昆布多糖的復合酶法提取工藝優化及其對α-葡萄糖苷酶的抑制活性

張 涵，殷 澳，張會佳，侯相竹，高 陽, ，徐多多,

（1.長春中醫藥大學人參科學研究院，吉林長春 130117；2.長春中醫藥大學藥學院，吉林長春 130117）

昆布是海帶科植物海帶或翅藻科植物昆布（鵝掌菜）的干燥葉狀體，可化痰軟堅散結，有利水消腫之效，同時兼具食用藥用雙重價值[1]。隨著海洋生物資源的不斷開發，昆布作為重要的海洋產物，其生物活性價值引起了國內外學者的關注[2]，我國對昆布的研究主要集中在昆布多糖（Laminarin）、褐藻膠、粗提碘等方面[3]。昆布多糖是昆布最主要活性成分之一[4]，由D-吡喃葡萄糖通過β-1,3 糖苷鍵連接而成，具有三螺旋結構。多糖的組成及結構對其藥理活性具有一定影響[5-6]，如昆布多糖可以加速膽固醇的代謝和轉化，同時還可促進胰島素的分泌，起到降血糖降血脂的作用[7-8]；低分子量的巖藻聚糖硫酸酯片段抗凝血效果良好，且硫酸化程度越高抗凝血活性越高[9]，抗血栓活性也越明顯[10]；除此之外昆布多糖還具有抗氧化[11]、抗腫瘤[12]、抗病毒[13]、抗細菌[14]等藥理活性，滿足人們對保健和醫藥的需求[15]。

多糖的提取方法包括熱水浸提法[16]、酸提取法[17]、超聲浸提法[18]和酶法提取[19]等，或組成聯合提取方法，如超聲輔助酶法[20]、微波輔助酶法[21]、微波輔助酸液[22]等，輔助聯合法可在一定程度上彌補單一提取方法的不足，更大程度提高多糖得率。現有的提取方法會存在一些局限，傳統水提操作繁瑣且得率較低[23]，酸提取和超聲提取易破壞多糖的結構[24]；相比之下，酶提法成本較低、效率更高，可充分保留多糖的生理活性[25]。一是因為酶可與底物特異性結合，減少溶出阻力[26]。二是酶解法可將多糖分解成分子量較小的片段，增加多糖溶出率[27]。單一酶解與復合酶提取效果差別較大[28]，因復合酶間具有協同作用[29]，若僅是探究復合酶添加量對得率的影響而忽略復合酶間的相互作用，多糖得率則會明顯降低。若僅考慮復合酶比例而忽略酶活性等影響易造成多糖活性差、得率低的結果[30]。纖維素酶和果膠酶可降解植物細胞壁，木瓜蛋白酶可將細胞膜上的蛋白質酶解消化[31]，利于多糖溶出。綜上，本文先選擇纖維素酶、果膠酶和木瓜蛋白酶組成復合酶，通過正交試驗確定其最佳配比，再選用響應面法以酶解時間、溫度、液料比、pH 為影響因素優化提取工藝，并探究昆布多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制作用，為昆布多糖的綜合開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

昆布藥材 安徽毫藥干草國藥股份有限公司，批號：1 902013；纖維素酶（50 U/mg）、果膠酶（500 U/mg）、木瓜蛋白酶（800 U/mg）、α-葡萄糖苷酶（100 U/3.8 mg）、阿卡波糖、對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）

上海源葉生物科技有限公司；巖藻糖 Toronto Research Chemicals；半乳糖醛酸（25 g）FLUKA 公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（500 次）上海碧云天生物技術有限公司；明膠（99%）、氯化鋇（99%）、硫酸鉀（AR，99%）上海麥克林生化科技股份有限公司；無水碳酸鈉、氫氧化鈉、鹽酸、檸檬酸、溴化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉 成都市科隆化學品有限公司。

