果膠酶與半纖維素酶復合酶解制備費約果果汁的工藝優化

李遠蓬，朱棚偉，何 慧，謝雨彤，翁 靜，陳其陽，王 丹

（西南科技大學生命科學與工程學院，四川綿陽 621010）

費約果（Acca sellowiana（O.Berg）Burret）是一種桃金娘科南美稔屬的多年生亞熱帶常綠灌木類植物，廣泛種植于巴西、阿根廷、智利等國家[1]。近年來，費約果已被我國成功引進并在四川、上海、江蘇等地種植。費約果果實富含維生素、礦物質、膳食纖維和酚類等成分，具有抗菌、抗癌、抗氧化等生物活性，在食品﹑藥品﹑化妝品等諸多領域的應用前景廣闊[2]。然而，費約果儲存壽命短，在成熟期和采后貯藏過程中易受微生物影響，易腐敗變質；因此，開展費約果深加工處理具有重要意義[3]。目前，已開發的費約果相應的加工產品包括酸奶、果汁、冰淇淋、餡餅、果醬和利口酒等。

果汁不僅能夠保留水果中的原有風味、生物活性和營養物質，而且口感好，因此市場發展越來越迅速[4]。由于費約果果漿汁中含有酚類物質、果膠、半纖維素、淀粉衍生物、單寧及微生物等物質[5]，在加工中若未除去，這些物質會使費約果果汁在加工及貯存過程中產生沉淀，造成費約果果實出汁率和可溶性固形物含量降低[6]。而高出汁率是果汁生產的一個重要目的[7]，特別是對于價格昂貴且可食率較低的費約果。半纖維素和果膠是水果果實的主要成分[8]，所以在果汁生產研究中常常采用半纖維素酶和果膠酶復合處理原汁[9-10]。酶解處理可以降低果膠、半纖維素分子，降低果汁的粘性和稠度[11]，同時破壞果實細胞壁網絡，從而提高果汁的出汁速率和澄清度等[12]。并且相比于其他方法更加方便、有效[13]。因酶解具有專一性、特異性、成本低、無有機殘留等優點，所以現如今復合酶解果汁的現狀相對成熟[14]。酶輔助提取因其具有高效、環境友好、易于操作等優點在食品工業中常被廣泛應用，同時與未經處理的果汁相比，有效提高了可溶性固形物、提取率和抗氧化能力，可顯著增加其商業價值[15]。在菠蘿蜜和香蕉汁中，復合酶比單一酶處理更有效，這歸因于不同類型酶的協同作用[16]。目前，關于單酶或復合酶對費約果及其果汁的相關研究還未見報道。

本實驗以出汁率和可溶性固形物含量為主要指標，研究了復合酶（半纖維素酶和果膠酶）添加比例、添加量、酶解時間和酶解溫度對費約果果汁出汁率和可溶性固形物的影響，并在單因素的基礎上，對其進行四因素三水平的響應面優化試驗，以確定復合酶提取費約果果汁的最佳工藝。本研究通過改變酶解條件，最大程度發揮酶的作用，旨在達到降低果汁粘度、改善外觀和提高營養價值等的目的，為費約果果汁規模化生產提供理論依據和技術參數。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

費約果（Acca sellowiana（O.Berg）Burret）2022 年11 月初采摘自西南科技大學果園，商業成熟（可溶性固形物含量為10.5%～11.5%），挑選無損傷、無病害的果實用于實驗；果膠酶（30000 U/mg）、半纖維素酶（20000 U/mg）諾維信公司；抗壞血酸（純度>99%）、2,6-二氯酚靛鈉（純度>99%）、福林酚（純度>98%）、無水碳酸鈉（純度>98%）、沒食子酸（純度>99%）麥克林公司。

