基于同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術檢測血清25（OH）D3的候選參考測量程序的建立及性能評價

李 敏，于洪遠，李會強（.北京航天總醫(yī)院檢驗科，北京 00076；.天津醫(yī)科大學醫(yī)學檢驗學院，天津 30003）

維生素D（vitamin D，VD）屬于類固醇激素，在血液循環(huán)中的主要形式為25 羥維生素D[25 hydroxyvitamin D，25(OH)D]。目前檢測方法包括酶聯(lián)免疫法、放射免疫法、液相色譜法及液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)等[1]。LC-MS/MS 法檢測人血清25(OH)D 特異度高、抗干擾能力強，被公認為是檢測25(OH)D 的金標準[2]。國家衛(wèi)生健康委員會臨床檢驗中心開展的25(OH)D 室間質(zhì)評結(jié)果顯示，采用LC-MS/MS 法的實驗室間檢測結(jié)果仍存在較大差異。因此，想要實現(xiàn)血清25(OH)D 檢測的標準化就必須建立并完善參考方法。目前，檢驗醫(yī)學溯源聯(lián)合委員會（Joint Committee for Traceability in Laboratory Medicine，JCTLM）認可的25(OH)D 參考方法有3 種，分別為美國國家標準和技術研究院（National Institute of Standards and Technology，NIST）、美國疾病預防控制中心（Centers for Disease Control and Prevention,CDC）、比利時根特大學（Ghent University）建立的基于LC-MS/MS 的參考方法，但3 種參考方法存在樣本需求量大、色譜分離過程復雜、標準曲線需依據(jù)樣本預估濃度分別配制等問題，不便于臨床實驗室操作，故本研究擬在此基礎上建立25(OH)D3 的候選參考測量程序，為臨床檢測結(jié)果的可比性和準確性提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集北京航天總醫(yī)院2023年7月住院患者檢測剩余40 份血清作為比對標本。

納入標準：無慢性肝、腎、心等嚴重疾病，近期無感染性疾病史，近期無發(fā)熱史。所有標本均無溶血、乳糜和黃疸。所有研究對象的監(jiān)護人對檢測均知情同意，該研究已通過北京航天總醫(yī)院倫理委員會審查批準。

1.2 儀器與試劑 WatersTQD 串聯(lián)ACQUITYUPLC

液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Waters 公司）；Agela氮吹儀，XSE205DU 十萬分之一分析天平（德國梅特勒托利多公司）；Eppendorf 移液器，高速冷凍離心機（德國Eppendorf 公司）；MilliQ 超純水機。Ascentis Express F5 色譜柱（2.1mm×150 mm，2.7μm，美國Supelco 公司）。25(OH)D3 標準品（美國Sigma 公司），內(nèi)標品25(OH)D3-d3（Cambridge Isotope Laboratories 公司），甲醇、正己烷、無水乙醇（美國ThermoFisher 公司）。

1.3 方法

1.3.1 色譜和質(zhì)譜條件：流動相A 為0.1%甲酸水溶液，流動相B 為0.1%甲酸甲醇溶液，采用等度模式（73%的甲醇水）洗脫15min，流速為0.3ml/min，柱溫40℃，進樣體積10μl。采用電噴霧電離源正離子和多反應監(jiān)測模式分析。離子源溫度150℃，霧化氣溫度400℃，去簇電壓24V,碰撞能量10V。25(OH)D3 的定量離子對為401.3/365.3,25(OH)D3-d3 的定量離子對為404.3/368.2。

1.3.2 標準品和內(nèi)標的配制：采用稱重法分別制備出10μg/ml 的25(OH)D3 儲備液和內(nèi)標儲備液，用無水乙醇將儲備液進行稀釋，得到250ng/ml 的25(OH)D3 工作液和30ng/ml 內(nèi)標工作液。采用五點包括法繪制標準曲線，25(OH)D3 與內(nèi)標的質(zhì)量比分別為0.5,0.8,1.0,1.2,1.5。

