生物信息學方法篩選IL-3和IL-3+SCF誘導的小鼠骨髓來源肥大細胞的差異表達基因及相關信號通路分析

曹 君，金婕妤，張 勝，喬龍威，梁玉婷（.蘇州大學附屬第一醫(yī)院臨床檢測中心，江蘇蘇州 5006；.南京醫(yī)科大學附屬蘇州市立醫(yī)院生殖與遺傳中心，江蘇蘇州 5000）

肥大細胞（mast cell,MC）是造血干細胞起源的組織區(qū)域免疫細胞，由于胞漿中儲存廣泛的介質及表面表達多種受體，除參與I 型超敏反應外，其在許多炎癥性疾病、組織重塑和抗腫瘤免疫反應中也發(fā)揮重要作用[1-2]。目前，針對MC 在其相關疾病的病理生理學的研究主要是通過細胞模型及動物模型來獲得。常用的MC 系包括人未成熟MC系（HMC-1）、人MC 系（LAD2）、小鼠MC 系（MC/9,P815）和大鼠嗜堿性粒細胞系（RBL-2H3）等。但這些細胞株有些缺乏成熟肥大細胞的表面特征性分子（FcεRI）或活化能力，有些增殖緩慢，不能完全滿足體外實驗要求[3-4]。相比之下，原代培養(yǎng)的小鼠骨髓來源的MC（bone marrow-derived mast cells，BMMCs）具備成熟MC 的特性，更適合體外研究MC 的功能。目前，體外培養(yǎng)的MC 都是在添加生長因子的培養(yǎng)基上獲得的。白細胞介素-3（interleukin-3，IL-3）是最初研究中發(fā)現的支持MC 生長發(fā)育的生長因子之一，具有刺激骨髓干細胞向MC 增殖與分化的功能。但隨后的研究發(fā)現，單獨IL-3 培養(yǎng)的BMMC 可表達FcεRI，結合IgE，但形成顆粒很少[5]。干細胞因子（stem cell factor,SCF）又稱為CD117/c-Kit 受體的配體，在MC 增殖、趨化、黏附、存活以及活化過程中發(fā)揮重要作用[2]。Lantz 和Huff的研究證實[6]，SCF和IL-3 聯合培養(yǎng)3 天后，小鼠BMMCs 的表面表達FcεRI 并開始形成分泌顆粒。由此可見，單獨IL-3 與SCF 和IL-3 聯合培養(yǎng)的小鼠BMMCs 是存在差異的。大量的研究表明，MC 活化后釋放其預先儲存在分泌顆粒中的各種介質，這些介質涉及MC 在不同情況下表現出的不同功能。而這些介質的具體特征又由MC 發(fā)育和成熟的微環(huán)境所決定[7]。因此，研究IL-3 與IL-3+SCF 分別誘導的小鼠BMMCs 的差異性，將有助于其功能學的研究。近年來，基因測序技術與生物信息學分析結合的研究方法已經廣泛應用于各種疾病的研究中，篩選出與疾病鑒定或預后相關的基因，為疾病的治療提供新的治療靶點[8-10]。但是，很少有研究應用生物信息學分析來鑒定和分析IL-3 與IL-3+SCF 分別誘導小鼠BMMCs 的差異表達基因。本研究旨在通過基因表達數據庫（gene expression omnibus,GEO）分析單獨IL-3 誘導的BMMCs 與IL-3+SCF 共同誘導的BMMCs 的差異表達基因，并對其進行富集分析，篩選樞紐基因，為進一步闡明MC 在相關疾病中的發(fā)病機制和潛在治療靶點提供方向。

1 材料與方法

1.1 數據來源 從Gene Expression Omnibus（GEO，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）數據庫下載SCF誘導小鼠骨髓細胞向MC 分化的基因表達數據集GSE35332，該芯片采用GPL1261 平臺，包括IL-3誘導BMMCs 和IL-3+SCF 共同誘導BMMCs 的基因表達矩陣，兩組各6 個生物學重復。

