蝦加工副產(chǎn)物抗菌型水解液制備條件優(yōu)化及抑菌作用

谷 蘿，宋 茹

（浙江海洋大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江舟山 316022）

中華管鞭蝦（Solenocera crassicornis）簡稱“紅蝦”，是一種經(jīng)濟(jì)海蝦，屬節(jié)肢動(dòng)物門、游泳亞目、管鞭蝦科、管鞭蝦屬[1]，主要分布于我國南海、東海和黃海等海域，也有少量分布于越南、菲律賓等海域[2]。蝦在生產(chǎn)和加工過程中，產(chǎn)生約50%～60%蝦頭、蝦殼、蝦尾等副產(chǎn)物[3]。這些副產(chǎn)物含有豐富的蛋白質(zhì)、蝦青素及不飽和脂肪酸等營養(yǎng)因子[4-5]，但是目前主要作為低值飼料的原料或直接丟棄，不僅附加值低，還對環(huán)境造成了嚴(yán)重污染。

抗菌肽（Antimicrobial peptides，AMPs）是一種小分子肽，通常由12～50 個(gè)氨基酸殘基組成，廣泛存在于自然界中，可以從細(xì)菌、真菌、植物、昆蟲、水產(chǎn)品和其他動(dòng)物中提取[6-7]。AMPs 的抑菌機(jī)制主要分為膜損傷和非膜損傷兩種，其中，膜損傷是指AMPs與細(xì)胞膜上陰離子型磷脂頭部基團(tuán)結(jié)合、聚集，導(dǎo)致膜脂質(zhì)的流動(dòng)性增加，當(dāng)AMPs 達(dá)到一定濃度時(shí)細(xì)胞膜就會(huì)裂解、細(xì)胞內(nèi)容物釋放，使細(xì)胞膜的完整性遭到破壞[8]；非膜損傷是指AMPs 進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，通過與DNA 或RNA 結(jié)合，直接抑制核苷酸的合成、蛋白質(zhì)折疊或酶活性，抑制細(xì)胞壁的合成或使其水解，從而發(fā)揮抑菌作用[9-10]。近些年，抗生素用量正以前所未有的速度增加，尋找抗生素替代品迫在眉睫。抗菌肽具有無污染、無殘留、廣譜抗菌和不易產(chǎn)生耐藥性的優(yōu)勢[11]，因此有望取代抗生素成為新型抗菌劑。酶解法制備抗菌肽有反應(yīng)時(shí)間短、酶專一性強(qiáng)、水解條件溫和、反應(yīng)條件容易控制等優(yōu)點(diǎn)，因此在制備抗菌肽方面具有廣泛的應(yīng)用前景，如：WANG 等[12]利用堿性和中性蛋白酶分步水解鳳尾魚粉制備了寡肽水解液，從中鑒定得到2 種新型寡肽對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌生長有較好抑制作用。經(jīng)酸性蛋白酶水解制備的山蒼子蛋白抗菌液在20 mg/mL 時(shí)對大腸桿菌的抑菌率高達(dá)96.85%[13]。目前以低值農(nóng)產(chǎn)品、水產(chǎn)品及其加工副產(chǎn)物為原料，通過外加商業(yè)蛋白酶水解法制備抗菌水解液或AMPs 的研究受到廣泛關(guān)注，但利用蝦加工副產(chǎn)物制備抗菌型水解液的研究還鮮見報(bào)道。

