不同感官特性醬香型大曲理化指標與霉菌群落關聯分析

唐佳代，石雨菲，趙益梅，王怡，冷枝，郭敏，孟卓妮，楊亮

（茅臺學院釀酒工程系，貴州仁懷 564500）

醬香型大曲是由小麥為原料，經拌料、壓制成型、入倉發酵和出倉貯存而成的糖化發酵劑[1-2]。醬香型大曲在開放式的環境生產，使得大曲網羅自然環境中豐富的微生物，而制曲過程中不同的發酵溫度、貯存時間、貯存環境等因素，導致了大曲微生物的多樣性和群落結構差異[3-6]。微生物在發酵過程中所發生一系列復雜的生化反應，從而產生了豐富的發酵基質、風味物質前體物質等，為醬香型白酒生產提供了風味物質前體和發酵所需酶系等[7-8]。因此，醬香型大曲是集菌系、酶系及物系為一體的重要載體，不同的品溫控制策略等因素使成品曲的感官特性、理化指標和微生物群落組成各不相同[9]。

按照不同感官特性醬香型大曲分為黃曲、黑曲和白曲，三種大曲各有特點：黃曲皮厚，醬香濃郁，糖化力較低；黑曲皮薄，常帶有糊味；白曲皮薄，醬香弱，但其糖化率高[10-11]。制曲環境和工藝等因素造就了大曲中的霉菌以紅曲霉屬Monascus、曲霉屬Aspergillus、根霉屬Rhizopus、犁頭霉屬Absidia、木霉屬Trichoderma、青霉屬Penicillium、橫梗霉屬Lichtheimia、擬青霉屬Paecilomyces和毛霉屬Mucor等為主[12-14]。霉菌可產生糖化酶、酯化酶等多種酶類[15]，能夠分解曲塊和酒醅中的淀粉[16]、蛋白質[17]、脂肪等[18]大分子物質為發酵微生物提供營養，且作為風味前體物質參與發酵，與大曲發酵特性密切相關。目前，鮮見可培養的大曲理化指標與霉菌群落的關聯的報道，張云曌[19]經過對濃香型大曲微生物群落與理化性質的冗余分析，發現大曲的糖化力、水分與嗜熱真菌屬、嗜熱子囊菌屬、霉菌屬、根霉菌屬、毛霉屬等呈負相關，液化力與嗜熱真菌屬、嗜熱子囊菌屬、毛霉屬和根霉菌屬呈正相關，與曲霉屬呈負相關；酸度與曲霉菌屬、根霉菌屬、毛霉屬呈正相關；但與嗜熱真菌屬和嗜熱子囊菌屬呈負相關。

解析大曲中的大曲理化指標與霉菌群落組成之間的關聯對挖掘功能性微生物有至關重要的作用，有助于進一步掌握醬香型白酒釀造過程中的微生物信息。本研究基于傳統可培養技術分離出不同感官特性醬香型大曲中霉菌，利用分子生物學鑒定所分離霉菌菌株，結合冗余分析探究了大曲理化指標與間霉菌群落的關聯。為利用白酒釀造微生物資源奠定研究基礎，為提高強化大曲的開發研究提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃曲YQ、黑曲BQ、白曲WQ 貴州省仁懷市某醬香型白酒廠拆倉曲，樣品為2020 年11 月，該酒廠某一制曲車間中五個曲房中的拆倉曲（黑、白、黃曲）各一塊，粉碎混合后用四分法進行縮分取樣，備用；氫氧化鈉 分析純，天津大茂化學試劑廠；硫酸分析純，川東化工集團；己酸、乙醇、乙酸 分析純，上海滬試實驗室器材股份有限公司；乙酸鈉 分析純，南京化學試劑股份有限公司；葡萄糖 分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司；瓊脂 分析純，北京奧博星生物技術有限責任公司；細菌真菌基因組提取試劑盒 北京天漠科技開發有限公司；2X Blastaq PCR Taq MasterMix 加拿大Applied Biological Materials 公司；QIAquick Gel Extraction Kit 德國QIAGEN 公司；DL2000 DNA Marker 日本Takara公司；LE Agarose 美國海晉生物公司。

FA1204N 電子天平 上海菁海儀器有限公司；DHG-9140A 電熱恒溫鼓風干燥箱、HH-8J 數顯恒溫水浴鍋 常州潤華電器有限公司；DK-98-II 電爐天津市泰斯特儀器有限公司；YXQ-LS-100SII 立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博訊醫療股份有限公司；BCD-640WAGM 冷藏柜 青島海爾股份有限公司；SW-CJ-2D 雙人單面垂直送風凈化工作臺 上海喬躍電子有限公司；BSD-YX3200 立式智能精密搖床上海博訊醫療生物儀器股份有限公司；SHP-250生化培養箱 上海森信實驗儀器有限公司；5417R離心機 德國Eppendorf 公司；9700PCR 儀 美國應用生物系統公司；PowerPac HV 電泳儀 美國Biorad 公司；3730X 測序儀 美國應用生物系統公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 不同感觀特性醬香型大曲理化指標分析 按照QB/T 4257-2011《釀酒大曲通用分析方法》[20]對三種不同感官特性醬香大曲的水分含量、酸度、液化力、糖化力、發酵力和酯化力進行測定。