UV752 紫外可見分光光度計 上海佑科儀器儀表有限公司；Centrifuge 5804/5804 R 高速離心機德國eppendorf；RHCX-350 唯能超聲恒溫水浴鍋濟寧榮匯超聲波設備有限公司；BSA223S 型電子天平 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；HR2003 型勻漿機 飛利浦家庭電器有限公司；WYT-4 型手持糖量儀 上海精密儀器儀表有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 費約果果汁提取工藝 果汁的提取參考彭凌等[17]的方法，將干凈的費約果去皮后，用HR2003 型勻漿機打漿（10000 r/min，1 min）得到費約果果漿，離心獲得的果汁設置為對照組（CK），其出汁率為35.8%±0.5%；酶解后的果汁是將費約果果漿進行滅菌處理后，稱取5 mL 果漿原料，進行單因素實驗后，離心（5000 r/min，10 min）分離得到的澄清費約果果汁。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 復合酶比例對出汁率和可溶性固形物（TSS）的影響 半纖維素酶與果膠酶的體積比例設定為3:1、2:1、1:1、1:2、1:3，加酶量為18 g/L，充分混勻后在55 ℃下酶解1 h，考察復合酶比例對出汁率和TSS 的影響[10]。設置三個重復。

1.2.2.2 復合酶添加量對出汁率和TSS 的影響 采用1.2.2.1 獲得的最佳復合酶比例，復合酶添加量設定為6、12、18、24、30 g/L，充分混勻后在55 ℃下酶解1 h，考察復合酶添加量對出汁率和TSS 的影響。設置三個重復。

1.2.2.3 酶解時間對出汁率和TSS 的影響 根據上述結果設置最佳復合酶比例和添加量，在55 ℃下設置不同的酶解時間：30、60、90、120、150 min，考察酶解時間對出汁率和TSS 的影響。設置三個重復。

1.2.2.4 酶解溫度對出汁率和TSS 的影響 根據上述結果設置最佳復合酶比例、復合酶添加量和酶解時間，建立不同的酶解溫度：40、45、50、55、60 ℃，考察酶解溫度對出汁率和TSS 的影響。設置三個重復。

1.2.3 響應面試驗 在單因素實驗的基礎上，采用Box-Behnken 試驗設計方案，以A：酶解時間（min）、B：酶解溫度（℃）、C：加酶量（g/L）和D：酶解比例（半纖維素酶/果膠酶）四個因素為變量，果汁出汁率（R1）和TSS（R2）為響應值，響應面試驗因素編碼及水平如表1 所示。每組試驗設置三個重復。

表1 Box-Behnken 設計試驗因素及水平Table 1 Factors and levels of the Box-Behnken design

1.2.4 費約果果汁出汁率測定 果汁出汁率的計算參考楊輝等[18]的方法，按下式計算：

式中，m 為果肉總質量，g；M 為果實總質量，g；m1為果汁總質量，g；m2為打漿所用果肉總質量，g。

1.2.5 TSS 含量的測定 采用手持糖量儀進行測定。取一滴果汁均勻涂在干凈的棱鏡上，輕輕合上蓋板使溶液遍布棱鏡表面，對準光源或明亮處讀取數據。平行操作三次。

1.2.6 費約果果汁透光率測定 取加酶處理和未加酶處理的原汁各5 mL，采用分光光度計法，以透光率為澄清度指標，蒸餾水為對照，測定波長300～1000 nm掃描（各波長間隔為50 nm）。

1.2.7 抗壞血酸（VC）含量測定 參考趙曉梅等[19]的方法，采用2,6-二氯酚靛酚進行滴定。準確吸取5 mL 費約果果汁原液后加入5 mL 草酸溶液（1%），用2,6-二氯酚靛酚染料進行滴定，待溶液至微紅色且半分鐘之內不褪色即為滴定終點，記錄滴定液消耗量。平行操作三次。同時作空白對照，根據公式計算VC含量。