南美白對蝦（Penaeus vannamei）又名凡納濱對蝦，營養(yǎng)價(jià)值高、肉質(zhì)鮮美，且出肉率高，深受到廣大消費(fèi)者的喜愛[14]。新鮮的南美白對蝦的肌肉水分和蛋白質(zhì)含量分別高達(dá)74%和20%，在加工和運(yùn)輸過程中如果保鮮不當(dāng)，極易引起微生物繁殖和肌肉自溶，造成腐敗變質(zhì)，產(chǎn)生異味和肉質(zhì)惡化等現(xiàn)象，嚴(yán)重影響產(chǎn)品品質(zhì)[15-16]。因此，采取有效的保鮮措施防止或延緩對蝦的腐敗變質(zhì)尤為重要。本研究以中華管鞭蝦加工副產(chǎn)物為原料，通過溫和的蛋白酶水解法制備對南美白對蝦優(yōu)勢腐敗菌（Specific spoilage organisms ofPenaeus vannamei，PV-SSOs）有抑菌作用的水解液。在選擇適宜商業(yè)蛋白酶基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化酶解條件，制備蝦加工副產(chǎn)物抗菌型水解液（Antibacterial hydrolysate from shrimp processing by-products，SPPH），分析SPPH中肽組分的分子量分布，研究SPPH 對PV-SSOs 的抑菌作用模式，旨在為蝦加工副產(chǎn)物的新型應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南美白對蝦、中華管鞭蝦 從舟山老碶菜場購買，加碎冰30 min 內(nèi)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。中華管鞭蝦由人工剝蝦，收集蝦殼和蝦頭副產(chǎn)物，混合，經(jīng)高速組織搗碎機(jī)搗碎至糜狀（簡稱蝦糜），–20 ℃凍藏，備用；中性蛋白酶（50000 U/g）、風(fēng)味蛋白酶（15000 U/g）、堿性蛋白酶（20000 U/g）和胰蛋白酶（250 U/mg）北京索萊寶科技有限公司；胃蛋白酶（1200 U/g）國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；營養(yǎng)瓊脂、蛋白胨和營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；牛血清白蛋白、谷胱甘肽 上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

TM-767 攪拌機(jī) 中山市海盤電器有限公司；TU-1810PC 紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；DHP-9052 電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Heraeus Multifuge X1R 高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀儀器有限公司；PHB-4 便攜式pH 計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；DSX-280KB24 手提式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；VD-650 桌上式潔凈工作臺(tái) 上海力辰邦西儀器科技有限公司；SHA-B 雙功能水浴恒溫振蕩器 金壇市岸頭良友實(shí)驗(yàn)儀器廠；SU-8020 場發(fā)射電子顯微鏡 日本日立公司；安捷倫1260 Infinity 高效液相色譜 德國安捷倫科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蝦加工副產(chǎn)物水解液的制備 參考宋茹[17]方法稍作修改，具體如下：–20 ℃凍藏的蝦糜在4 ℃下解凍，按照質(zhì)量和體積比1:2（m:v）加入蒸餾水，充分?jǐn)嚢瑁? mol/L 鹽酸和6 mol/L 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 至蛋白酶最適pH（見表1），根據(jù)蝦糜質(zhì)量按照1200 U/g 比例添加各蛋白酶，根據(jù)表1 所示酶解溫度，在水浴恒溫振蕩中酶解3 h，水解過程中用鹽酸和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)混合液pH 在各蛋白酶最適pH 左右，水解結(jié)束后沸水浴加熱10 min 滅酶，冷卻至室溫，調(diào)節(jié)混合物pH 至7.0，然后8000×g 離心20 min（4 ℃），收集上清液，分裝，–20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 各蛋白酶的酶解pH 和酶解溫度Table 1 Hydrolysis pH and temperature of each protease

1.2.2 南美白對蝦腐敗菌的收集 新鮮南美白對蝦，放在無菌培養(yǎng)皿中，室溫下放置至嚴(yán)重腐敗（約4 d），用少量無菌水清洗南美白對蝦，收集菌懸液，得到南美白對蝦優(yōu)勢腐敗菌（PV-SSOs），分裝到無菌管中，滅菌液體石蠟密封，–20 ℃凍存，備用。

1.2.3 抑菌性 參考瓊脂擴(kuò)散法[17]，具體如下：PVSSOs 用營養(yǎng)肉湯活化至對數(shù)期（時(shí)間18～24 h，OD600nm達(dá)到0.40），取100 μL 至滅菌培養(yǎng)皿中，加入45～50 ℃左右營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基18 mL，小心混合均勻，待瓊脂凝固后，用直徑為10 mm 滅菌打孔器打孔，每孔加入150 μL 經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾除菌的酶解液，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，測定抑菌圈直徑。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn) 基于水解用酶對PV-SSOs 的抑菌效果，選擇胃蛋白酶為最佳酶，研究胃蛋白酶添加量（100、300、500、700、900 U/g）、酶解時(shí)間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）、酶解溫度（20、25、30、35、40、45 ℃）和料液比（1:2、1:4、1:6、1:8、1:10，w/v）對PV-SSOs 抑菌性影響。