1.2.2 不同感觀特性醬香大曲中霉菌的分離、純化與鑒定 稱取10 g 經研磨的白曲、黃曲和黑曲樣品于含數顆玻璃珠的90 mL 無菌水中，振蕩30 min，并取原液1 mL 梯度稀釋10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍。分別取200 μL 稀釋菌液涂布在PDA 培養基表面[21]。在30 ℃培養箱中培養2 d 后將菌株3～4 次點接種培養，獲得純的霉菌菌株。將純化后的菌種接入試管斜面保存，置于4 ℃冰箱保藏備用[22]。

保藏的菌種送至成都羅寧生物科技有限公司，使用DNA 提取試劑盒提取分離純化的霉菌DNA。采用真菌ITS 序列通用引物ITS4（5′-TCCTCCGC TTATTGATATGC-3′）和ITS5（5′-GGAAGTAAAA GTCGTAACAAGG-3′）擴增霉菌的ITS 區域。PCR反應體系為50 μL，其中2XPCR Bestaq MasterMix 25 μL，超純水18 μL，上游引物ITS1 2.5 μL，下游引物ITS4 2.5 μL，DNA 2 μL。PCR 擴增條件為：95 ℃預變性3 min，94 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，30 個循環，72 ℃延伸1 min；4 ℃保溫。PCR 產物用1%瓊脂糖凝膠150 V 電泳20 min 檢測擴增條帶，將回收的PCR 產物用ABI3730XL 進行測序[13]。

1.3 數據處理

大曲理化指標涉及有效的3 組平行檢測數據平均值，結果使用（平均值±標準差）的形式表示，利用SPSS22.0 軟件進行統計學分析處理，當P<0.05 時，不同大曲理化指標數據組之間被認為具有統計學的顯著差異。基于美國國家生物信息技術中心數據庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）對原始霉菌序列進行BLAST 比對，使用MEGA7.0 軟件中Neighbor-Joining 功能構建系統發育樹，利用Excel 2019 繪制霉菌群落結構圖，采用Canoco 5.0 軟件[23]完成冗余分析（redundancy analysis，RDA）。

2 結果與分析

2.1 不同感官特性醬香型大曲理化指標分析

大曲理化指標中的水分含量和酸度可在一定程度上表現出大曲質量，液化力、糖化力、酯化力則反映大曲中的酶系功能，而發酵力可反映大曲中某些微生物生長情況。不同感官特性醬香型大曲理化指標如表1 所示，其中水分含量從高到低依次為白曲12.89%，黑曲12.44%，黃曲11.63%，三種大曲水分均低于13%，代表大曲的水分含量適宜且成熟度較好。適宜的酸度可以抑制大曲中雜菌的生長[24]，醬香大曲酸度的范圍為（1.0～3.5）×10-1mmol/g[20]，三種大曲酸度從高到低依次為黑曲3.16×10-1mmol/g，白曲2.64×10-1mmol/g，黃曲2.52×10-1mmol/g，均在適宜的酸度范圍。發酵力從高到低依次為黃曲1.56 U，黑曲1.51 U，白曲1.46 U，液化力從高到低依次為黃曲1.23 U，白曲0.98 U，黑曲0.84 U，酯化力從高到低依次為黃曲22.63 U，黑曲22.48 U，白曲22.16 U，糖化力從高到低依次為白曲356.09 U，黃曲283.27 U，黑曲220.07 U。所測指標與張麗等[25]研究中貯存初期的醬香大曲理化指標基本吻合。三種醬香大曲的糖化力有顯著性差異，該指標反映了大曲對淀粉的轉化率，含量越高，轉化率越高[26]。大曲的糖化力與微生物的生長繁殖有一定的相關性，特別是霉菌。酯化力和發酵力都作為大曲生化功能的動態指標，與大曲中微生物多樣性及其代謝有密切聯系。

表1 不同感官特性醬香型大曲理化指標Table 1 Physical and chemical indicators of sauce-flavor Daqu with different sensory characteristics

2.2 不同感觀特性醬香大曲中霉菌的分離、純化與鑒定結果

從三種不同感官特性醬香型大曲中共分離純化出霉菌78 株，其中白曲29 株，黃曲26 株，黑曲23株。將78 株霉菌菌株測序所得序列上傳至NCBI獲得的序列號，并在BLAST 進行序列比對，比對結果和大曲分離所得霉菌序列展示于表2。