UV745N 型紫外分光光度計 上海佑科儀器儀表有限公司；M200pro 型酶標儀 熱電科技儀器有限公司；BSA224S-CW 型電子天平 賽多利斯科學儀器有限公司；SHY-2A 型數顯水浴恒溫振蕩器 常州普天儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 復合酶提取昆布多糖工藝流程 參考王歆彤等[32]的方法并稍作修改，先將昆布干燥粉碎過40 目篩，取5 g 昆布粉末于錐形瓶中加入一定體積純水，通過檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖鹽溶液調節pH，添加最佳配比的復合酶（纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶）于一定溫度下通過搖床水浴酶解一定時間，沸水滅酶15 min，4000 r/min 離心10 min 后取上清定容，苯酚硫酸法測定并計算多糖得率。提取液濃縮至原體積的1/5，在提取液中加95%乙醇直至乙醇濃度達80%，3000 r/min 離心5 min 取沉淀，凍干后可得昆布多糖粉末。

1.2.2 復合酶添加量配比優化

1.2.2.1 單因素實驗 各單因素實驗固定條件均為：昆布粉末5 g、液料比40:1（mL/g）、pH6.0、50 ℃、酶解2.5 h，按照1.2.1 方法，分別考察纖維素酶（90、100、110、120、130 mg）、果膠酶（70、80、90、100、110 mg）、木瓜蛋白酶（45、50、55、60、65 mg）對昆布多糖得率的影響。

1.2.2.2 對比復合酶與單酶的提取效果 研究纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶三種單酶的最適添加量及復合酶（1.2.2.1 中三種酶上述最適添加量相加總和）對昆布多糖得率的影響。

1.2.2.3 正交試驗設計 在單因素實驗的基礎上，以纖維素酶（A）、果膠酶（B）和木瓜蛋白酶（C）添加量為自變量，以昆布多糖得率為因變量，進行三因素三水平正交試驗，確定復合酶最佳配比，試驗設計見表1。

表1 復合酶添加量正交試驗Table 1 Orthogonal test of complex enzyme dosage

1.2.3 復合酶提取昆布多糖工藝參數優化

1.2.3.1 單因素實驗 各單因素實驗固定條件均為：昆布粉末5 g、添加最佳配比復合酶、酶解時間2 h、pH6、液料比40:1 mL/g、溫度50 ℃，分別考察酶解時間（0.5、1、1.5、2、2.5、3 h）、液料比（10:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1 mL/g）、pH（4、4.5、5、5.5、6、6.5）和溫度（30、40、50、60、70 ℃）的影響。

1.2.3.2 Box-Behnken 響應面優化試驗設計 在單因素實驗基礎上，選擇時間（A）、pH（B）、液料比（C）和溫度（D）作為Box-Behnken 響應面的4 個影響因素，進行四因素三水平的響應面優化試驗，建立自變量與昆布多糖得率（Y）之間的函數關系，響應面試驗設計見表2。

表2 復合酶提取工藝響應面試驗因素與水平Table 2 Test factors and levels of response surface of complex enzyme extraction technology

1.2.4 昆布多糖得率計算

1.2.4.1 標曲的制作 參考溫思萌等[33]的方法并稍作修改，選擇以巖藻糖為標準品，準確稱取巖藻糖標準品10 mg 溶于100 mL 容量瓶中配成標準品溶液，分別吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，加水補足至1.0 mL，先后加入5%苯酚溶液1.0 mL 和濃硫酸5.0 mL，于484 nm 處通過紫外分光光度計測定吸光度。以吸光度值為縱坐標，巖藻糖濃度為橫坐標，得到巖藻糖標準回歸曲線y=6.8626x+0.0019，R2=0.9999。

1.2.4.2 多糖的測定及得率計算 將提取液測定的吸光度值代入巖藻糖的標準曲線，得昆布多糖得率（Y）計算公式：

式中：C：待測樣液中多糖的質量濃度（mg/mL）；V：待測樣液的體積（mL）；F：待測樣液的稀釋倍數；M：昆布粉末的質量（g）。

1.2.5 傳統水提法與優化后復合酶提法的比較

1.2.5.1 昆布多糖的制備 復合酶提法：取5 g 昆布粉末，按照1.2.3.2 項下優化后的復合酶提取最佳工藝酶提昆布多糖，沸水滅酶15 min，4000 r/min 離心10 min 取上清，定容至300 mL，按照1.2.4 項下方法測定昆布多糖得率，重復三次實驗取平均值。