1.3.3 樣本前處理：采用臨床常規(guī)質(zhì)譜方法測得血清樣本中25(OH)D3 的大致濃度，精確稱取血清樣本0.25～1g，加入純水1ml。加入內(nèi)標工作液使血清中25(OH)D3 和內(nèi)標含量比值接近1，渦旋混勻10min 后室溫下平衡1h。加入0.1g/ml 的Na2CO3溶液0.1ml,通過極端pH 值變化使結(jié)合蛋白釋放25(OH)D 代謝物。加入2.5ml 正己烷溶液進行萃取，離心后取上清液，氮氣吹干。為增加提取效率，重復液液萃取過程。加入200μl 73ml/dl 甲醇復溶，渦旋混勻后再次離心取150μl 上清液上機檢測。

1.3.4 方法學評價

1.3.4.1 正確度：采用測定國際臨床化學和檢驗醫(yī)學聯(lián)合會參考實驗室室外質(zhì)量評價計劃樣本(the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine External Quality Assessment Scheme for Reference Laboratories in Laboratory Medicine，RELA）對方法的正確度進行評價。采用本研究建立的方法測定2022 RELA 比對樣本，每個樣本測定3 個批次，每個批次每個濃度預處理3 次，重復測定5 次。

1.3.4.2 精密度：依據(jù)美國臨床實驗室標準化協(xié)會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）EP15-A3 文件[3]，對低、中、高三個不同濃度的混合血清樣本進行檢測，每個批次每個濃度樣本分5 次進行處理，連續(xù)測定3 個批次，分別評估每個濃度樣本的批內(nèi)精密度及總精密度。

1.3.4.3 基質(zhì)效應：采用混合實驗的方法評估相對基質(zhì)效應。選擇血清基質(zhì)樣本、血清和溶液80∶20混合物、血清和溶液1∶1 混合物、血清和溶液20∶80 混合物、溶液基質(zhì)樣本這5 種基質(zhì)樣本中待測物與內(nèi)標的峰面積比值來計算相對基質(zhì)效應。若混合物中待測物與內(nèi)標峰面積比值與理論比值的偏差≤±20%，則視為無相對基質(zhì)效應。

1.3.4.4 檢測限及定量限：以平均信噪比（signalto-noise ratio，S/N）=3 時的濃度作為檢測限。用生理鹽水對已知濃度的血清樣本（18.42ng/ml）進行稀釋，制備出包括預期定量限濃度在內(nèi)的3 個濃度梯度的稀釋樣本，每個濃度的樣本分為5 份進行處理，每份樣本重復測定3 次，分別評估每個濃度樣本的變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）及其濃度測定均值與理論值的偏差。將CV＜10%且偏移＜10%的濃度值作為定量下限。

1.3.4.5 攜帶污染：重復進樣定量下限濃度附近的樣本，交替進樣高濃度和低濃度樣本，比較第一次進樣的低濃度樣本的結(jié)果和后續(xù)進樣的低濃度樣本結(jié)果的差異。若差異低于20%，可認為該方法不存在明顯的攜帶污染。

1.3.4.6 線性范圍：參考美國臨床實驗室標準化研究所的EP-6A 文件，制備一份低濃度樣本（L,濃度為2.5ng/ml）和一份高濃度樣本（H,濃度為220ng/ml），其中高濃度樣本通過添加儲備液獲得。按L，0.8L+0.2H，0.6L+0.4H，0.4L+0.6H，0.2L+0.8H，H 的比例配制6 個濃度標本，將稀釋后樣本進行前處理后重復測定2 次，所有數(shù)據(jù)進行擬合多項式回歸分析。若r≥0.995 且各濃度點理論值和實測值之間的偏差＜15%,則認為本方法在2.5～220ng/ml 范圍內(nèi)線性良好。

1.3.4.7 不確定度：依據(jù)不確定度評估指南，不確定度包括A 類和B 類不確定度。其中A 類主要為重復測量引入的分量，B 類包括標準物質(zhì)的純度、標準物質(zhì)稱量等引入的分量。將各分量計算合成不確定度，擴展因子為2，計算擴展不確定度。

