自動(dòng)化磁珠法提取血清脂溶性維生素應(yīng)用LC-MS/MS檢測(cè)的性能評(píng)價(jià)

孔 卓，李春艷（北京積水潭醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，北京 100035）

脂溶性維生素是體內(nèi)的輔酶和催化劑，主要溶解于脂肪，儲(chǔ)存于肝臟，對(duì)人體的生長(zhǎng)發(fā)育、免疫、應(yīng)激等均有重要作用。脂溶性維生素缺乏會(huì)引起人體生理機(jī)能、新陳代謝、細(xì)胞調(diào)節(jié)紊亂，誘發(fā)多種疾病，而攝入過(guò)量則易引起蓄積中毒，甚至導(dǎo)致死亡[1-2]。因此，監(jiān)測(cè)人體內(nèi)脂溶性維生素的濃度非常必要，有助于人體健康的評(píng)價(jià)、疾病的診斷以及治療過(guò)程中攝入量的控制，臨床意義重大。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tarndem mass spectromerry,LC-MS/MS）技術(shù)以其高靈敏度、高特異度的強(qiáng)大優(yōu)勢(shì)，被廣泛應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)領(lǐng)域，且在維生素、單胺類神經(jīng)遞質(zhì)、激素等項(xiàng)目的檢測(cè)中備受青睞。目前臨床采用質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)脂溶性維生素的過(guò)程中，大多是通過(guò)手工操作完成樣本提取，以萃取法居多，需濃縮、正壓、多次離心等[3-6]，自動(dòng)化程度極低，對(duì)操作人員技能要求較高，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。自動(dòng)化磁珠法樣本制備前處理簡(jiǎn)單，自動(dòng)化程度較高，極大程度地降低了人為因素，節(jié)約了人力和時(shí)間成本，并且有望將液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)發(fā)展成為前處理和檢測(cè)一體的全自動(dòng)分析儀。故本研究擬采用磁珠法進(jìn)行樣本前處理，聯(lián)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)人血清中脂溶性維生素含量，并與傳統(tǒng)萃取法檢測(cè)結(jié)果作為對(duì)照，評(píng)估該檢測(cè)程序的分析性能，為臨床脂溶性維生素樣本檢測(cè)自動(dòng)化前處理的方法選擇提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集當(dāng)天臨床檢測(cè)剩余血清樣本，選取非乳糜、黃疸的200 例樣本分裝后保存于-80℃?zhèn)溆谩１狙芯拷?jīng)過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)后實(shí)施。

1.2 儀器與試劑 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)（美國(guó)Waters Xevo TQ-S IVD）；ZPTQ 32 自動(dòng)化磁珠法質(zhì)譜全自動(dòng)樣品處理系統(tǒng)（北京梅斯質(zhì)譜生物科技有限責(zé)任公司）；BY-R20 型高速冷凍離心機(jī)（北京白洋醫(yī)療器械有限公司）；MTV-100 多管渦旋混合儀和MB100-2A 微孔板恒溫振蕩器（杭州奧盛儀器有限公司）；傳統(tǒng)萃取法脂溶性維生素測(cè)定試劑盒（杭州凱萊譜精準(zhǔn)醫(yī)療檢測(cè)技術(shù)有限公司）；自動(dòng)化磁珠法脂溶性維生素測(cè)定試劑盒（北京梅斯質(zhì)譜生物科技有限責(zé)任公司）。維生素A 質(zhì)控品：90，432，864 ng/ml；25-維生素D2質(zhì)控品：3，14.4，28.8 ng/ml；25-維生素D3質(zhì)控品：7.5，36，72 ng/ml；維生素E 質(zhì)控品：1 725，8 280，16 560 ng/ml；維生素K 質(zhì)控品：0.3，1.44，2.88 ng/ml。

1.3 方法

1.3.1 自動(dòng)化磁珠法樣本制備：按照試劑盒操作說(shuō)明操作，將100 μl 血清樣本加入預(yù)設(shè)的96 孔中的樣本位置，再將同位素內(nèi)標(biāo)加入其中，后將96 孔板轉(zhuǎn)移至前處理系統(tǒng)ZPTQ 32 儀器中進(jìn)行自動(dòng)化樣本提取。標(biāo)線、質(zhì)控和樣本同步操作處理。

1.3.2 傳統(tǒng)萃取法樣本制備：按照試劑盒操作說(shuō)明操作，取50 μl 血清樣本，加入250 μl 脂溶性維生素萃取液（含內(nèi)標(biāo)），渦旋8 min，4 000 r/min離心10 min，取上清液200 μl 待測(cè)。標(biāo)線、質(zhì)控和樣本同步操作處理。