傳統水提法：取5 g 昆布粉末，固定實驗條件（溫度、pH、液料比和時間）與復合酶法最佳提取工藝相同的條件水提昆布多糖，4000 r/min 離心10 min 取上清，定容至300 mL，按照1.2.4 項下方法測定昆布多糖得率，重復三次實驗取平均值。

1.2.5.2 昆布多糖理化性質測定 采用苯酚-硫酸法以巖藻糖為標準品測定中性糖含量[34]；采用間羥基聯苯法以半乳糖醛酸為標準品測定酸性糖含量[35]；通過BCA 法以牛血清白蛋白為標準品測定蛋白質含量[36]；采用明膠-氯化鋇法以恒重硫酸鉀為標準品測定巖藻糖硫酸酯含量[37]。

1.2.6 抑制α-葡萄糖苷酶活性實驗 參考張艷秋等[38]方法并稍作修改。采用PBS 緩沖液（pH6.8）配制系列濃度的昆布多糖和阿卡波糖溶液（均為1～5 mg/mL）。各取40 μL 樣液至96 孔板中，加入0.04 U/mL 的α-葡萄糖苷酶溶液40 μL 后于37 ℃孵育5 min，加入0.5 mmol/L 的PNPG 溶 液20 μL 后 于37 ℃孵 育30 min；加入0.1 mol/L 的碳酸鈉溶液100 μL 終止反應。以40 μL PBS 緩沖液代替α-葡萄糖苷酶溶液重復上述實驗作為背景對照組，以40 μL PBS 緩沖液為空白對照組。在405 nm 處測定各孔的光密度值（OD），重復三次取平均值，計算抑制率。

1.3 數據處理

選擇IBM SPSS Statistics 25 和Design-Expert 13 軟件進行統計分析，采用Origin 2021 繪圖，通過GrapHPad prism 9 計算IC50值。

2 結果與分析

2.1 復合酶添加量配比優化

2.1.1 單因素實驗結果 纖維素酶和果膠酶可消化植物細胞壁使其水解成葡萄糖，且不會影響細胞內部的纖維素骨架，充分保留多糖的結構和活性，木瓜蛋白酶可溶解糖蛋白中的蛋白質[39]，故復合酶種類選擇以上三種。各酶添加量對昆布多糖得率的影響見圖1。三種單酶的多糖得率在所測濃度范圍內都呈現先上升后下降的趨勢，因為增加酶的添加量可使酶解反應更加完全，酶解出的多糖含量更多；繼續增加酶的濃度，多余的酶會與底物競爭，導致一定量的酶會被消耗[40]，多糖的得率下降。破壞昆布細胞壁是增加多糖溶出率的關鍵，因此纖維素酶和果膠酶提取的多糖得率略高，且效果差距較大。通過單因素實驗結果確定各單酶最佳添加量：纖維素酶110 mg、果膠酶90 mg、木瓜蛋白酶55 mg。

圖1 三種單酶添加量對昆布多糖得率的影響Fig.1 Effect of three single enzyme supplemental levels on the yield of laminarin

2.1.2 復合酶與三種單酶提取的多糖得率 三種單酶與復合酶提取昆布多糖得率的對比如圖2 所示，復合酶提取的昆布多糖得率都顯著高于三種單酶（P<0.05），分別比纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶高出4.55%、6.46%、7.34%。故選擇復合酶提取昆布多糖。

圖2 三種單酶與復合酶提取昆布多糖的得率對比Fig.2 Yield of laminarin by three single enzymes and compound enzymes