1.3.4.8 方法學比對：采用候選參考測量程序和常規(guī)質(zhì)譜方法測定40 份新鮮冰凍人血清標本中的25(OH)D3，濃度范圍為2.6～71.6ng/ml，選取最佳擬合模型，計算回歸方程及各項參數(shù)并進行偏差分析。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用MedCalc 統(tǒng)計學軟件和Microsoft Excel2003 進行統(tǒng)計分析，采用Passing-Bablok 線性回歸分析、Bland-Altman 一致性分析對方法比對結(jié)果進行分析。

2 結(jié)果

2.1 正確度 見表1。2022年RELA 樣本的測量偏倚均小于1.5%。

表1 2022年RELA 樣本的測量結(jié)果

2.2 精密度 見表2。采用該方法檢測混合血清中25(OH)D3 濃度，批內(nèi)和批間CV均小于2.5%。

表2 25(OH)D3 的批內(nèi)和批間精密度評價結(jié)果

2.3 基質(zhì)效應 血清和溶液80∶20 混合物、血清和溶液1∶1 混合物、血清和溶液20∶80 混合物這三種樣本的平均峰面積比分別為3.39,2.75,2.09，計算得到相對基質(zhì)效應分別為3.53%,3.48%,2.02%。

2.4 檢測限和定量下限 見表3。該方法的檢測限和定量下限分別為0.85ng/ml 和1.84ng/ml。

表3 25(OH)D3 定量下限結(jié)果(n=15)

2.5 攜帶污染 通過多次高值和低值樣本重復進樣，計算出攜帶污染率為-2.85%，可認為不存在明顯的攜帶污染。

2.6 線性范圍 采用最小二乘法進行線性擬合，擬合曲線的方程為Y=0.994X+0.471(r=0.999),各濃度點實測值與理論值的偏倚均小于10%,可認為本方法在2.5～220ng/ml 范圍內(nèi)線性良好。

2.7 不確定度 見表4。從樣本重復測量、標準品純度、標準品配制等方面評估2022RELA 樣本的測量不確定度。

表4 25(OH)D3 測量不確定度評定

2.8 方法學比對 以候選參考測量程序的測定結(jié)果為X軸，質(zhì)譜常規(guī)程序的測定結(jié)果為Y軸，對兩種方法進行Passing-Bablok 回歸分析,線性回歸方程為Y=1.025X-0.349，斜率的95% 可信區(qū)間為0.955～1.081，截距的95% 可信區(qū)間為-1.198～0.373，相關系數(shù)r=0.982。兩種方法檢測結(jié)果的平均偏差為1.3%。低濃度區(qū)偏差較大，有3 例樣本偏差超出衛(wèi)生健康委員會臨檢中心室間質(zhì)評規(guī)定的允許總誤差±25%，隨著樣本濃度上升，偏差降低，具體見圖1。

圖1 質(zhì)譜常規(guī)方法和候選參考方法血清25(OH)D3 檢測結(jié)果的Bland-Altman 圖

3 討論

目前，VD 不僅在骨骼方面，在糖尿病、心血管、腫瘤等方面都受到重視[4]，因此VD 檢測需求也呈不斷增長趨勢。隨著技術的發(fā)展，LC-MS/MS 法被廣泛應用于生物樣本中VD 的檢測。盡管其有靈敏度高、特異度好等優(yōu)勢，但LC-MS/MS 法大多為實驗室自建方法，由于儀器、色譜柱、試劑、校準物等因素的影響，不同實驗室間檢測結(jié)果可比性差。標準化是確保在不同實驗室、不同儀器及時間內(nèi)，獲得一致性結(jié)果的必要條件[5]。