1.2 GEO 數據標準化及差異表達基因的篩選 采用R 軟件（4.0.2 版本）limma 包對數據進行標準化及差異基因篩選，以|logfold change(FC)| ＞ 512，adjustedP＜ 0.001 為篩選條件，符合此標準的被認為是差異表達的基因（differentially expressed gene,DEGs）。利用R 軟件包繪制火山圖和聚類分析圖。

1.3 差異基因信號通路及生物學功能分析 運用DAVID（Version 6.8,http://david.ncifcrf.gov）在線工具進行基因本體（gene ontology，GO）的功能分析及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG） 通路富集分析。通過GO 功能分析將DEGs 功能注釋分為生物過程（biological process，BP）、細胞組分（cellular component，CC）及分子功能（molecular function，MF）；KEGG 通路富集分析對DEGs 信號通路進行總結，以明確DEGs 在小鼠骨髓細胞向MC 誘導分化過程中的作用，為MC 功能研究提供理論依據。相關柱狀圖采用GraphPad Prism 6.0 進行作圖。

1.4 DEGs 對應的蛋白質互作網絡及樞紐基因的獲取 利用String（http://string-db.org）在線工具以互作評分為0.98 對DEGs 構建蛋白質互相作用（protein-protein interaction，PPI）網絡圖。采用Cytoscape 3.8.0 軟件對PPI 結果進行可視化展示。利用Cytoscape 軟件中的MCODE 插件進行功能模塊分析，以Degree cutoff = 2，Node score cutoff = 0.2，K-score = 2，Max.depth = 100 為標準篩選出PPI 中的顯著模塊，運用DAVID 在線工具對模塊中重要的基因進行功能富集。

2 結果

2.1 GEO 數據標準化及DEGs 的篩選 我們采用limma 包對GSE35332 數據集進行標準化，標準化后每個樣本的表達水平相似。在IL-3 和IL-3+SCF誘導小鼠骨髓細胞分化為MC 的兩組數據中以|logfold change(FC)| ＞ 512，adjustedP＜ 0.001 為篩選標準共鑒定到1 339 個（723 個上調和616 個下調）DEGs，見圖1。

圖1 DEG 表達譜火山圖

2.2 DEGs 的GO 和Pathway 富集分析 通過DAVID 在線工具對IL-3 和IL-3+SCF 誘導小鼠骨髓細胞分化為MC 的兩組數據的DEGs 進行功能富集。見表1。表1 中呈現了前5 個GO 條目，GO-BP 條目中，上調的DEGs 主要富集在脂質代謝過程、質子運輸、小G 蛋白介導的信號轉導、蛋白質轉運和骨化調節(jié)介導的信號傳導通路。下調的DEGs 主要參與核糖體的生物合成、端粒酶RNA 定位于Cajal小體的正調控、T 細胞分化、氧化應激反應和NIK/NF-κB 信號通路的調節(jié)。在GO-CC 條目中，上調的DEGs 主要位于在細胞外的外泌體、質膜及胞漿等，而下調的DEGs 主要富集在胞漿、胞核及內質網等。而GO-MF 則主要富集在蛋白質結合力、核酸結合力及鈣粘蛋白結合參與細胞-細胞黏附等。

表1 DEGs 的GO 分析(Top 5)

KEGG 通路富集分析顯示，上調的DEGs 富集在代謝途徑、軸突引導及細胞周期等，而下調的DEGs 主要富集在溶酶體、細胞周期、Epstein-Barr病毒感染和內質網中，見圖2。

圖2 DEGs 的KEGG 富集分析

2.3 關鍵基因篩選 鑒于篩選出的DEGs 較多，我們按PPI 評分＞ 0.98 構建PPI 網絡，見圖3A。通過Cytoscape 軟件對PPI 網絡圖進行可視化顯示，共得到163 個節(jié)點和334 條邊，其中紅色節(jié)點表示上調基因，綠色節(jié)點表示下調基因。進一步對DEGs 的PPI 網絡進行模塊，見圖3B 分析，總分排名前6 位的關鍵基因分別是Psmd8，Psmd6，Psmd14，Psmc4，Psma6 和Psma3。對樞紐基因進行GO-BP 和KEGG 通路富集分析，主要集中在蛋白質水解、MHC I 類分子介導的抗原提呈和加工、泛素依賴性蛋白質分解代謝過程及EB 病毒感染等相關通路。

