膿毒癥并發急性腎損傷患者血清miR-181c和miR-578水平表達及臨床意義

宋 飛，李 丹，余 夢，李 敏，丁 繼，李蘭蘭（三峽大學第三臨床醫學院/國藥葛洲壩中心醫院重癥醫學科，湖北宜昌 443000）

膿毒癥（sepsis）是患者對感染反應失調引起的器官功能障礙，是一種危及生命的臨床綜合征[1]。腎臟是膿毒癥期間最早受傷的器官之一，急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是膿毒癥患者常見的并發癥，導致患者出現腎內血流重組、腎臟低灌注、腎小管損傷、細胞凋亡、纖維化、炎癥反應等，甚至可能會導致腎功能衰竭，與極高的死亡率相關[2-3]。研究表明，大多數膿毒癥就醫時，已經發生AKI[4]。因此，早期準確識別膿毒癥并發AKI 的生物標志物，并積極采取有效干預措施，對患者的臨床治療具有重要意義。微小核糖核酸（microRNA，miR）可以靶向多個基因，通過調控細胞增殖、分化、凋亡、發育，調節多種蛋白質的表達，參與多種信號途徑，幾乎涉及身體所有系統[5]。miR-181位于19 號染色體上，在核基因組中編碼，在細胞質中成熟，然后易位到心肌細胞的線粒體基質中，通過調節線粒體基因表達并改變線粒體功能，改善不同器官中細胞的凋亡，在調節燒傷膿毒癥誘導的AKI 中發揮重要作用[6-7]。miR-578 是一種功能性miRNA，抑制癌細胞的生長、侵襲、血管生成，增強細胞放射敏感度，在骨肉瘤、乳腺癌、肺癌等癌癥中發揮抑癌基因的作用，在膿毒癥患者中表達下調[8-9]。盡管有研究表明miR-181c 和miR-578 在膿毒癥患者的作用，然而在膿毒癥并發AKI 患者血清中的表達及臨床意義，尚不明晰。因此，本研究通過檢測膿毒癥并發AKI 患者血清miR-181c 和miR-578 表達水平，分析二者與膿毒癥并發AKI 的關系，為膿毒癥并發AKI 患者的早期診斷和治療提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集2022年1～12月在國藥葛洲壩中心醫院住院治療的80 例膿毒癥并發AKI 患者（AKI 組），其中男性48 例，女性32 例，年齡54.21±6.68 歲，BMI 24.23±6.68 kg/m2和80 例單純膿毒癥患者（非AKI 組），其中男性53 例，女性27 例，年齡53.37±6.54 歲，BMI 23.96±3.14 kg/m2。兩組性別、年齡、BMI 比較差異均無統計學意義（χ2=0.671，t=0.804，0.534，P=0.413，0.423，0.594）。納入標準：①兩組患者均符合膿毒癥[10]相關診斷標準；②AKI 組患者符合急性腎損傷[11]相關診斷標準；③發病時間≤發病時；④研究對象本人詳知此項研究內容，并自愿簽署同意書。排除標準：①慢性腎臟疾病或腎功能不全患者；②妊娠期或哺乳期婦女；③其他因素導致的AKI；④惡性腫瘤患者；⑤免疫系統疾病患者；⑥病例資料不完整者。本研究遵循《世界醫學協會赫爾辛基宣言》。

1.2 儀器與試劑 RNA 提取試劑盒（德國Qiagen公司）；逆轉錄和ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）。qRT-PCR 儀器ABI 7500 Fast 系統；cobasb123 型全自動血氣分析儀，全自動生化分析儀（羅氏公司），引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 臨床資料收集及樣本采集：收集兩組膿毒癥患者的年齡、性別、體質指數（BMI）、高血壓史、糖尿病史、肺部感染等基本資料。所有患者入院次日清晨，空腹采血約3～5 ml 于干燥試管，離心半徑為12 cm，時間為10 min，分離血清后，放入-20℃冰箱中保存，待檢。

1.3.2 血清miR-181c，miR-578 水平檢測：采用RNA 提取試劑盒提取血清樣品中總RNA，使用逆轉錄試劑盒，按其說明書逆轉錄合成cDNA，反應條件：25℃ 5 min，37℃ 45min，85℃ 5s。實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測血清中miR-181c 和miR-578 的相對表達量。根據ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 試劑盒說明書配置反應體系。PCR 反應：50℃2min，95℃10min，95℃15min， 60℃ 60min，溶解曲線：95℃ 10 min 1 個循環，95℃ 15s，60℃ 60s，40 個循環進行qRT-PCR。以U6 作為內參，根據2-ΔΔCt計算miR-181c，miR-578 基因的相對表達量。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR 引物序列