1.3.3 色譜條件：色譜柱為 Kinetex 2.6 μm C18 100A 30×2.1 mm，流動(dòng)相為0.1%甲酸水（A）～ 0.1%甲酸甲醇（B），梯度洗脫：0～ 0.5 min，40%流動(dòng)相A；0.5～ 2 min，40%～ 0%流動(dòng)相A；2～ 3.5 min，0%流動(dòng)相A；3.51～ 5 min，40%流動(dòng)相A；流速0.5 ml/min；柱溫40 ℃，進(jìn)樣量10 μl。

1.3.4 質(zhì)譜條件：采用正離子電噴霧離子化多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM），離子源溫度 150℃，毛細(xì)管電壓 3.5 kV，脫溶劑氣和輔助氣為氮?dú)猓撊軇猓ǖ獨(dú)猓w積流量 800 L/h，脫溶劑氣溫度 600℃，其他主要參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 脂溶性維生素的相關(guān)質(zhì)譜參數(shù)

1.3.5 性能驗(yàn)證：性能驗(yàn)證過(guò)程參考《液相色譜-質(zhì)譜臨床應(yīng)用建議》[7]和《液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜臨床檢測(cè)方法的開(kāi)發(fā)與驗(yàn)證》[8]兩部專家共識(shí)。

1.3.5.1 線性、定量限和檢測(cè)限評(píng)價(jià)指標(biāo) 以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為X軸，標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為Y軸，進(jìn)行線性回歸分析，經(jīng)“1/X2”權(quán)重得到線性回歸方程，且r2＞0.99。將血清樣本中各物質(zhì)峰面積和其內(nèi)標(biāo)的峰面積比值代入線性回歸方程，計(jì)算樣本中脂溶性維生素A，D2，D3，E，K 的含量。檢測(cè)限為信噪比≥3 時(shí)的濃度，定量限為信噪比≥10 時(shí)的濃度，且連續(xù)10 次測(cè)定的變異偏差應(yīng)＜20%。

1.3.5.2 精密度評(píng)價(jià)方案：混合血清樣本平均分為2份，1份加入適量低濃度混合標(biāo)準(zhǔn)品作為低值樣本，1 份加入適量高濃度混合標(biāo)準(zhǔn)品作為高值樣本，混勻后分別分裝保存于-80 ℃冰箱。每天各取出1 支，制備8 個(gè)平行管，測(cè)定三個(gè)批次，計(jì)算精密度，批內(nèi)精密度和批間精密度的相對(duì)偏差應(yīng)≤±15%。

1.3.5.3 正確度評(píng)價(jià)方案：通過(guò)加標(biāo)回收率判斷測(cè)定準(zhǔn)確度，混合血清、混合血清添加脂溶性維生素A，D2，D3，E，K 兩個(gè)水平的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液各10 μl，按上述前處理方法處理，各制備3 個(gè)平行管，計(jì)算加樣回收率和測(cè)量偏差，加樣回收率的相對(duì)偏差應(yīng)≤±15%。

1.3.5.4 基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)方案：采用樣本處理后加入法。取8 份來(lái)源于不同個(gè)體的血清樣本，每份樣本分為3份，經(jīng)過(guò)自動(dòng)磁珠法提取后，一份加入水空白，一份加入10 μl 脂溶性維生素高濃度混合標(biāo)準(zhǔn)品，最后一份加入10 μl 脂溶性維生素低濃度混合標(biāo)準(zhǔn)品，3 份均加入20 μl 混合內(nèi)標(biāo)。去除空白樣本的信號(hào)值后與溶劑中標(biāo)準(zhǔn)品峰面積（或峰面積比值）進(jìn)行比較，判斷基質(zhì)效應(yīng)，基質(zhì)效應(yīng)的相對(duì)偏差應(yīng)≤±15%。

1.3.5.5 攜帶污染評(píng)價(jià)方案：選擇高值質(zhì)控和低值質(zhì)控樣本作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，分別進(jìn)行高-低質(zhì)控進(jìn)樣循環(huán)5 次和低-低質(zhì)控進(jìn)行循環(huán)5 次，高-低值樣本循環(huán)進(jìn)樣結(jié)果均值與低-低值樣本循環(huán)進(jìn)樣結(jié)果均值之差應(yīng)小于低-低值樣本循環(huán)進(jìn)樣結(jié)果均值的3s。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 兩種前處理方法提取并檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果使用MedCalc?20.0.27（比利時(shí)MedCalc Software bvba 公司）軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用Bland-Altman 法比較兩種前處理方法結(jié)果的一致性，通過(guò)Passing-Bablok 回歸分析兩種前處理方法結(jié)果之間的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 血清樣本經(jīng)自動(dòng)化磁珠法提取脂溶性維生素后檢測(cè)得到的各色譜峰 峰形對(duì)稱，峰形良好互不干擾；與傳統(tǒng)萃取法提取后的檢測(cè)結(jié)果比較，未發(fā)現(xiàn)自動(dòng)化磁珠法提取后的雜峰有明顯增多。