圖3 DEGs 蛋白互作及模塊分析

3 討論

肥大細胞（MC）作為機體免疫防御的第一道屏障，主要分布于皮膚的皮下和黏膜的上皮層沿血管和神經纖維排列，在各種生理和病理過程中發(fā)揮重要作用[11]。1879年，MC 首次被EHRLICH P 描述[12]，但它們的起源在近一個世紀以來一直存在爭議。近年來，研究者們在不斷地對MC 起源的認知進行補充和修正。2018年，曹雪濤[13]院士團隊和GENTEK[14]團隊在Immunity 期刊連發(fā)兩文，揭示了小鼠皮膚MC 來源于卵黃囊而黏膜MC 來源于骨髓造血干細胞。由此得知，不同部位定居的MC的起源和發(fā)育途徑也會不同。從造血干細胞到MC的具體分化軌跡是MC 研究領域長期關注的科學問題。目前，對MC 分化軌跡的描述較為全面的依然是其骨髓起源。IL-3 是促進小鼠MC 分化作用最強的因子，在MC 分化早期發(fā)揮重要作用。SCF 是維持MC 生存并促進其增殖的重要細胞因子。研究表明，SCF 也能協(xié)助IL-3 介導的MC 分化，在MC 成熟晚期較IL-3 發(fā)揮更重要的作用[15]。體外實驗表明，IL-3 和SCF 聯用可促進MC 膜上IgE 高親和受體FcεRI 的表達和胞內嗜堿顆粒的形成[16]。雖然大部分的研究認為SCF 可以誘導MC 的增殖和分化[17-18]，但也有人認為MC 的增殖分化不完全依賴于SCF。在SCF 基因敲除小鼠模型中，給予IL-3就能夠逆轉因SCF 基因缺失而導致的MC 缺失[12]。這些研究結果提示，單獨IL-3 或/和SCF 誘導小鼠骨髓干細胞分化成MC 的功能可能存在差異性。LTO 等[19]研究者發(fā)現，IL-3+SCF 誘導的BMMCs因其長期暴露于含有SCF 的微環(huán)境中，FcεRI 介導的MC 脫顆粒顯著降低，而單獨IL-3 誘導的BMMCs 則無此現象。他們通過基因表達芯片發(fā)現，Hck 基因在SCF 誘導的BMMCs 中表達下調，表明SCF 已影響了BMMCs 的表型。LTO 等[19]人在研究中僅證實了Hck 基因在SCF 誘導的BMMCs中表達下調，與BMMCs 脫顆粒降低相關，但此現象也有可能是其他基因修飾導致的，因此深入探討IL-3 和IL-3+SCF 兩種模式培養(yǎng)的BMMCs 的差異表達基因，為MC 功能研究提供有力證據。

本研究基于GEO 數據庫對SCF 誘導小鼠骨髓細胞向MC 分化的基因表達數據集GSE35332 進行分析，以|logfold change(FC)| ＞ 512，adjustedP＜ 0.001 為篩選標準，共篩選出1 339 個DEGs（圖1A），其中723 個為上調基因，616 個為下調基因，前20 個DEGs 以表達熱圖顯示，見圖1B。我們通過R 軟件對數據集進行DEGs 分析時發(fā)現，當該數據集以|logfold change(FC)| ＞ 2 或4 為篩選標準時，獲得的DEGs 過多，且差異倍數相差較大，過多的DEGs 在后續(xù)分析相關通路時會產生巨大冗余數據。經多次比較，最終以|logfold change(FC)|＞ 512，adjustedP＜ 0.001 為篩選標準。MC 在分化發(fā)育過程中，極易受局部微環(huán)境的影響，ITO 等[19]人將小鼠造血干細胞在IL-3 和IL-3+SCF 兩種微環(huán)境作用，勢必會誘導出不同基因表達的BMMCs，而MC 的分化發(fā)育過程易受多種細胞因子尤其是SCF 的影響[16]，這也可解釋本研究篩選出的大量差異倍數較大的DEGs。

