應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建Raji-Luc CD19 KO淋巴瘤細(xì)胞系

劉靜靜，劉秀盈，馮婭茹，馮義超，于夢(mèng)圓，王建勛,3（.北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 0488；.深圳細(xì)胞谷生物醫(yī)藥有限公司，廣東深圳 588；3.深圳北京中醫(yī)藥大學(xué)研究院，廣東深圳 588）

淋巴瘤是最常見的血液腫瘤之一，主要分為非霍奇金淋巴瘤（non-hodgkin lymphoma，NHL）和霍奇金淋巴瘤（hodgkin lymphoma，HL）兩類[1]。其中，NHL 占所有淋巴瘤的90%，B 細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤（B-cell non-hodgkin’s lymphoma，B-NHL）的發(fā)病率是T 細(xì)胞淋巴瘤的三倍，在我國(guó)常見的惡性腫瘤當(dāng)中可以排在前10 位[2-3]。其發(fā)病率隨年齡增長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，致死率較高。據(jù)中國(guó)國(guó)家癌癥中心和美國(guó)國(guó)家癌癥研究所預(yù)估數(shù)據(jù)顯示，2022年我國(guó)NHL 患病人數(shù)97 788 例，死亡人數(shù)高達(dá)57 929例[4-5]。

白細(xì)胞分化抗原CD19 是一種表達(dá)于除漿細(xì)胞以外的所有B 細(xì)胞系、惡性B 細(xì)胞與濾泡樹突狀細(xì)胞(follicular dendritic cells，F(xiàn)DCs)上的表面蛋白，在B 細(xì)胞成熟并最終分化為漿細(xì)胞的整個(gè)過程中都有表達(dá)[6]。有研究表明，大多數(shù)B 細(xì)胞惡性腫瘤患者的癌細(xì)胞中CD19 表達(dá)均為正常至高水平。因此，CD19 是B 細(xì)胞惡性腫瘤中最重要的靶抗原之一，是開發(fā)嵌合抗原受體T 細(xì)胞（chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T）對(duì)抗NHL 和B 細(xì)胞白血病（B cell leukemia，BCL）最有希望的靶點(diǎn)[7]。然而，約60%治療后復(fù)發(fā)患者的癌細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)CD19 表達(dá)減少或完全喪失的現(xiàn)象[8]。目前，盡管抗CD19 CAR-T 細(xì)胞在治療B 細(xì)胞惡性腫瘤方面效果顯著，但治療后經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)的現(xiàn)象，而腫瘤復(fù)發(fā)的主要原因與抗原逃逸有關(guān)[9-10]。因此，需要一種能夠模擬CAR-T 治療過程中免疫逃逸現(xiàn)象的細(xì)胞模型以用于相關(guān)研究。Raji 是一種非霍奇金淋巴瘤，起源于B 淋巴細(xì)胞，其CD19 和CD38 呈雙陽性表達(dá)，常被用做靶細(xì)胞進(jìn)行非霍奇金淋巴瘤的相關(guān)研究[11]。本研究通過CRISPR/Cas9 技術(shù)，構(gòu)建了Raji-Luc CD19 KO 細(xì)胞，為后續(xù)探索如何解決CAR-T 細(xì)胞療法由于抗原免疫逃逸而產(chǎn)生的腫瘤復(fù)發(fā)問題構(gòu)建了細(xì)胞模型，并奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

1.1.1 細(xì)胞：Raji-Luc 細(xì)胞購自北京維通達(dá)生物技術(shù)有限公司，于液氮罐中冷凍保存。

1.1.2 質(zhì)粒：電轉(zhuǎn)所用的原始質(zhì)粒pCAG-PBase，PB-CRISPR-Cas9，PB-CRISPR-sgRNA 均由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)吳森教授饋贈(zèng)，于-20℃冰箱中冷凍保存。