2.1.3 復合酶添加量比例優化正交試驗結果 正交試驗周期短、次數少，因子選擇區間固定在試驗結果波動范圍內，可以迅速找到各水平最佳組合，結果直觀。正交試驗結果見表3，方差分析結果見表4，由表4 可知，正交試驗的P值<0.01，說明復合酶配比對多糖得率的影響極顯著，且三種單酶產生的影響也均為極顯著（P<0.01）。通過表3 的R 值得出果膠酶的影響效果最強，其次為木瓜蛋白酶，纖維素酶的影響效果最弱；根據k 值分析出最佳復合酶配比為A1B2C2，即復合酶最佳比例為纖維素酶100 mg、果膠酶90 mg、木瓜蛋白酶55 mg，下述的響應面優化探究最佳工藝時復合酶添加量即為最佳配比。

表3 正交試驗設計與結果Table 3 Orthogonal experiment design and results

表4 正交試驗的方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments

2.2 復合酶法提取工藝優化

2.2.1 單因素實驗結果 時間、液料比、pH 及溫度對昆布多糖得率的影響見圖3，除液料比外其余三個影響因素的昆布多糖得率在測定范圍內均呈現先升后降趨勢，液料比對昆布多糖得率的影響是在測定范圍內先上升后保持穩定。如圖3a 所示，昆布多糖得率在1.5 h 處達到最大值，繼續增加酶解時間，多糖得率開始下降，因為酶解時間過長會破壞部分多糖的結構[41]；多糖得率在10:1 到60:1 mL/g 范圍內隨液料比增加而先增加后保持不變（圖3b），溶液體積增加，溶劑的擴散速率加快，多糖溶出量增加[42]；溶液體積過多時細胞全部漲破，多糖溶出率不會再發生變化[43]。昆布多糖的得率在pH6、溫度50 ℃時達到峰值（圖3c 和圖3d）。pH 和溫度都是影響酶活性的關鍵因素，酶解反應不完全將導致多糖的得率變低，復合酶在弱酸性條件下有較好的酶解效果，三種酶各自有最適溫度和pH，溫度和pH 超過酶的活性范圍則酶解反應不完全，將導致多糖的得率變低[44]。圖3可得各影響因素的單因素選擇結果：時間1.5 h、液料比50:1 mL/g、pH6、溫度50 ℃。

圖3 四個考察因素對提取昆布多糖得率的影響Fig.3 Influence of four factors on the yield of laminarin

2.2.2 復合酶提取多糖工藝響應面優化結果 相較于正交試驗的最優結果只能是某種組合，且在初步篩選時難以確定變化規律，而響應面試驗靈活準確，可分步進行，若設定的目標或水平偏差較大可及時進行調整，得到的模型結果也可預測目標的變化及規律。響應面優化結果見表5，采用Design-Expert 8.0.6 軟件進行二元多次回歸擬合，得到回歸方程：Y=18.00+0.1383A+0.1183B+0.2550C-0.1567D+0.3000 AB+0.1625AC-0.1275AD+0.0700BC+0.0100BD+0.0525CD-0.2706A2-0.5631B2-0.2306C2-1.24D2。

表5 響應面試驗設計及結果Table 5 Response surface test design and results

回歸模型方差及結果見表6，回歸模型的P值<0.0001，該模型極顯著；回歸方程失擬項的P值>0.05，不顯著，該模型可信度高；調整決定系數R2Adj為0.9776，即昆布多糖得率的變化規律有97.76%的概率可由該模型解釋；變動系數CV=5.95%，模型與實際實驗擬合性較好，該模型可用于預測昆布多糖提取工藝優化的試驗。通過分差分析表可知，各因素對多糖得率的影響大小為：C>D>A>B；各因素兩兩間的相互作用AB、AC、AD 對多糖得率具有顯著影響（P<0.05）；各單因素以及單因素的平方對多糖得率的影響都具有極顯著作用（P<0.01）。