表2 不同感官特性大曲菌株測序比對結果Table 2 Sequencing comparison results of Daqu strain with different sensory characteristics

為直觀反映了所分離霉菌間親源性和判斷分離篩選出的霉菌菌株的種屬，利用Neighbor-Joining 構建系統發育樹，其具體分類地位見圖1～圖3 所示。其中33 株霉菌屬于橫梗霉屬Lichtheimia：WQM-21、WQM-24、WQM-25 等13 株菌與MT982159.1Lichtheimia corymbifera同源性達100%，YQM-10、YQM-05、WQM-07、WQM-17、WQM-19 與MG772621.1Lichtheimia ornata同源性≥99%，YQM-12、YQM-21 與JN579140.1Lichtheimia hongkongensis同源性達100%，BQM-01、YQM-01、YQM-02 等13 株菌與MH453383.1Lichtheimia ramosa同源性≥99%。4 株屬于青霉屬Penicillium：WQM-09、WQM-32與MN197688.1Penicillium chrysogenum同源性達100%，WQM-03、WQM-27 與NG070021.1 緩慢產黃青霉Penicillium tardochrysogenum同源性≥99%。3 株屬于曲霉屬Aspergillus：BQM-20 與MT226558.1Aspergillus sydowii同源性達100%，BQM-23 與MH876710.1Aspergillus quadrilineatus同源性達100%，YQM-08 與NG069721.1Aspergillus intermedius同源性達99%。36 株屬于擬青霉屬Paecilomyces：BQM-09、BQM-10、WQM-02 等11 株 與MH874957.1Paecilomyces subglobosus同源性≥99%，BQM-02、BQM-03、BQM-04 等25 株與 ON853979.1Paecilomyces variotii同源性達100%。1 株附球菌屬Epicoccum和1 株帚霉屬Scopulariopsis：WQM-04 與 MN654935.1Epicoccum endophytica同源性達100%；BQM-18 與 EU-862178.1Scopulariopsis brevicaulis同源性達100%。

圖1 白曲霉菌系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree of mold in WQ

圖2 黃曲霉菌系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of mold in YQ

圖3 黑曲霉菌系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of mold in BQ

三種不同感官特性醬香型大曲的霉菌群落結構分析如圖4 所示，共鑒定到6 個屬13 種的霉菌78 株。白曲WQ 中霉菌為Paecilomyces subglobosus（31.03%）、宛氏擬青霉Paecilomyces variotii（24.14%）、傘枝橫梗霉Lichtheimia corymbifera（17.24%），Lichtheimia ornata（10.34%）、緩慢產黃青霉Penicillium tardochrysogenum（6.90%）、產黃青霉Penicillium chrysogenum（6.90%）、Epicoccum endophytica（3.45%）；YQ 中霉菌有分枝橫梗霉Lichtheimia ramosa（46.15%）、傘枝橫梗霉Lichtheimia corymbifera（26.92%）、宛氏擬青霉Paecilomyces variotii（7.69%）、Lichtheimia hongkongensis（7.69%）、Lichtheimia ornata（7.69%）、中間曲霉Aspergillus intermedius（3.85%）；BQ 中霉菌有宛氏擬青霉Paecilomyces variotii（69.57%）、Paecilomyces subglobosus（8.70%）、分枝橫梗霉Lichtheimia ramosa（4.35%）、短柄帚霉Scopulariopsis brevicaulis（4.35%）、傘枝橫梗霉Lichtheimia corymbifera（4.35%）、聚多曲霉Aspergillus sydowii（4.35%）、四脊曲霉Aspergillus quadrilineatus（4.35%）。其中宛氏擬青霉Paecilomyces variotii和Lichtheimia corymbifera兩種霉菌在三種大曲中均被鑒定出來，Lichtheimia ornata存在于白曲和黃曲中，Paecilomyces subglobosus存在于白曲和黑曲中，Lichtheimia ramosa存在于黃曲和黑曲中，中間曲霉Aspergillus intermedius和Lichtheimia hongkongensis僅在黃曲中鑒定出來，緩慢產黃青霉Penicillium tardochrysogenum、Epicoccum endophytica和Penicillium chrysogenum僅在白曲中鑒定出來，短柄帚霉Scopulariopsis brevicaulis、Aspergillus sydowii和Aspergillus quadrilineatus僅在黑曲中鑒定出來。在三種大曲共有或特有的霉菌菌種中分枝橫梗霉Lichtheimia ramosa和傘枝橫梗霉Lichtheimia corymbifera在酒曲中具有很強的耐熱性、生長能力，是產生蛋白酶、脂肪酶的主要菌種[27]，宛氏擬青霉Paecilomyces variotii大多在醬香型大曲中都有發現，耐熱性很強，可以降解甲醇和糠醛類有害物質，解除對酵母菌的抑制作用，是重要的調節性霉菌[28]，黑曲和黃曲中鑒定到的曲霉屬Aspergillus作為釀造過程中主要的供酶菌源，耐熱性好，能產生糖化酶、蛋白酶、淀粉酶等活性較高的水解酶類[29-30]，已有多株高產酶的菌株從自然發酵體系中分離篩選出來，并被初步應用于強化白酒發酵過程[31-32]。