1.2 儀器與試劑 RPMI 1640 培養(yǎng)液，AIM-V 培養(yǎng)液、PBS 溶液、青霉素-鏈霉素溶液、限制性內(nèi)切酶、T4 連接酶、瓊脂、酵母提取物、胰蛋白胨、氯化鈉、氨芐青霉素、DH5α 感受態(tài)細(xì)胞、50×TAE 溶液、DNA marker 和瓊脂糖（北京蘭博利德商貿(mào)有限公司）；膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、質(zhì)粒大提試劑盒和DNA 純化試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）；FBS 胎牛血清（北京百諾威生物科技有限公司）；7-AAD 抗體、PEMYC 抗體、APC anti human CD19 抗體和FITC anti human CD38 抗體（深圳市達(dá)科為生物技術(shù)股份有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 構(gòu)建PB-CRISPR-CD19 sgRNA 質(zhì)粒：在NCBI 網(wǎng)站以“CRISPR/Cas9 CD19 sgRNA”為關(guān)鍵詞進(jìn)行相關(guān)文獻(xiàn)檢索，并通過IDT 網(wǎng)站驗(yàn)證off-target 以及on-target，按照打分由高到低的順序，選擇合適的sgRNA 序列，見表1。由擎科生物進(jìn)行引物合成，將合成的引物片段退火形成所需的目的片段，將目的片段與線性化載體CRISPR-sgRNAvector 在16℃恒溫條件下采用T4 連接12h，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸埃希菌后擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并進(jìn)行濃縮。

表1 sgRNA 片段序列表

1.3.2 Raji-Luc 細(xì)胞的培養(yǎng)：復(fù)蘇Raji-Luc 細(xì)胞，于37℃，5ml/dl CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中無菌培養(yǎng)，每48h 用含10g/dl FBS 的RPMI 培養(yǎng)液傳代一次，使接種密度為5×105個(gè)/ml，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 篩選最優(yōu)sgRNA 序列：將Raji-Luc 細(xì)胞分為4 組，每組1×106個(gè)，分別命名為sgRNA1，sgRNA2，sgRNA3 和sgRNA4，300g 離心5 min，棄去上清，加入無血清RPMI 培養(yǎng)液重懸，每組加入pCAG-PBase 轉(zhuǎn)座酶，PB-CRISPR-Cas9 及PBCD19 sgRNA 質(zhì)粒各4μg，混勻后轉(zhuǎn)移至電轉(zhuǎn)杯中。采用伯樂電轉(zhuǎn)儀，選擇K562 模式進(jìn)行電轉(zhuǎn)染。電擊結(jié)束將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱穩(wěn)定30 min 后緩慢滴加雙倍血清。電轉(zhuǎn)染48 h 后，取適量電轉(zhuǎn)后的4 組細(xì)胞和未電轉(zhuǎn)的原始Raji-Luc 細(xì)胞，400g 離心5min，去除上清，用適量PBS 洗滌細(xì)胞，離心，去除上清，分別加入染色緩沖液重懸細(xì)胞，APC anti human CD19 流式抗體避光染色1h。染色結(jié)束后加入PBS洗滌細(xì)胞，離心后用PBS 重懸，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞CD19 的表達(dá)情況。

1.3.4 電轉(zhuǎn)染PB-CRISPR-CD19 sgRNA1 質(zhì)粒制備Raji-Luc CD19 KO 細(xì)胞：取1×107個(gè)Raji-Luc 細(xì)胞原液量，350g 離心8min。棄去上清，加入含有sgRNA1 電轉(zhuǎn)質(zhì)粒的無血清RPMI 培養(yǎng)液重懸。采用伯樂電轉(zhuǎn)儀，選擇K562 模式進(jìn)行電轉(zhuǎn)染。電擊結(jié)束將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱穩(wěn)定30min 后緩慢滴加雙倍血清。

1.3.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)電轉(zhuǎn)染效率并篩選穩(wěn)定敲除的單克隆細(xì)胞株：電轉(zhuǎn)染48h 后，取適量電轉(zhuǎn)后的Raji-Luc CD19 KO 細(xì)胞和未電轉(zhuǎn)的原始Raji-Luc細(xì)胞，400g 離心5min，去除上清，用適量PBS 洗滌細(xì)胞，離心，去除上清，分別加入2g/dl FBSPBS 染色緩沖液重懸細(xì)胞，并向其中加入FITC anti human CD38，APC anti human CD19 和7-AAD 流式抗體避光染色1h。染色結(jié)束后加入PBS 洗滌細(xì)胞，離心后用PBS 重懸，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，將7-AAD-CD38+CD19-的分群設(shè)為目標(biāo)細(xì)胞，進(jìn)行流式分選，將分選后的細(xì)胞極限稀釋至2.5 個(gè)/ml，在96 孔板中每孔加入200μl 篩選單克隆細(xì)胞。將96 孔板中的單克隆細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，再次取適量單克隆細(xì)胞用抗體FITC anti human CD38，APC anti human CD19 染色，以未轉(zhuǎn)染的Raji-Luc 細(xì)胞作為陽性對(duì)照，對(duì)比檢測(cè)Raji-Luc CD19 KO 細(xì)胞表面CD19 和CD38 的表達(dá)情況，以確定篩選得到的細(xì)胞是否成功敲除表面CD19抗原。