式中：V1為滴定樣品提取液時消耗的染液溶液量，mL；V2為滴定空白時消耗的染料溶液量，mL；T 為1 mL 染料溶液相當于抗壞血酸的毫克數；W 為滴定時所取的濾液中含樣品的量，g。

1.2.8 總酚含量測定 參考Sato 等[20]的方法，準確吸取0.4 mL 原汁并加入0.4 mL 福林酚試劑，充分震蕩搖勻后靜置3 min，再加入0.04 mL 飽和NaCO3溶液，用蒸餾水稀釋定容到8 mL，經充分振蕩后靜置于暗處1 h 后，在700 nm 波長下測定其的吸光值。配制不同濃度沒食子酸溶液，按上述方法測定700 nm處的總酚值，并繪制標準曲線：OD700=0.0023C標準品+0.0278，R2=0.9986。

1.3 數據處理

本實驗每組數據平行測定三次。數據用“平均值±標準差”來表示；采用Excel 數據處理系統和SPSS 12.0 統計分析軟件（IBM，美國）進行數據整理與分析；用Ducan’s multiple comparison 方法進行顯著差異性分析，P<0.05 表示差異顯著；用OriginPro 8.1 繪制數據圖。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果分析

2.1.1 不同復合酶添加比例對果汁出汁率和TSS 的影響 由圖1 可以看出隨著復合酶（半纖維素酶/果膠酶）添加比例的增加，果汁出汁率和TSS 均先上升后下降，當復合酶添加比例在2:1，二者均達到最大值，分別為73.33%、14.73%。這是因為果汁的出汁率歸因于果膠的水解，而復合酶能破壞費約果中的果膠結構，導致果肉組織軟化，使果汁釋放出來[21]。此外，TSS 的提高與組織降解程度較高有關，復合酶促進糖、酸釋放量增加[22]。但隨著果膠酶比例的增多出汁率和TSS 反而下降，其原因可能是酶的進一步水解使得費約果中蛋白質類物質的析出變性沉降影響了出汁率和TSS[23]。綜合出汁率和TSS 的變化，選取復合酶比例為2:1 進行后續試驗。

圖1 復合酶添加比例對果汁出汁率和TSS 的影響Fig.1 Effect of compound enzyme addition ratio on juice yield and TSS

2.1.2 不同復合酶添加量對果汁出汁率和TSS 的影響 由圖2 可以看出，在復合酶添加量為6～18 g/L的區間內，隨著復合酶添加量增大，費約果果汁的出汁率、TSS 也隨之增加，當復合酶添加量為18 g/L時，二者均達到最大值，分別為72.33%、14.53%。復合酶量的逐漸增加，酶促反應速度加快，果膠迅速溶解，果汁的出汁率[24]、可溶性固形物含量逐漸增加[25]。但當復合酶添加量大于18 g/L 后，出汁率呈現遞減趨勢，說明復合酶制劑與果膠類物質達到飽和，果汁浸出受阻，使得液泡內的果汁難以被釋放出[26]。而TSS 趨于平緩，說明此時果汁溶液體系中存在大量被酶解的果膠質，由于其不斷吸附累積沉淀，導致可溶性固形物溶出減少[27]。同時酶與底物具有一定的飽和度，當酶添加量過高時，會降低酶解速率，且高濃度的酶還會引起資源浪費，成本增加[28]。綜合出汁率和TSS 的變化，選取復合酶添加量為18 g/L 進行后續試驗。

圖2 復合酶添加量對果汁出汁率和TSS 的影響Fig.2 Effect of compound enzyme supplemental level on juice yield and TSS