2.2 自動(dòng)化磁珠法提取脂溶性維生素性能評(píng)價(jià)結(jié)果2.2.1 線性、定量限和檢測(cè)限：脂溶性維生素A，D2，D3，E，K 在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)相關(guān)性良好，各批次的相關(guān)系數(shù)均在0.99 以上，定量限和檢測(cè)限滿足要求，相關(guān)具體參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 磁珠法提取脂溶性維生素LC-MS/MS 檢測(cè)的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、定量限及檢出限

2.2.2 精密度和正確度：見(jiàn)表3。脂溶性維生素A，D2，D3，E，K 的低值樣本和高值樣本批內(nèi)精密度分別在0.66%～4.83%，0.15%～3.70%；批間精密度分別在1.16%～4.33%，2.44%～6.61%，加標(biāo)回收率在87%～112%，百分偏差均在±15%以內(nèi)，滿足檢測(cè)要求。

表3 磁珠法提取脂溶性維生素LC-MS/MS 檢測(cè)的精密度和正確度

2.2.3 基質(zhì)效應(yīng)和攜帶污染：見(jiàn)表4。脂溶性維生素A，D2，D3，E，K 在電噴霧離子源檢測(cè)下幾乎沒(méi)有基質(zhì)抑制，經(jīng)同位素內(nèi)標(biāo)校正，基質(zhì)效應(yīng)均在100%左右；高-低值樣本循環(huán)進(jìn)樣結(jié)果均值與低-低值樣本循環(huán)進(jìn)樣結(jié)果均值之差均小于低-低值樣本循環(huán)進(jìn)樣結(jié)果均值的3s，滿足檢測(cè)要求。

表4 磁珠法提取脂溶性維生素LC-MS/MS 檢測(cè)的基質(zhì)效應(yīng)和攜帶污染

2.2.4 方法比對(duì)：見(jiàn)表5。對(duì)自動(dòng)化磁珠法和傳統(tǒng)萃取法兩種方法提取200 例臨床血清樣本中脂溶性維生素的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行Bland-Altman 和Passing-Bablok 回歸分析。Bland-Altman 分析結(jié)果顯示所有樣本均在±1.96s，表明兩種提取方法檢測(cè)結(jié)果具有較高的一致性，Passing-Bablok 回歸分析結(jié)果顯示兩種提取方法的檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性良好（均r＞0.99，95% CI 均在0.986～0.997 之間）。

表5 兩種方法提取臨床血清樣本中脂溶性維生素的測(cè)定結(jié)果比較

3 討論

脂溶性維生素是人體內(nèi)不可或缺的一類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，缺乏或過(guò)量均會(huì)對(duì)身體機(jī)能造成損傷，誘發(fā)多種疾病[3,5]。人體缺乏維生素A，會(huì)引起兒童發(fā)育不良、皮膚干燥、干眼病、夜盲癥等；缺乏維生素D 可能會(huì)導(dǎo)致兒童佝僂病、成人骨質(zhì)疏松癥、軟骨癥、肌無(wú)力，增加老年人跌倒和骨折的風(fēng)險(xiǎn)；維生素E 與肌肉、神經(jīng)、生殖有關(guān)，攝入不足可能產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)失調(diào)、毛發(fā)脫落、不育等癥狀；維生素K 又叫凝血維生素，缺乏可能致凝血時(shí)間延長(zhǎng)，嚴(yán)重時(shí)危及生命[9]。但是補(bǔ)充過(guò)量的脂溶性維生素同樣會(huì)導(dǎo)致不良事件的發(fā)生，維生素A 補(bǔ)充過(guò)量可引起維生素A 過(guò)多癥、牙齦出血，甚至出現(xiàn)急性或慢性中毒；維生素D 補(bǔ)充過(guò)量則可能會(huì)導(dǎo)致血鈣濃度過(guò)高，引起鈣鹽在腎臟、肺臟、神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)等重要器官和組織的沉積鈣化，產(chǎn)生不可逆的嚴(yán)重?fù)p害；長(zhǎng)期服用較大劑量的維生素E 有可能出現(xiàn)肌無(wú)力、疲倦、頭痛和惡心等中毒癥狀，維生素E 過(guò)量還可能引起大出血；過(guò)量補(bǔ)充維生素K 會(huì)導(dǎo)致人體發(fā)生癌癥和出現(xiàn)皮疹的現(xiàn)象，孕婦服用大劑量維生素K有可能造成新生兒黃疸。綜上所述，對(duì)于兒童以及孕婦等特殊人群，準(zhǔn)確檢測(cè)脂溶性維生素尤為重要。