1.3.3 血清指標的檢測以及APACHE Ⅱ評分：采用cobasb123 型全自動血氣分析儀檢測血乳酸、氧合指數；采用全自動生化分析儀檢測血清尿素氮、血肌酐水平。

采用APACHE Ⅱ評分[12]對患者病情進行評估，APACHE Ⅱ評分值與患者病情嚴重程度呈正相關，分值越高則患者病情越嚴重。

1.4 統計學分析 數據以SPSS 25.0 軟件進行統計學分析，經正態性檢驗，符合正態分布，以均數±標準差（±s）描述，采用獨立樣本t檢驗進行組間計量資料比較，計數資料以百分率（%）表示，采用卡方（χ2）檢驗；多因素Logistic 回歸分析影響膿毒癥患者并發AKI 的因素；ROC 曲線分析血清miR-181c，miR-578 水平預測膿毒癥患者并發AKI 的價值，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組疾病史、APACHE Ⅱ評分、血清指標的比較 見表2。AKI 組肺部感染所占比例、動脈血乳酸、血肌酐、尿素氮水平以及APACHE Ⅱ評分均高于非AKI 組，氧合指數低于非AKI 組，差異具有統計學意義（均P＜0.05）。

表2 兩組疾病史、APACHE Ⅱ評分、血清指標的比較[±s，n（%）]

表2 兩組疾病史、APACHE Ⅱ評分、血清指標的比較[±s，n（%）]

項目n非AKI 組（n=80）AKI 組（n=80）t/χ2 值P 值高血壓史有4628（60.87）18（39.13）3.0510.081無11452（45.61）62（54.39）糖尿病史有4121（51.22）20（48.78）0.0330.856無11959（49.58）60（50.42）肺部感染是9137（40.66）54（59.34）7.3640.007否6943（62.32）26（37.68）氧合指數（mmHg）-258.17±34.59196.38±26.5412.6760.000動脈血乳酸（mmol/L）-0.84±0.252.69±1.1314.2980.000血肌酐（μmol/L）-89.96±24.65264.77±53.1426.6910.000尿素氮（mmol/L）-8.31±2.2425.58±8.3217.9250.000 APACHE Ⅱ評分（分）-14.57±3.6919.41±4.857.1040.000

2.2 兩組血清miR-181c，miR-578 水平比較 AKI組患者血清miR-181c 水平（1.47±0.36）高于非AKI組（1.03±0.28），血清miR-578水平（0.76±0.19）顯著低于非AKI 組（1.05±0.31），差異有統計學意義（t=8.629，7.134，均P=0.000）。

2.3 多因素Logistic 回歸分析膿毒癥患者并發AKI的影響因素 見表3。以膿毒癥患者并發AKI（并發=1，未并發=0）為因變量，以肺部感染（有=1，無=0）、動脈血乳酸、APACHE Ⅱ評分、氧合指數、miR-181c，miR-578（連續變量）為自變量，進行多因素Logistic 回歸分析，結果顯示miR-181c[OR（95%CI）：2.984（1.628～5.468）]、肺部感染[OR（95%CI）：1.946（1.250～3.031）]、動脈血乳酸[OR（95%CI）：1.457（1.073～1.978）]、APACHE Ⅱ評分[OR（95%CI）：2.283（1.393～3.741）]是膿毒癥患者并發AKI 的危險因素（均P＜0.05）；miR-578[OR（95%CI）：0.742（0.631～0.873）]、氧合指數[OR（95%CI）：0.342（0.130～0.904）]為保護因素（均P＜0.05）。

表3 多因素Logistic 回歸分析膿毒癥患者并發AKI 的影響因素

2.4 血清miR-181c，miR-578 水平對膿毒癥患者并發AKI 的預測價值 見表4 和圖1。血清miR-181c 預測膿毒癥患者并發AKI 的曲線下面積（area under curve，AUC）為0.854；血清miR-578 預測膿毒癥患者并發AKI 的AUC 為0.803；二者聯合預測膿毒癥患者并發AKI 的AUC 為0.915。二者聯合預測膿毒癥患者并發AKI 優于miR-181c，miR-578各自單獨預測（Z=3.118，3.460，P=0.002，0.001）。