表6 回歸模型方差及結果Table 6 Variance and results of regression model

各因素對響應值的影響結果見圖4，根據圖4a可知時間較pH 等高線更呈橢圓形，時間對多糖得率的影響比較強烈，二者交互作用顯著；由圖4b 分析得出液料比較時間的等高線各曲線之間較密集，液料比對多糖得率的影響較明顯；由圖4c 觀察出溫度與時間的響應曲面坡度較陡峭，溫度對多糖得率的影響較大；因此液料比對昆布多糖得率的影響最顯著，其次分別是溫度、時間、pH。由圖可以得出，兩因素間交互作用的影響從大到小排列：AB>AC>AD>BC>CD>BD，與方差分析結果一致。

圖4 響應面等高線圖與三維圖Fig.4 The contour map and 3D map of response surface

2.2.3 工藝驗證 根據方程得到復合酶提的優化工藝為酶解時間1.8 h、pH6.1、液料比59:1 mL/g、酶解溫度49.4 ℃，預測多糖得率為18.183%。通過三次重復實驗測定實際的昆布多糖得率為18.19%±1.04%，實測值與預測值接近，即響應面優化復合酶提取昆布多糖的工藝切實可靠。

2.3 復合酶法與傳統水提昆布多糖的比較

5 g 昆布粉末通過復合酶提取得到凍干的多糖粉末1.4 g，提取的昆布多糖中的中性糖、酸性糖、硫酸根、蛋白質含量分別為52.72%、11.76%、19.49%、2.66%，多糖平均得率18.19%±1.04%。傳統水提多糖得率5.28%±0.34%，復合酶法是其3.44 倍，魏碧娜[45]通過傳統水提法得到的海帶多糖得率2.5%，程仕偉等[46]采用水提法提取的海帶多糖得率4.99%，高潔[47]歸納比較七種不同提取方法對海帶多糖得率的影響，結果發現復合酶法提取的多糖得率是水提法的2.36 倍。水提的昆布多糖中的中性糖、酸性糖、硫酸根、蛋白質的含量分別為13.93%、1.82%、17.71%、5.03%，以活性成分含量為指標，傳統水提法除蛋白質含量外均低于復合酶法提取的昆布多糖，即選擇提取效果更好的復合酶法。

2.4 昆布多糖抑制α-葡萄糖苷酶活性結果

α-葡萄糖苷酶抑制劑是治療糖尿病的常用藥物，現有的降糖藥售價高、不耐受，找到有效藥物抑制劑則是重中之重[48]，研究發現食用藻類對α-葡萄糖苷酶具有抑制作用[49]。昆布多糖抑制α-葡萄糖苷酶活性的實驗結果見圖5，昆布多糖在1～5 mg/mL 范圍內對α-葡萄糖苷酶的抑制率隨著濃度的增大而增大，最大抑制率為79.04%±3.17%。昆布多糖的IC50值為1.443 mg/mL，小于阿卡波糖的IC50值1.851 mg/mL。昆布多糖對α-葡萄糖苷酶具有抑制作用。

圖5 昆布多糖抑制α-葡萄糖苷酶活性實驗結果Fig.5 Experimental results of inhibiting α-glucosidase activity of laminarin

3 結論

本實驗通過先正交試驗再響應面優化得到了復合酶法提取昆布多糖的最佳工藝參數：取5 g 昆布粉末加入295 mL 純水，通過緩沖液將pH 調至6.1，加入100 mg 纖維素酶、90 mg 果膠酶和55 mg 木瓜蛋白酶，搖床水浴加熱至49.4 ℃酶解1.8 h，在此優化工藝下驗證實驗的多糖得率為18.19%±1.04%，與預測值18.183%接近，是傳統水提多糖得率的3.44倍，測定的糖含量、硫酸酯基等活性物質也明顯高于傳統水提。復合酶法多糖得率高，效率快，可提取出低分子量的多糖增加藥理活性。昆布多糖對α-葡萄糖苷酶具有明顯抑制作用，在5 mg/mL 達到最大抑制率為79.04%±3.17%，因此具有潛在降糖功效，為昆布在食品和醫藥領域應用提供了參考。