1.2.5 Box-Beheken 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在固定料液比為1:2 和酶解pH2.0 條件下，選擇胃蛋白酶添加量、酶解時(shí)間和酶解溫度進(jìn)行三因素三水平Box-Behnken 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)（因素及水平見表2），以水解液對PV-SSOs 抑菌圈直徑為響應(yīng)值，采用Design Expert 8.0.5 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素與水平Table 2 Experimental factors and levels of response surface method

1.2.6 肽濃度測定 采用鄰苯二甲醛（o-Phthalaldehyde，OPA）方法[18]略加改進(jìn)，具體如下：20 μL 樣品與1 mL OPA 液混合，室溫放置4 min，測定340 nm下吸光值，去離子水代替樣品與OPA 混合作為調(diào)零管。以谷胱甘肽為肽標(biāo)準(zhǔn)品（濃度范圍0.3～0.8 mg/mL），測定340 nm 吸光值，以濃度為橫坐標(biāo)（x），吸光值為縱坐標(biāo)（y），經(jīng)線性擬合得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.336x-0.001（R2=0.9932），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中肽濃度。

1.2.7 蛋白質(zhì)濃度測定 參照文獻(xiàn)[18]進(jìn)行，適當(dāng)稀釋樣品1 mL 與5 mL 考馬斯亮藍(lán)G250 混合，室溫下放置15 min，測定595 nm 下吸光值。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品（濃度分別為50～300 μg/mL），相同條件測定595 nm 下吸光度，以濃度為橫坐標(biāo)（x），吸光值為縱坐標(biāo)（y），經(jīng)線性擬合得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=0.0028x-0.014（R2=0.9943），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品蛋白質(zhì)濃度。

1.2.8 SPPH 中肽組分的分子量分布 參照文獻(xiàn)[19]高效液相色譜法，色譜柱PL aquagel-OH（75×300 mm，8 μm）柱溫20 ℃，進(jìn)樣量10 μL，流動(dòng)相為30%甲醇溶液（含0.1%甲酸），流速0.5 mL/min，檢測波長220 nm。分子量標(biāo)準(zhǔn)品混合物（牛血清白蛋白68000 Da、維生素B121355.37 Da、氧化型谷胱甘肽612.03 Da 和還原型谷胱甘肽307.32 Da）在相同條件下洗脫，以洗脫時(shí)間（min）為橫坐標(biāo)（x），標(biāo)準(zhǔn)品相對分子量對數(shù)（lg Mw）為縱坐標(biāo)（y），擬合得到線性回歸方程：y=-0.2713x+7.6762（R2=0.9998）。SPPH中肽組分根據(jù)不同洗脫時(shí)間計(jì)算分子量，將SPPH 中肽組按分子量劃分為四個(gè)級分：>6000 Da、6000～3000 Da、3000～1000 Da、<1000 Da，根據(jù)峰面積計(jì)算各級分的相對百分含量，結(jié)果以%計(jì)。

1.2.9 細(xì)胞膜滲透性檢測 SPPH 經(jīng)0.22 μm 過濾除菌，與對數(shù)期PV-SSOs 菌懸液（OD600nm為0.45左右）按照體積比1:1（V:V）混合，然后37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，每隔2 h 取出1 mL 混合液，3500×g 離心10 min，上清液用0.22 μm 濾膜過濾除菌，經(jīng)無菌生理鹽水稀釋適當(dāng)倍數(shù)，測定260 nm 吸光值，無菌生理鹽水為調(diào)零管。SPPH 自身在260 nm有吸收，所以實(shí)驗(yàn)用相同稀釋倍數(shù)SPPH 作為樣品空白。無菌生理鹽水代替樣品與對數(shù)期PV-SSOs 作用不同時(shí)間260 nm 下吸光值為PV-SSOs 對照組。