圖1 血清miR-181c，miR-578 水平預測膿毒癥患者并發AKI 的ROC 曲線

表4 血清miR 181c，miR 578 水平對膿毒癥患者并發AKI 的預測價值

3 討論

急性腎損傷（AKI）是住院和重癥膿毒癥患者易發生的危及生命的并發癥，使患者的死亡率增加6～8 倍，患慢性腎病的風險增加三倍，多達四分之一的患者需要腎臟替代治療[13]。但是，通過及時干預和有效治療，AKI 可以在早期得到逆轉，從而降低膿毒癥并發AKI 患者的死亡率[14]。因此，識別膿毒癥患者并發AKI 對于患者的治愈至關重要。

miRNA具有高度的序列保守性和組織特異性，其表達譜隨疾病類型發生特定的變化，其表達失調與多種疾病發生、發展和預后密切相關[15]。miR-181c 影響細胞的增殖、存活和遷移，其在乳腺癌、胃癌、胰腺癌、肺癌、結腸癌等多種癌癥中表達上調[16]。SUN 等[17]發現miR-181c 通過與3’UTR中的靶位點結合，直接抑制細胞周期B1 蛋白的翻譯，引起成骨細胞的細胞增殖異常以及細胞周期停滯，同時參與炎癥和免疫反應，導致骨質流失。ROMAN 等[18]發現miR-181c 在心臟中協調著獨特的核-線粒體機制，肥胖誘導的miR-181c 過表達通過介導下游基因的表達，導致心臟損傷，在心肌細胞中抑制miR-181c 的表達，可以通過改善線粒體功能來保持肥胖期間的心臟功能。張宇峰等[19]發現miR-181c 在急性腦梗死患者血清中高表達，與患者神經缺損程度相關，且高表達患者預后差。本研究結果發現，AKI 組患者血清miR-181c 水平顯著高于非AKI 組，提示miR-181c 可能通過介導患者下游基因的表達，影響細胞生物學行為、炎癥因子水平，與膿毒癥患者并發AKI 密切相關。

miR-578 是一種目前研究較少的miRNA，在多種癌癥中抑制腫瘤的發展。王維學等[20]發現，miR-578 在類風濕關節炎患者滑膜組織中表達顯著降低，其高表達可抑制類風濕關節炎滑膜成纖維細的增殖、遷移及轉移，從而減輕纖維化，減緩類風濕關節炎的病情發展。YAN 等[21]發現，椎間盤退變患者miR-578 表達顯著降低，上調miR-578 表達可通過抑制細胞生長、促炎細胞因子的表達和維持細胞外基質降解，改善患者癥狀。GAO 等[8]發現，miR-578 可以調節脂多糖誘導的HK2 細胞模型，其高表達可以抑制膿毒癥并發AKI 患者的炎癥反應、細胞凋亡、腎組織嚴重纖維化。本研究結果發現，AKI 組患者血清miR-578 水平顯著低于非AKI 組，提示miR-578 高表達可能通過抑制炎癥因子水平、細胞凋亡、腎組織纖維化，抑制病情的發生，miR-578 在膿毒癥患者并發AKI 患者血清中顯著低表達可能是病情惡化的重要原因，miR-578 可作為膿毒癥患者并發AKI 的生物標志物。進一步ROC 曲線分析顯示，miR-181c，miR-578 二者聯合預測膿毒癥患者并發AKI 的效能優于miR-181c，miR-578各自單獨預測，提示miR-181c，miR-578 二者對預測膿毒癥并發AKI 患者具有重要指導價值，豐富了miR-181c，miR-578 在膿毒癥患者并發AKI 中的研究，為感染類疾病提供一定的依據。研究表明，肺部感染、氧合指數、動脈血乳酸、APACHE Ⅱ評分與膿毒癥并發AKI 患者病情的發生、發展和預后密切相關[22-23]。本研究進一步多因素Logistic 回歸分析結果顯示，miR-181c，肺部感染、動脈血乳酸、APACHE Ⅱ評分是膿毒癥患者并發AKI 的危險因素；miR-578，氧合指數是保護因素，提示及時關注上述因素，對患者治療措施的調整具有重要意義，可有效改善膿毒癥患者并發AKI 的病情進展。

綜上所述，膿毒癥并發AKI 患者血清miR-181c 表達顯著上調、miR-578 表達顯著下調，二者聯合對預測膿毒癥患者并發AKI 有較好參考價值。然而，miR-181c，miR-578 參與膿毒癥患者并發AKI 發生發展的具體機制仍需進一步研究。