兒童由于受關(guān)注度高、年齡小、描述病情能力弱等特點(diǎn)，在兒科臨床診療工作中，許多家長(zhǎng)以及一些臨床醫(yī)生對(duì)兒童是否要補(bǔ)充維生素、是否需要持續(xù)補(bǔ)充以及擔(dān)心維生素過(guò)量或中毒等方面常常存在困惑。脂溶性維生素譜檢測(cè)為指導(dǎo)臨床上維生素科學(xué)合理補(bǔ)充提供有力的參考依據(jù)。對(duì)于高代謝水平的孕產(chǎn)婦而言，維生素缺乏或過(guò)量均會(huì)造成不理想的妊娠結(jié)局，有研究表明，維生素D 與維生素D受體結(jié)合后可參與胚胎著床、妊娠相關(guān)蛋白和細(xì)胞因子的分泌及鈣的輸送，在維持正常妊娠和胎兒發(fā)育中發(fā)揮著重要作用[10]。由于孕婦及家屬對(duì)維生素的認(rèn)知不足，只是單純認(rèn)為補(bǔ)充維生素D 就夠了，忽視了維生素A，E，K 的意義，導(dǎo)致妊娠期、圍產(chǎn)期以及新生兒發(fā)育期間產(chǎn)生不同程度的危害。故建議提高醫(yī)生及孕婦對(duì)合理補(bǔ)充維生素的重視程度，加強(qiáng)宣傳和引導(dǎo)，使孕期維生素營(yíng)養(yǎng)檢測(cè)成為常規(guī)，根據(jù)孕婦自身需要制定個(gè)體化補(bǔ)充方案，避免因補(bǔ)充不當(dāng)造成孕產(chǎn)婦及圍生兒隱匿性不良結(jié)局。因此，對(duì)人體內(nèi)脂溶性維生素含量的檢測(cè)是非常必要的。

目前臨床常用的方法主要集中在免疫法、色譜法和質(zhì)譜法，各有優(yōu)劣。免疫法雖操作簡(jiǎn)單，但無(wú)法精準(zhǔn)區(qū)分VD2，VD3，只能測(cè)VD 總含量，且不可同時(shí)檢測(cè)多種脂溶性維生素[3]；色譜法可精準(zhǔn)區(qū)分VD2，VD3，也可同時(shí)檢測(cè)多種脂溶性維生素，但其靈敏度不高，且操作復(fù)雜[11-13]；常見(jiàn)的質(zhì)譜法雖然靈敏度高，但其前處理的方法包括固相萃取、液液萃取及蛋白沉淀等，均存在各自不足，如蛋白沉淀的方式簡(jiǎn)單、成本低，但是處理粗糙，對(duì)儀器、色譜柱污染較大，且易出現(xiàn)離子抑制導(dǎo)致檢測(cè)靈敏度較差，一般僅適用于含量較高的藥物濃度監(jiān)測(cè)；液液萃取的方式成本較低，但是使用揮發(fā)性溶劑較多，且需經(jīng)過(guò)離心、取上清、氮吹等較為繁瑣的步驟，僅適用于脂溶性維生素、脂肪酸等中等極性或弱極性物質(zhì)的提取；若是含量較低的代謝物或激素類物質(zhì)需使用固相萃取法，該方法能有效提取濃縮待測(cè)物，但成本較高，還需多次離心、濃縮等復(fù)雜過(guò)程，對(duì)操作人員要求較高，自動(dòng)化程度極低，容易造成假陽(yáng)性結(jié)果[3-5]。

本研究采用的磁珠法是通過(guò)在磁珠表面進(jìn)行化學(xué)基團(tuán)修飾，使待測(cè)物與磁珠表面鍵合相發(fā)生吸附解吸附的過(guò)程（模擬固相萃取），將活化平衡后的磁珠加入待測(cè)樣本中，充分混勻，使待測(cè)物被吸附在磁珠上，再通過(guò)不同極性強(qiáng)度的洗脫溶液洗脫，以達(dá)到待測(cè)物的分離和純化[14-15]。與傳統(tǒng)固相萃取法相比，磁珠法通過(guò)磁珠的轉(zhuǎn)移來(lái)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)待測(cè)物的分離，不僅操作簡(jiǎn)單、自動(dòng)化程度較高，且未來(lái)有望實(shí)現(xiàn)前處理和檢測(cè)分析一體的全自動(dòng)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜設(shè)備。

綜上，自動(dòng)化磁珠法樣本制備聯(lián)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)人血清中脂溶性維生素的檢測(cè)性能穩(wěn)定，滿足相關(guān)指南及臨床檢測(cè)要求。磁珠法在未來(lái)有望實(shí)現(xiàn)大規(guī)模化應(yīng)用于臨床質(zhì)譜檢測(cè)的自動(dòng)化前處理過(guò)程，提高檢測(cè)效率和精度，方便臨床檢驗(yàn)應(yīng)用。