1.2.10 菌體微觀結(jié)構(gòu)變化 參照文獻(xiàn)[19]進(jìn)行，收集1.2.9 中SPPH 與PV-SSOs 作用12 h 菌沉淀，用無菌生理鹽水小心洗滌至少2 次，然后用2.5%戊二醛固定過夜（4 ℃）。固定好的菌體經(jīng)臨界點(diǎn)干燥、噴金，在場發(fā)射掃描電鏡（加速電壓3.0 kV）下觀察菌體微觀結(jié)構(gòu)，同條件下未經(jīng)SPPH 作用的PV-SSOs 為對照組。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Designexpert 8.0.5 軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析，使用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析和鄧肯法（Duncan’s）統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05 表示差異顯著，采用Origin 2018 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 水解用酶的篩選

圖1 結(jié)果顯示，蝦副產(chǎn)物的胃蛋白酶和堿性蛋白酶水解液對PV-SSOs 有抑菌作用，形成的抑菌圈直徑分別達(dá)到23.5±0.35 mm 和10.00±0.53 mm。相比之下，中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和胰蛋白酶水解液對PV-SSOs 無抑菌活性，表現(xiàn)為無抑菌圈形成。與本研究結(jié)果相似，一些水產(chǎn)蛋白及水產(chǎn)品加工副產(chǎn)物的胃蛋白酶水解液也表現(xiàn)出較好的抑菌作用，如：黃鯽胃蛋白酶水解液與風(fēng)味蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶的水解液相比，對大腸桿菌表現(xiàn)出更高的抑制性[20]，螺旋藻經(jīng)胃蛋白酶水解后能顯著抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長[21]。胃蛋白酶具有較高的水解特異性，專門切割蛋白質(zhì)中由疏水性氨基酸參與形成的肽鍵，釋放出N 端或C 端帶有疏水氨基酸的肽段，而這些肽段極有可能與富含脂質(zhì)的菌體細(xì)胞膜相互作用，通過膜損傷方式或進(jìn)入膜內(nèi)作用特定靶點(diǎn)來發(fā)揮抑菌作用[19,22-23]。圖1 中胃蛋白酶水解液對PV-SSOs 抑菌作用強(qiáng)于其他蛋白酶水解液，因此選擇胃蛋白酶為水解用酶，進(jìn)一步研究酶解條件對蝦加工副產(chǎn)物水解液的抑菌作用影響。

圖1 瓊脂擴(kuò)散法比較五種不同水解液對PV-SSOs 的抑菌效果Fig.1 Comparison of antibacterial activities of five different hydrolysates against PV-SSOs by the agar-well diffusion method

2.2 不同水解條件對PV-SSOs 抑菌性的影響

進(jìn)一步分析了胃蛋白酶添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間和料液比對PV-SSOs 抑菌圈直徑的影響，如圖2所示。

圖2 酶解條件對PV-SSOs 的抑菌直徑影響Fig.2 Effects of enzymatic hydrolysis conditions on the diameter of inhibition zone of PV-SSOs

固定酶解時(shí)間3 h、酶解溫度35 ℃和料液比1:2 條件下，胃蛋白酶不同添加量對水解液抑菌活性影響見圖2a。當(dāng)胃蛋白酶添加量從100 U/g 增加至700 U/g 時(shí)，水解液的抑菌圈直徑從12.67±0.94 mm增大至23.17±0.62 mm，這可能是因?yàn)殡S著胃蛋白酶添加量的增加，酶與底物反應(yīng)速率增加，使蝦加工副產(chǎn)物的水解更徹底，釋放更多抑菌活性肽類[19]。但繼續(xù)增大胃蛋白酶用量至900 U/g 時(shí)，水解液的抑菌圈直徑未進(jìn)一步顯著提高（P>0.05），推測與胃蛋白酶添加量達(dá)到一定程度后，釋放出來的抗菌肽組分可能已趨于穩(wěn)定有關(guān)。圖2a 結(jié)果表明固定酶解時(shí)間3 h時(shí)，反應(yīng)體系中添加700 U/g 胃蛋白酶能充分滿足抗菌型水解液制備要求。實(shí)驗(yàn)選擇胃蛋白酶添加量300～700 U/g 進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，檢測能否通過優(yōu)化其他水解條件來減少胃蛋白酶添加量，從而降低水解用酶成本。