圖4 三種不同感官特性大曲霉菌群落結構Fig.4 Mold community structure of Daqu with three different sensory characteristics

2.3 大曲理化性質和霉菌鑒定的相關性分析

采用RDA 冗余分析解析優勢菌群與理化指標之間的相關性，其中兩因素間的夾角為銳角時，表示存在正相關，反之為負相關，兩因素投影到另一個因素的長度越長則相關性越大[33]。圖5 冗余分析結果顯示，實驗數據霉菌與大曲理化指標總變異的98.43%能夠被圖中的變量所解釋，第一排序軸能解釋59.44%的變異信息，第二排序軸能解釋38.99%的變異信息。液化力與酯化力、發酵力和糖化力都呈正相關，其中糖化力與Paecilomyces subglobosus、Lichtheimia corymbifera、緩慢產黃青霉Penicillium tardochrysogenum、Epicoccum endophytica、Lichtheimia ornata、Penicillium chrysogenum呈正相關，液化力與Lichtheimia ramosa、Lichtheimia corymbifera、中間曲霉Aspergillus intermedius、Lichtheimia ornata、Lichtheimia hongkongensis呈正相關，發酵力和酯化力與Lichtheimia ramosa、Aspergillus intermedius、Lichtheimia hongkongensis呈正相關，由此看出影響糖化力、酯化力、液化力和發酵力主要菌屬為橫梗霉屬，研究表明橫梗霉屬與糖化酶系統的關鍵蛋白有關[34]；水分與酸度呈正相關，水分與宛氏擬青霉Paecilomyces variotii、Paecilomyces subglobosus、短柄帚霉Scopulariopsis brevicaulis、Aspergillus sydowii、Aspergillus quadrilineatus、緩慢產黃青霉Penicillium tardochrysogenum、Epicoccum endophytica、Penicillium chrysogenum呈正相關；酸度與宛氏擬青霉Paecilomyces variotii、短柄帚霉Scopulariopsis brevicaulis、Aspergillus sydowii、Aspergillus quadrilineatus呈正相關，由此看出影響水分含量的主要是青霉屬，影響酸度的主要為擬青霉屬。

圖5 霉菌與大曲理化指標之間的冗余分析Fig.5 Redundancy analysis between mold and physical and chemical indicators of Daqu

3 結論

本研究以三種不同感官特性醬香型大曲研究對象，探究了黑、白、黃三種大曲理化指標和可培養霉菌群落之間的關聯性。經測定三種大曲理化指標水分含量均低于13%，酸度均在（1.0～3.5）×10-1mmol/g范圍內；發酵力和酯化力大小為黃曲>黑曲>白曲；液化力大小為黃曲>白曲>黑曲；糖化力大小為白曲>黃曲>黑曲。從三種不同感官特性醬香型大曲中分離78 株霉菌，經鑒定為6 個屬13 種。在三種大曲中均鑒定出宛氏擬青霉Paecilomyces variotii和傘枝橫梗霉Lichtheimia corymbifera，Lichtheimia ornata存在于白曲和黃曲中，Paecilomyces subglobosus存在于白曲和黑曲中，分枝橫梗霉Lichtheimia ramosa存在于黃曲和黑曲中；黃曲中鑒定出的特有菌株為中間曲霉Aspergillus intermedius和Lichtheimia hongkongensis，白曲中鑒定出的特有菌株為緩慢產黃青霉Penicillium tardochrysogenum、Epicoccum endophytica和Penicillium chrysogenum，僅在黑曲中鑒定出的菌株為短柄帚霉Scopulariopsis brevicaulis、Aspergillus sydowii和Aspergillus quadrilineatus。分析不同感官特性醬香型大曲霉菌群落結構與大曲理化指標之間的關系，結果表明，糖化力、液化力、酯化力和發酵力的主要菌屬均為橫梗霉屬Lichtheimia。

本研究初步揭示了三種不同感官特性醬香型大曲理化指標和霉菌鑒定之間的關聯性，進一步掌握了三種醬香型大曲中的霉菌生物信息，為進一步醬香大曲中功能性微生物的研究奠定基礎，并為強化醬香大曲發酵性能提供數據支撐。