1.3.6 細(xì)胞系表面熒光素酶表達(dá)的檢測(cè)：分別取原始的Raji-Luc 細(xì)胞、Raji-Luc CD19 KO 細(xì)胞2 號(hào)單克隆、Raji-Luc CD19 KO 細(xì)胞20 號(hào)單克隆各1×105個(gè)，依次梯度稀釋為1×105，1×104，1×103，102個(gè)/ml 接種于96 孔白板中，每孔分別加入100μl Bright-LumiTM螢火蟲熒光素酶檢測(cè)試劑，反應(yīng)5min后，選擇化學(xué)發(fā)光模式，檢測(cè)各組各孔細(xì)胞的相對(duì)發(fā)光光度（relative light unit，RLU）。

1.3.7 Raji-Luc CD19 KO 細(xì)胞基因序列檢測(cè)：擴(kuò)大培養(yǎng)流式檢測(cè)篩選出的單克隆細(xì)胞，分別取適量原始的Raji-Luc，Raji-Luc CD19 KO 2 號(hào)、20 號(hào)單克隆細(xì)胞提取基因組，以此為模板分別PCR 擴(kuò)增出CD19 基因片段。引物序列為：FOR：5’-ATGCCA CCTCCTCGCCTC-3’，REV：5’-ACCTGGTGC TCCAGGTGC-3’，擴(kuò)增程序?yàn)椋孩?4℃，1min；②98 ℃，10s； ③55 ℃，15s； ④68 ℃，30s/kb；②③④30Cycles。將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送至金唯智測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3.8 熒光素酶化學(xué)發(fā)光法驗(yàn)證CAR-T 對(duì)Raji-Luc 和Raji-Luc CD19 KO 細(xì)胞的殺傷作用：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Raji-Luc 和Raji-Luc CD19 KO 細(xì)胞，以8×105個(gè)/ml 每孔50μl 的密度接種于96 孔白板中作為靶細(xì)胞。取適量實(shí)驗(yàn)室前期制備的Pan-T 以及CD19 CAR-T 和CD38 CAR-T 細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞[12-13]。各分為三個(gè)實(shí)驗(yàn)組：靶細(xì)胞+Pan-T 細(xì)胞組、靶細(xì)胞+CD19 CAR-T 細(xì)胞組、靶細(xì)胞+CD38 CAR-T 細(xì)胞組，每組分別設(shè)置效靶比為1∶1，1∶2，1∶4 和1∶8，各三個(gè)復(fù)孔。取適量CAR-T 和Pan-T 細(xì)胞，處理至合適密度，在上述96 孔板中每孔加入50μl CAR-T細(xì)胞或Pan-T 細(xì)胞，置于37℃，5ml/dl CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)。培養(yǎng)8h 后，分別在各組每孔加入100μl Bright-LumiTM螢火蟲熒光素酶檢測(cè)試劑，反應(yīng)5min 后，選擇化學(xué)發(fā)光模式，檢測(cè)各組各孔細(xì)胞的相對(duì)光單位（relative light unit，RLU），計(jì)算殺傷效率，計(jì)算公式：殺傷效率=1-（實(shí)驗(yàn)孔-空白孔）/（最大裂解孔-空白孔）×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建PB-CRISPR-CD19 sgRNA 質(zhì)粒 測(cè)序結(jié)果見圖1a，構(gòu)建所得四組PB-CRISPR-CD19 sgRNA 質(zhì)粒序列與預(yù)期序列一致，成功構(gòu)建PBCRISPR-CD19 sgRNA 質(zhì)粒，質(zhì)粒構(gòu)造見圖1b。

2.2 sgRNA1 序列效果最佳 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果見圖2。原始Raji-Luc 細(xì)胞CD19 表達(dá)率為98.52%，電轉(zhuǎn)染48h 后sgRNA1，sgRNA2，sgRNA3 和sgRNA4 四組細(xì)胞CD19 的表達(dá)率均低于原始Raji-Luc 細(xì)胞，分別為58.96%，65.81%，70.83%和67.78%。sgRNA1 的序列靶向性較強(qiáng)，并且電轉(zhuǎn)染過后細(xì)胞狀態(tài)最佳。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)四組sgRNA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞及Raji Luc 細(xì)胞CD19 的表達(dá)率