固定胃蛋白酶添加量700 U/g、酶解溫度35 ℃和料液比1:2 條件下，研究了不同酶解時(shí)間對水解液的抑菌性影響如圖2b 所示。當(dāng)酶解時(shí)間從0.5 h延長到1.5 h 時(shí)，水解液的抑菌圈直徑從13.25±1.25 mm 增加到21.5±1.00 mm（P<0.05）。當(dāng)酶解時(shí)間大于2 h 時(shí)，水解液對PV-SSOs 的抑菌性出現(xiàn)下降趨勢，雖然抑菌圈直徑大小未發(fā)生統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異（P>0.05），但是也能反映出酶解時(shí)間過長不利于水解液抑菌活性的保持，可能與水解液中已生成的抗菌肽被過度水解成抑菌活性低的肽段或游離氨基酸有關(guān)[19,24]。根據(jù)圖2b 結(jié)果，酶解1.5 h 到3.0 h 時(shí)，所得水解液對PV-SSOs 的抑菌圈直徑差異不顯著，實(shí)驗(yàn)選擇酶解1.5～3.0 h 用于響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，確定該時(shí)間范圍內(nèi)適宜的酶解時(shí)間。

在胃蛋白酶添加量700 U/g、酶解時(shí)間2 h 和料液比1:2 條件下，酶解溫度對水解液的抑菌性影響如圖2c 所示。隨著酶解溫度的升高，水解液的抑菌圈直徑先增加后減小，其中在酶解溫度35 ℃時(shí)抑菌圈直徑達(dá)到23.27±0.65 mm，酶解溫度在30～40 ℃時(shí)水解液對PV-SSOs 的抑菌圈直徑差異并不顯著（P>0.05）。酶解溫度過低，在規(guī)定酶解時(shí)間內(nèi)酶的活性不能充分發(fā)揮；而酶解溫度過高，則會(huì)破壞酶分子原有的三維結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致酶分子發(fā)生不同程度變性失活，進(jìn)而導(dǎo)致其水解作用降低[25]。所以，過低和過高的酶解溫度均不利于隱藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部的抗菌肽組分水解和釋放。因此，響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)中酶解溫度選擇范圍為30～40 ℃。

在胃蛋白酶添加量700 U/g、酶解時(shí)間2 h 和酶解溫度35 ℃條件下，研究了不同料液比對水解液的抑菌活性影響。由圖2d 可知，在料液比1:2～1:10時(shí)，水解液的抑菌圈直徑急劇下降，說明料液比過大，酶解底物濃度過低，不利與酶分子充分接觸，即：降低了酶解反應(yīng)速度，生成的抗菌肽組分濃度過低，結(jié)果表現(xiàn)為抑菌性下降[25]。因此，選擇料液比1:2 用于酶解條件優(yōu)化。

2.3 Box-Beheken 試驗(yàn)結(jié)果分析

響應(yīng)面優(yōu)化是近年來食品科學(xué)和研究廣泛采用的一種統(tǒng)計(jì)方法，通過模擬和優(yōu)化一個(gè)系統(tǒng)對一個(gè)或多個(gè)因素的反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)反應(yīng)條件優(yōu)化目的[26-27]。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，本研究以水解液對PV-SSOs 的抑菌圈直徑為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面Box-Beheken 試驗(yàn)（三因素三水平，見表2）優(yōu)化胃蛋白酶水解蝦加工副產(chǎn)物制備抗菌型水解液條件，試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 Box-Beheken 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Box-Beheken experimental design and results of response surface methodology

根據(jù)表3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果，經(jīng)Design-Expert 8.0.5 軟件擬合，水解液對PV-SSOs 的抑菌圈直徑與各因素間的回歸方程為：Y=22.98+1.39X1+0.56X2-0.23X3-0.66X1X2-0.29X1X3-0.40X2X3-0.67X12-0.95X22-0.36X32。