2.1.3 不同酶解時間對果汁出汁率和TSS 的影響由圖3 可知，在30～90 min 內，隨著酶解時間的延長，果肉細胞在復合酶作用不斷被分裂，果膠組織也被水解，使得出汁率逐步提升，在90 min 時達到最大值為74.67%。而酶解時間的持續增加，其呈下降趨勢，一方面因為酶解時間的延長導致部分酶失活，酶促反應終止；另一方面因為果汁中果肉細胞組織及果膠基本被分解[29]。在同一時間段內，復合酶持續水解，費約果內果膠物質被水解，TSS 持續溶出，呈上升趨勢，最大值為13.17%。但是酶解超過90 min后，酶解反應趨于平衡TSS 不再溶出，達到飽和狀態[30-31]。所以綜合出汁率和TSS 的變化，選取酶解時間為90 min 進行后續試驗。

圖3 酶解時間對果汁出汁率和TSS 的影響Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis time on juice yield and TSS

2.1.4 不同酶解溫度對果汁出汁率和TSS 的影響由圖4 可知，在40～55 ℃內，由于溫度的升高此時達到了復合酶的最適溫度，酶解速率加快出汁率大幅提升，在55 ℃時達到最大值為72.33%。但其溫度的持續上升，使得酶蛋白變性，復合酶失去活性，酶解速率降低，出汁效率大幅下降[22,32]。TSS 的溫度變化范圍同出汁率相似，隨著溫度的升高復合酶活性增大，酶促反應速率提高，TSS 溶出速率加快，在55 ℃時達到最大值為14.93%。但當溫度超過55 ℃時，由于酶中氫鍵等非共價鍵因為高溫的原因導致斷裂，復合酶中蛋白質變性，復合酶失活，使得TSS 溶出受限呈現下降趨勢[33]。綜合出汁率和TSS 的變化，選取酶解溫度55 ℃進行后續試驗。

圖4 酶解溫度對果汁出汁率和TSS 的影響Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on juice yield and TSS

2.2 響應面試驗結果分析

2.2.1 響應面試驗結果 在單因素實驗的基礎上，根據Box-benhnken 試驗設計原理進行響應面設計試驗。試驗結果見表2，并用Design-Expert10.0.1 對試驗結果進行分析。

表2 Box-Behnken 設計方案及費約果果汁出汁率和可溶性固形物的測定結果Table 2 Box-Behnken design scheme and determination results of juice yield and soluble solids of feijoa fruit juice

2.2.2 出汁率和可溶性固形物模型方差分析及顯著性檢驗 對表2 中以出汁率和可溶性固形物為響應值，通過Design-Expert10.0.1 軟件對響應值與各因素的編碼值進行回歸擬合后，得到出汁率回歸方程：Y1=0.74-5.56E-004A+2.50E-003B-5.56E-0.04C+6.39E-0.03D-1.67E-003AB-2.50E-0.03AC-7.50E-0.03AD+6.67E-0.03BC+5.83E-0.03BD-2.50E-0.03 CD-0.03A2-0.02B2-0.03C2-0.03D2

同理對表2 中以出汁率和可溶性固形物為響應值，通過Design-Expert10.0.1 軟件對響應值與各因素的編碼值進行回歸擬合后，得到可溶性固形物回歸方程：Y2=15.23+0.03A+0.52B+0.41C+0.08D+0.08 AB+0.22AC+0.19BC+0.19AD+0.04BD-0.25CD-0.14 A2-0.49B2-0.25C2-0.07D2

從表3 可以看出，所得的Y1和Y2回歸方程為極顯著（P<0.01），并且出汁率和TSS 失擬檢驗均不顯著，分別為0.9462 和0.4555，說明兩個回歸模型區域理性化，所以用方程Y1和Y2擬合4 個因素與出汁率和TSS 之間的關系是可行的。其中出汁率模型的R2=0.8978 和TSS 模型的R2=0.9040，說明兩個模型擬合度較好。出汁率和TSS 回歸方程系數顯著性檢驗表結果顯示（表3）二次項（A2、B2、C2和D2）對果汁出汁率有極顯著影響（P<0.01）；線性項（B、C）和二次項（B2）對果汁TSS 有極顯著影響（P<0.01），二次項（C2）對果汁TSS 有顯著影響（P<0.05）；對果汁出汁率和TSS 影響的交互項分析發現，所有因素的交互作用均不顯著。綜合以上分析得知：酶解溫度和加酶量對TSS 影響較大。兩個模型與實際情況擬合較好，可用于預測出汁率和可溶性固形物的變化情況。