2.3 電轉(zhuǎn)染PB-CRISPR-CD19 sgRNA 質(zhì)粒成功制備Raji-Luc CD19 KO 細(xì)胞 流式細(xì)胞術(shù)鑒定結(jié)果見圖3a，極限稀釋法篩選得到的單克隆細(xì)胞株中2號(hào)單克隆和20 號(hào)單克隆細(xì)胞表面CD19 表達(dá)缺失，而CD38 表達(dá)正常。進(jìn)行凍存復(fù)蘇后，兩株單克隆細(xì)胞的CD19 表達(dá)依舊穩(wěn)定缺失，且兩組細(xì)胞電轉(zhuǎn)導(dǎo)效率均達(dá)到99%以上（即CD19 陰性，CD38 陽性細(xì)胞），見圖3b。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Raji-Luc CD19 KO 單克隆細(xì)胞表面蛋白表達(dá)情況

2.4 Raji-Luc CD19 KO 細(xì)胞與原始Raji-Luc 細(xì)胞的熒光素酶表達(dá)比較 經(jīng)酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果見圖4。2 號(hào)單克隆Raji-Luc CD19 KO 細(xì)胞和20 號(hào)單克隆Raji-Luc CD19 KO 細(xì)胞與原始Raji-Luc 細(xì)胞相比熒光素酶表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖4 Raji-Luc CD19 KO 細(xì)胞系熒光素酶檢測(cè)

2.5 單克隆Raji-Luc CD19 KO CD19 細(xì)胞表面抗原的表達(dá)敲除 測(cè)序結(jié)果見圖5。Raji-Luc CD19 KO 2號(hào)單克隆在CD19 基因處發(fā)生了大片段的堿基丟失，Raji-Luc CD19 KO 20 號(hào)單克隆細(xì)胞株的基因序列在該基因片段發(fā)生了小片段的丟失，兩個(gè)細(xì)胞株CD19 表面抗原的表達(dá)都被成功敲除。

圖5 原始Raji-Luc 細(xì)胞與CD19 KO 單克隆細(xì)胞基因序列對(duì)比圖

圖6 CAR-T 細(xì)胞對(duì)Raji Luc 及Raji-Luc CD19 KO 細(xì)胞的殺傷效率檢測(cè)

2.6 Raji-Luc CD19 KO 細(xì)胞不能激活對(duì)應(yīng)的CAR-T細(xì)胞 流式檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)室此前構(gòu)建成功的CD19 CAR-T 和CD38 CAR-T 細(xì)胞均出現(xiàn)明顯細(xì)胞分群，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率分別為72.4%和72.9%，見圖6a。熒光素酶測(cè)定殺傷效率實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)靶細(xì)胞為Raji-Luc 細(xì)胞時(shí)，CD19 CAR-T 與CD38 CAR-T 細(xì)胞殺傷能力相當(dāng)，且明顯強(qiáng)于Pan-T 細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.405～3.771，均P＜0.05），見圖6b。當(dāng)靶細(xì)胞為Raji-Luc CD19 KO 細(xì)胞時(shí)，CD19 CAR-T 細(xì)胞與Pan-T 細(xì)胞的殺傷能力相當(dāng)，CD38 CAR-T 細(xì)胞的殺傷能力明顯強(qiáng)于Pan-T 細(xì)胞和CD19 CAR-T 細(xì)胞（t=5.428～6.804，均P＜0.05），見圖6c。該結(jié)果表明敲除CD19 的Raji-Luc 細(xì)胞株不能激活對(duì)應(yīng)的CAR-T 細(xì)胞進(jìn)行殺傷。

3 討論

CD19 屬于免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）超家族的成員，位于16 號(hào)染色體短臂上(16p11.2)，在調(diào)節(jié)B 淋巴細(xì)胞選擇、激活和分化的細(xì)胞表面受體的信號(hào)傳導(dǎo)閾值中起到非常重要的作用。ENGEL等[14-15]人的研究表明CD19 的缺失會(huì)使小鼠外周血淋巴組織中B 細(xì)胞的數(shù)量明顯減少，B 細(xì)胞對(duì)有絲分裂原的增殖反應(yīng)明顯降低，血清免疫球蛋白水平也顯著降低。過表達(dá)CD19 的小鼠在骨髓早期B 細(xì)胞發(fā)育中存在明顯的缺陷，有絲分裂反應(yīng)增強(qiáng)，血清免疫球蛋白水平升高。