表3 方差分析結(jié)果見表4，通過方差分析確定模型的顯著性，其中回歸模型極顯著（P<0.01），失擬項(xiàng)不顯著（P>0.05）表明該模型擬合度良好，二次回歸模型的方差分析系數(shù)R2=0.9429 說明該模型解釋了94.29%的變異，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)具有良好的可靠性。在該模型中，一次項(xiàng)X1、X2和二次項(xiàng)X12、X22對水解液的抑菌性影響均達(dá)到顯著水平（P<0.05），而X3和X32對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響不顯著（P>0.05），交互項(xiàng)X1X2對水解液的抑菌性影響顯著（P<0.05），而X1X3、X2X3對水解液的抑菌性影響不顯著（P>0.05）。通過比較3 個(gè)因素F值大小可以得到，影響水解液對PVSSOs 抑菌性順序依次為：胃蛋白酶添加量（X1）>酶解時(shí)間（X2）>酶解溫度（X3）。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance (ANOVA) of regression equation

進(jìn)一步對因素間交互作用進(jìn)行分析，如圖3 所示。圖3a 中胃蛋白酶添加量（X1）和酶解時(shí)間（X2）對響應(yīng)值具有交互作用（P<0.05），在較低酶解時(shí)間下，水解液的抑菌圈直徑隨著胃蛋白酶添加量的增加而增加。然而在酶解時(shí)間較高水平3 h 時(shí)，水解液對PV-SSOs 的抑菌圈直徑隨著胃蛋白酶添加量的增加而呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。類似地，在較高胃蛋白酶添加量700 U/g 時(shí)，水解液的抑菌圈直徑先隨著酶解時(shí)間的延長而增大，而后進(jìn)一步延長酶解時(shí)間反而降低水解液的抑菌活性。

圖3 酶解條件交互作用對水解液的抑制圈直徑影響Fig.3 Interaction influence of hydrolysis conditions on the inhibition zone diameter of hydrolysates

圖3b 顯示了胃蛋白酶添加量（X1）和酶解溫度（X3）對抑菌圈直徑的影響。酶解溫度在較低水平時(shí)，水解液的抑菌圈直徑隨著加酶量的增加而增加，并在700 U/g 時(shí)到達(dá)最大值。當(dāng)酶解溫度在較高水平時(shí)，如：酶解溫度40 °C，水解液對PV-SSOs 的抑菌直徑先是隨著胃蛋白酶添加量的增加而上升，而后繼續(xù)加大胃蛋白酶添加量反而降低了水解液的抑菌活性，推測與水解液中抗菌肽段被胃蛋白酶過度水解，生成抑菌活性低肽段或被直接水解為游離氨基酸有關(guān)[24]。圖3b 中當(dāng)胃蛋白酶添加量在較高水平700 U/g，在酶解溫度30～34 °C 時(shí)，水解液的抑菌圈直徑保持在較高水平，而后隨著酶解溫度的提高，水解液的抑菌圈直徑呈現(xiàn)下降的趨勢。適當(dāng)提高酶解溫度有利于提高酶活性，促進(jìn)酶解反應(yīng)進(jìn)行，但是在蛋白酶添加量充裕條件下，過多蛋白酶會(huì)進(jìn)一步水解反應(yīng)體系中已經(jīng)生成的肽類，導(dǎo)致一些活性肽組分氨基酸序列組成發(fā)生變化，結(jié)果影響水解液整體活性的發(fā)揮[19]。

由圖3c 可知，無論酶解溫度處于較低還是較高水平，隨著酶解時(shí)間的增加，水解液的抑菌圈直徑均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，說明酶解時(shí)間過長不利于保持水解液的抗菌活性。在較短的酶解時(shí)間1.5 h時(shí)，胃蛋白酶在30～40 °C 水解蝦加工副產(chǎn)物所得水解液對PV-SSOs 的抑菌直徑表現(xiàn)較為平穩(wěn)，與胃蛋白酶在該溫度范圍短時(shí)間內(nèi)活性保持穩(wěn)定有關(guān)。