隨后，我們通過DAVID 數據庫分析發(fā)現這些DEGs 與蛋白質轉運、代謝途徑、細胞周期及NIK/NF-κB 信號通路的調節(jié)等密切相關（表1）。研究表明，NF-κB 家族的轉錄因子與多種重要生物過程密切相關，他們可激活數百個基因參與細胞凋亡、增殖、先天性和適應性免疫以及炎癥反應[20]。有研究表明，IκB 激酶復合物可以通過IgE 的高親和力受體FcεRI 的交聯方式活化MC，進而導致MC脫顆粒[21]。而這些DEGs 參與NF-κB 信號通路提示，在涉及MC 信號通路相關研究時，可采用不同的誘導方式來選擇MC 的細胞模型。此外，我們采用Cytoscape 軟件共篩選出6 個樞紐基因，分別為Psmd8，Psmd6，Psmd14，Psmc4，Psma6 和Psma3（圖3）。本研究篩選出的樞紐基因主要是蛋白酶體亞基（proteasome subunits,PSs）組分。在真核細胞中，蛋白酶體是高度保守的蛋白酶復合物，多以泛素鏈為標記進行降解[22]。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system,UPS)是主要的細胞內和非溶酶體蛋白質降解系統(tǒng)[23]。由于其以高度特異性的方式消除損壞的及錯誤折疊的調節(jié)蛋白，所以UPS 涉及真核生命的幾乎所有方面。UPS 的重要性在免疫細胞中尤為明顯，免疫細胞在識別病原體后會經歷快速的功能重塑。蛋白質穩(wěn)態(tài)、信號轉導、細胞增殖和抗原加工等過程均受UPS 的嚴格調控[24]。MC 的核心功能是識別危險并適當地啟動對已感知危險的免疫反應，這兩個方面都直接或間接的受MC 發(fā)育期間細胞代謝途徑的影響。在MC 發(fā)育過程中會發(fā)生多種代謝變化，目前的研究大多集中于糖酵解和氧化磷酸化的分解代謝[25]。而本研究篩選出的樞紐基因參與泛素依賴性蛋白質分解代謝過程，提示MC 參與的相關疾病可能與UPS 密切相關，這一發(fā)現將為因MC 增殖和發(fā)育異常引起的疾病研究提供新思路。

最后，我們通過通路富集分析發(fā)現主要集中在蛋白質水解、MHC I 類分子介導的抗原提呈和加工、泛素依賴性蛋白質分解代謝過程及EB 病毒感染等相關通路。眾所周知，MC 在慢性過敏/炎癥疾病，尤其是支氣管收縮性哮喘的病理過程中起重要作用。而該過程主要依賴于MC 中類胰蛋白酶的蛋白水解或降解作用，產生調節(jié)支氣管張力和氣道反應性的重要介質[26]。也有體外研究表明，MC 能誘導抗原特異性CD8+T 細胞活化和增殖。該過程需要MC 直接接觸細胞和MHC I 類依賴性抗原交叉呈遞，并誘導CD8+T 細胞分泌IL-2，干擾素-γ和巨噬細胞炎性蛋白-1α[27]。病毒感染時，MC 能促進CD8+T細胞被招募到感染部位并產生干擾素，有效清除病毒[28]。但目前MC 在EB 病毒感染中發(fā)揮的作用尚不清晰，還需進一步研究。這些研究結果也證實了本研究中生物信息學分析的科學性。

綜上所述，本研究基于GEO 數據庫通過生物信息學方法，發(fā)現IL-3 和IL-3+SCF 兩種培養(yǎng)模式下誘導的小鼠BMMCs 基因表達譜存在明顯差異，同時發(fā)現6 個樞紐基因參與泛素依賴性蛋白分解過程，這一發(fā)現將有助于MC 體外培養(yǎng)和功能的深入研究。但本研究同樣存在一些局限性。首先，本研究是通過公共數據庫中的數據構建的分析模型，缺少體內實驗的驗證；其次，篩選出的樞紐基因的作用及機制尚需要進一步研究。