同位素稀釋質(zhì)譜法是國際公認的一級測量原理[6]，有靈敏度高，測量值能溯源至國際單位制物質(zhì)量的基本單位摩爾等優(yōu)點，在參考體系的建設中有著廣泛的應用。JCTLM 數(shù)據(jù)庫中已有3 種25(OH)D3 的參考測量程序，其中美國國家標準與技術研究院（National Institute of Standanrds and Techology，NIST）的方法[7]所需樣本量較大，每次需稱取樣本量2g 左右，萃取過程中正己烷-乙酸乙酯的體積約8ml。比利時根特大學[8]的方法采用二維色譜的模式，待測物提取后先經(jīng)Sephadex LH-20 分離，隨后依次經(jīng)過C4 和Zorbax SB-CN 色譜柱，整體分離過程較復雜。美國CDC 方法[9]所需樣本量適中，其校準曲線的配制取決于待測物中25(OH)D3 的濃度，若25(OH)D3 濃度≤75nmol/L，則校準曲線質(zhì)量比范圍在0.25～1.25 之間。若25(OH)D3 濃度＞75nmol/L，質(zhì)量比范圍在0.5～2.5 之間。

本研究在滿足正確度及精密度等要求的前提下，對樣本前處理及校準曲線配制等各方面進行了優(yōu)化。首先樣本的加樣量控制在0.25～1g 之間，其次校準采用經(jīng)典的五點包括法，通過在測量體系中加入不同體積的樣本，使待測物和內(nèi)標的質(zhì)量比控制在0.5～ 1.5 之間[10]，以標準與內(nèi)標的峰面積比值為縱坐標，標準與內(nèi)標的質(zhì)量比為橫坐標，用最小二乘法進行擬合。本文前處理采用重復液液萃取的方式。美國CDC 的研究顯示，支持性液體萃取雖然可以縮短前處理時間，但需要較高的試劑成本和更大體積的有機溶劑。張麗等[11]研究采用蛋白質(zhì)沉淀結(jié)合液液萃取制備樣品，用于替代重復使用液液萃取,即一次性加入1ml 0.1mol/L 的硫酸鋅甲醇水溶液和8ml 的正己烷，充分振蕩混勻30 min 后離心取上清液。盡管該方法在操作步驟上有所精簡，但后續(xù)振蕩混勻的時間延長，總體的樣本處理時間并沒有減少。25(OH)D3 的定量易受到同分異構體3-epi-25(OH)D3 的干擾，兩者結(jié)構上僅有一個羥基空間方向上的差異。雖然3-epi-25(OH)D3 主要存在于兒童體內(nèi)，成人含量較低，但若無法區(qū)分，假性增高的結(jié)果會誤導臨床對維生素D 缺乏的患者進行正確的診斷[12]。液相條件采用等度洗脫15min 的模式，可有效分離25(OH)D3 的同分異構體3-epi-25(OH)D3。有研究表明[13-14]，五氟苯基丙基色譜柱以五氟苯基丙基為鍵合基團，苯環(huán)上的氟原子可增強鍵合相與分析物之間的相互作用，在流動相甲醇的梯度作用下，8min 內(nèi)實現(xiàn)25(OH)D3 與3-epi-25(OH)D3 的分離。本文未對此進行驗證，將在后續(xù)實驗中進行補充研究。

采用候選參考測量程序和質(zhì)譜常規(guī)程序檢測40份血清標本，兩者結(jié)果的相關性較好（r=0.982），但低濃度樣本檢測結(jié)果的偏差較大。可能是由于常規(guī)方法采用經(jīng)典的校準曲線，檢測所有樣本的內(nèi)標濃度均不變，高濃度樣本區(qū)分析物和內(nèi)標的峰面積為低濃度區(qū)的幾十倍，影響結(jié)果的準確性。參考程序采用五點包括法進行校準，可有效避免該問題。不同實驗室間LC-MS/MS 檢測結(jié)果存在較大偏差。若要實現(xiàn)標準化，需從試劑、校準品等多方面進行規(guī)范，才能獲得高質(zhì)量并具有臨床價值的檢驗結(jié)果。

綜上所述，本研究建立的血清25(OH)D3 候選參考測量程序，滿足參考測量程序的性能要求，可用于25(OH)D3 的量值溯源和標準化，在后續(xù)臨床25(OH)D3 檢測質(zhì)量改善中發(fā)揮重要作用。