2.4 最佳酶解條件的驗(yàn)證

通過響應(yīng)面優(yōu)化分析可得到蝦加工副產(chǎn)物最佳酶解條件為：胃蛋白酶添加量695 U/g、酶解時(shí)間2.33 h、酶解溫度33 ℃，鑒于實(shí)驗(yàn)的可操作性，調(diào)整酶解條件為胃蛋白酶添加量為700 U/g、酶解時(shí)間為2.3 h、酶解溫度為33 ℃。通過6 組重復(fù)實(shí)驗(yàn)測定得到SPPH 對PV-SSOs 的抑菌圈直徑為24.10±0.43 mm（圖4），該結(jié)果與模型預(yù)測值23.84 mm 無顯著性差異（P>0.05），表明實(shí)驗(yàn)確定的模型可以用來預(yù)測實(shí)際值。經(jīng)測定SPPH 的肽濃度為25.29 mg/mL，蛋白濃度為62.91 μg/mL。

圖4 SPPH 對PV-SSOs 的抑菌作用Fig.4 Antibacterial activity of SPPH on PV-SSOs

2.5 SPPH 中肽組分的分子量分布

SPPH 中肽組分的分子量分布如圖5 所示，從SPPH 中分離出7 個(gè)色譜峰，根據(jù)分子量劃分為Mw：>6000 Da（峰1）、6000～3000 Da（峰2）、3000～1000 Da（峰3 和峰4）和<1000 Da（峰5、峰6 和峰7）四個(gè)級分，相對百分含量分別為19.28%、11.09%、23.47%和46.15%。其中，Mw>6000 Da 的峰1 中可能含有少量胃蛋白酶，因?yàn)樵赟PPH 制備過程中，不可避免有少量胃蛋白酶殘留在水解液中。由圖5 可以看出SPPH 中肽組分主要由Mw<3000 Da 組分組成，其相對百分含量接近70%。類似地，SINTHUSAMRAN 等[28]報(bào)道太平洋白蝦頭胸水解物中Mw<1355 Da 的肽比例較大；趙子科[29]報(bào)道脊尾白蝦的蝦肉酶解液中生成的小分子物質(zhì)比較多，并且分子量分布相對比較分散，其中相對分子質(zhì)量為3600 Da左右肽組分占反應(yīng)物總量的27.27%；南極磷蝦酶解產(chǎn)物中100～5500 Da 組分占總水解產(chǎn)物的79.69%[30]。圖5 結(jié)果表明，SPPH 中可能存在大量有抗菌作用的小分子肽類。

2.6 SPPH 對細(xì)胞膜滲漏性的影響

細(xì)胞膜作為細(xì)菌的外部屏障，起著保護(hù)自身結(jié)構(gòu)完整性和保證菌體正常生理活動(dòng)的作用。細(xì)胞膜一旦被抗菌物質(zhì)損傷，胞內(nèi)一些小分子物質(zhì)（K+、PO43-等）和大分子物質(zhì)（核酸、蛋白質(zhì)、糖類等）就會(huì)滲透出來，影響菌體正常的合成代謝[31]，測定260 nm 處吸光值的變化能夠反映出菌體細(xì)胞膜滲透情況和細(xì)胞膜的完整性[32]。從圖6 可知，在反應(yīng)時(shí)間2～8 h時(shí)，對照組（CK）和SPPH 組在260 nm 處的吸光值均顯著增加，其中CK 組吸光值增加可能與PV-SSOs胞內(nèi)部分蛋白酶分泌到胞外，結(jié)果導(dǎo)致260 nm 處吸光值增高有關(guān)，也有可能是PV-SSOs 中部分菌不耐受CK 組的生理鹽水，結(jié)果發(fā)生一定程度膜損傷而導(dǎo)致遺傳物質(zhì)泄露到胞外。相比之下，PV-SSOs 經(jīng)過SPPH 處理后在260 nm 處的吸光值急劇上升，且顯著高于同時(shí)間下的CK 組（P<0.05 或P<0.01），說明SPPH 處理對PV-SSOs 細(xì)胞膜的完整性造成了嚴(yán)重破壞，導(dǎo)致了胞內(nèi)大量遺傳物質(zhì)外泄。當(dāng)作用大于8 h 時(shí)，SPPH 組在260 nm 處的吸光值變化趨于平穩(wěn)，推測與受損菌體胞內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)基本泄漏完全有關(guān)。與本研究結(jié)果相似，TANG 等[33]報(bào)道大腸桿菌經(jīng)卵清蛋白水解物中抗菌肽作用后細(xì)胞膜的完整性遭到破壞，導(dǎo)致K+和核酸泄漏，其中作用6 h 時(shí)的吸光值趨于平穩(wěn)。

