凋亡相關(guān)蛋白活性,減少細(xì)胞凋亡,減少氧化應(yīng)激損傷。WEL組p-Akt表達(dá)升高,活化mTOR,抑制自噬,從而抵抗HUVECs細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷[10]。

綜上所述,WEL可以抑制H2O2引起的內(nèi)皮細(xì)胞損傷,其作用機(jī)制可能與PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路抑制細(xì)胞自噬有關(guān)。尚需要進(jìn)行深入研究,對(duì)以上問(wèn)題作進(jìn)一步探討,尋找WEL可能的藥物靶點(diǎn),緩解氧化應(yīng)激損傷,為相關(guān)疾病的預(yù)防和治療開創(chuàng)未來(lái)。