近年來，抗CD19 CAR-T 細(xì)胞在治療復(fù)發(fā)或難治性急性B 淋巴細(xì)胞白血病（B-cell acute lymphoblastic leukemia，B-ALL）和非霍奇金淋巴瘤（NHL）方面取得了快速而持久的顯著療效[16]。目前有700 多項(xiàng)相關(guān)臨床試驗(yàn)在 ClinicalTrials.gov中注冊(cè)，其中41%針對(duì)CD19。PAN 等[17-18]人指出，在現(xiàn)有抗CD19 CAR-T 細(xì)胞的治療過程中有相當(dāng)大比例的患者由于CD19 抗原的逃逸或表達(dá)下調(diào)，復(fù)發(fā)率顯著增加。RUELLA 等[19]人在臨床研究當(dāng)中發(fā)現(xiàn)，一例B-ALL 患者在接受抗CD19 CAR-T 細(xì)胞注入19 天后病情得到了完全緩解，但在治療后第261 天出現(xiàn)病情復(fù)發(fā)并最終死亡，該患者復(fù)發(fā)后的白血病細(xì)胞均異常表達(dá)抗CD19 CAR，無法檢測(cè)到CD19 的表達(dá)。

抗原逃逸現(xiàn)象的出現(xiàn)，迫使我們?nèi)ヌ骄咳绾问笴AR-T 細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞抗原丟失后仍然對(duì)其具有殺傷作用或是尋找更加合適的替代靶點(diǎn)[20]。ZHAO等[21]人開發(fā)了一種新型CD19/CD22/CD3 三特異性抗體，用于克服腫瘤免疫逃逸對(duì)CAR-T 的限制。DAI 等[22]人為了解決CD19 抗原丟失而造成腫瘤復(fù)發(fā)的情況，設(shè)計(jì)了一種靶向CD19 和CD22的雙特異性CAR-T 細(xì)胞用于治療成人B-ALL。然而，在上述的研究當(dāng)中，實(shí)驗(yàn)者均采用對(duì)比單抗原CAR-T 與多抗原CAR-T 對(duì)同一腫瘤細(xì)胞的殺傷情況來驗(yàn)證CAR-T 對(duì)于腫瘤的體外治療情況，并未通過產(chǎn)生CD19 抗原丟失的腫瘤細(xì)胞來進(jìn)行直接驗(yàn)證，本研究所構(gòu)建的Raji-Luc CD19 KO 細(xì)胞正是為此類研究提供了可以直接驗(yàn)證的模型支持，為后續(xù)研究者進(jìn)行補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)提供了研究對(duì)象。

CRISPR/Cas9 是繼ZFN，TALENs 等基因編輯技術(shù)推出后的第三代基因編輯技術(shù)，在基因敲入、基因敲除、堿基突變等方面更加快速高效和便捷。近年來，CRISPR/Cas9 技術(shù)也被應(yīng)用于構(gòu)建各種細(xì)胞系以滿足不同領(lǐng)域的研究，解決了很多在過去的科研過程中無法克服的困難[23]。黃小琴等[24]人通過CRISPR/Cas9 系統(tǒng)構(gòu)建了敲除AMPKα1的A549 和H460 肺癌細(xì)胞的細(xì)胞株，為后續(xù)研究AMPKα1 對(duì)于肺癌的促癌機(jī)制提供了細(xì)胞模型。盡管CRISPR/Cas9 在腫瘤治療研究方面顯示出光明的前景，但它依賴DSB 刺激基因編輯過程可能會(huì)破壞其安全性，其基因敲除的隨機(jī)性可能會(huì)產(chǎn)生新的基因型，其中一些可能會(huì)產(chǎn)生潛在致病后果[25]。在本研究中，篩選最適的sgRNA 彌補(bǔ)了CRISPR/Cas9 質(zhì)粒敲除效率不一致的缺點(diǎn)，通過篩選單克隆以及基因測(cè)序解決了敲除隨機(jī)性的問題。并且在敲除CD19 后仍不影響細(xì)胞原始熒光素酶基因的表達(dá)，這為后續(xù)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中對(duì)腫瘤進(jìn)行長(zhǎng)期觀察提供了檢驗(yàn)手段。