圖6 SPPH 對PV-SSOs 細(xì)胞膜滲透性影響Fig.6 Effect of SPPH on the cell membrane permeability of PV-SSOs

2.7 SPPH 對菌膜微觀結(jié)構(gòu)的影響

圖6 結(jié)果提示SPPH 對PV-SSOs 造成了膜滲透，為了進(jìn)一步了解SPPH 的抗菌機(jī)制，采用SEM觀察了PV-SSOs 經(jīng)SPPH 作用12 h 后菌體微觀結(jié)構(gòu)變化（圖7）。圖7a 中CK 組含有較規(guī)則的球菌和桿菌，說明PV-SSOs 不止一類菌，即：本研究中引起南美白對蝦腐敗的優(yōu)勢腐敗菌是混合菌體系。CK組的菌體形態(tài)保持完整、未變形、表面無褶皺、沒有明顯的細(xì)胞碎片堆積，也未見細(xì)胞破損和細(xì)胞內(nèi)容物大量溢出。相比之下，PV-SSOs 的形態(tài)結(jié)構(gòu)在SPPH作用12 h 后發(fā)生了明顯的改變，其中一些菌體表面出現(xiàn)不規(guī)則褶皺、變得粗糙，出現(xiàn)凹陷和破裂，有的有明顯孔洞形成，細(xì)胞內(nèi)容物溢出和堆積。上述現(xiàn)象表明PV-SSOs 在SPPH 作用下菌體正常的形態(tài)和完整性遭到了破壞，與圖6 中SPPH 組膜滲透性顯著增加結(jié)果一致。姜楊[34]報(bào)道鯰魚體表粘液抗菌肽會(huì)誘發(fā)腐敗希瓦氏菌的菌體發(fā)生扭曲變形、干癟，菌體表面出現(xiàn)凹陷，形成孔洞造成內(nèi)容物外泄；WEI等[35]報(bào)道殼寡糖衍生物可以導(dǎo)致南美白對蝦腐敗希瓦氏菌的菌體大部分出現(xiàn)斷裂，菌體表面受損，出現(xiàn)明顯的收縮和嚴(yán)重變形。上述報(bào)道與本研究結(jié)果一致，綜合圖6 和圖7 結(jié)果，能夠判定SPPH 可以通過膜損傷方式抑制PV-SSOs。

圖7 SPPH 與PV-SSOs 作用后掃描電鏡結(jié)果Fig.7 Scanning electron microscopy results of SPPH after interaction with PV-SSOs

3 結(jié)論

胃蛋白酶水解中華管鞭蝦加工副產(chǎn)物，制備出對PV-SSOs 有抑菌效果的抗菌型水解液SPPH，采用響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化的SPPH 中Mw<3000 Da 低分子量肽的相對含量接近70%。SPPH 處理顯著增強(qiáng)了PV-SSOs 的細(xì)胞膜滲透性，在SEM 下可見PV-SSOs發(fā)生嚴(yán)重膜損傷，形成凹陷、孔洞，有的菌體已裂解，因此SPPH 對PV-SSOs 的抑菌作用與膜損傷機(jī)制有關(guān)。本研究為蝦加工副產(chǎn)物制備AMPs 的研究奠定了理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為PV-SSOs 抑菌劑的開發(fā)提供了技術(shù)依據(jù)。但是，SPPH 中抗菌肽的分離鑒定、PV-SSOs 中特定菌的鑒定，以及SPPH 是否進(jìn)入PV-SSOs 菌體內(nèi)通過非膜損傷機(jī)制發(fā)揮抑菌作用有待于后續(xù)進(jìn)一步研究。