表3 出汁率和可溶性固形物回歸方程系數顯著性檢驗表Table 3 Test table for significance of regression equation coefficient of juice yield and TSS

2.2.3 響應面圖分析 圖5 和圖6 為各因素（酶解時間、酶解溫度、加酶量和加酶比例）交互作用對費約果果汁出汁率和TSS 的影響，曲線陡峭程度反映了操作條件對于響應值的影響。從圖5C 可知，加酶比例和酶解時間的坡度較陡峭，說明兩者相較其他交互因素對費約果果汁的出汁率影響更大；其次是加酶量和酶解溫度（圖5D）。從圖6F 可以看出，加酶比例和加酶量交互作用對費約果果汁的TSS 具有較大的影響，而圖6B 中酶解時間和加酶量的坡度也相對較陡峭。

圖5 四因素對果汁出汁率影響的響應面圖Fig.5 Response surface diagram of influence of four factors on juice yield

圖6 四因素對果汁可溶性固形物影響的響應面圖Fig.6 Response surface diagram of influence of four factors on TSS

2.3 最佳工藝參數及驗證

通過計算分析，得到的最終優化出的試驗條件為：復合酶比例（半纖維素酶/果膠酶）為2.14:1、酶添加量為19.60 g/L、酶解時間為91.53 min、酶解溫度為56.75 ℃，考慮實際生產條件，復合酶（半纖維素酶/果膠酶）比例2.14:1，酶添加量19.6 g/L、酶解時間92 min、酶解溫度為56.8 ℃，模型預測果汁出汁率為74.99%、可溶性固形物含量為15.83%。在此基礎上進行3 次驗證實驗，得到出汁率平均值為79.5%、可溶性固形物含量平均值為15.7%，與預測值接近。

2.4 指標測定

酶解后果汁的各項指標（澄清度、總酚含量和VC含量）與對照組相比顯著增加（P<0.05）（圖7）。有研究表明，枳殼中存在果膠，在加熱狀態下果膠大量溶出，提取液粘稠，增加了分離難度，加入果膠酶可以提高枳殼新橙皮苷和柚皮苷的得率，其原因可能是果膠酶可以降解細胞壁結構中的果膠多糖，增強細胞壁結合的多酚和類胡蘿卜素等的釋放[9,20]，以上結果可以解釋本研究中果膠酶和半纖維素酶的復合提取可以顯著增加果汁的澄清度和總酚含量。相似的結果在葡萄酒發酵過程中也有報道，果膠酶有助于增強花青素等酚類化合物的釋放，花青素有助于葡萄酒的風味和顏色強度，顯著提高了葡萄酒的色澤、營養價值和陳化潛力[16]。

圖7 酶解前后果汁透光率（A）、總酚（TPC）和VC比較（B）Fig.7 Comparison of juice translucency (A),total phenol(TPC) and VC (B) before and after enzymatic digestion

3 結論

本研究建立了酶法澄清費約果果汁的最佳工藝，其參數為酶添加量19.6 g/L、酶解時間92 min、酶解溫度為56.8 ℃、加解比例（半纖維素酶/果膠酶）為2.14:1，出汁率和可溶性固形物分別為79.5%和15.7%。實驗結果發現，酶解處理的果汁相比未處理的理化指標均顯著提高，其中出汁率提高15%、TSS含量上升3%、總酚含量提高12.5 mg GAE/100 g、VC含量提高0.54 mg/100 g，并且透光率也明顯提高。因此，運用復合酶酶解處理費約果果汁可以顯著提升果汁的出汁率和營養價值，本研究為費約果果汁的高效生產提供了一定的理論基礎。