玉米麩皮阿拉伯木聚糖復合納米載體負載香草醛及其抑菌性能研究

安 迪，蔡 翔，呂雯欣，陸雅琦，李 丹，馬福敏

（長春大學農產品加工省高校重點實驗室，吉林長春 130022）

香草醛，又名4-羥基-3-甲氧基苯甲醛，是一種天然有機化合物，具有多種生物活性，如抗氧化性、抗菌性、抗病毒性和抗炎性等，作為食品香精、保鮮劑、抗氧化劑等廣泛應用于食品領域[1-2]。香草醛的分子結構中的酚羥基和醛基可與細菌相互作用，抑制細菌的生長，對食品腐敗菌革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均有活性，因此可作為一種食品防腐劑應用于食品加工與保藏[3]。然而，香草醛的穩定性和水溶性較差，使得香草醛的生物活性不能得到充分發揮，這極大地影響了香草醛的應用范圍[4]。

納米遞送體系是采用納米級載體包裹待遞送的物質，以提高包裹活性物質的功能特性的混合體系。該體系具有控制釋放速度、減少食品中營養成分損耗的緩釋性優點，從而起到增強傳遞效率的作用。多糖或蛋白質常用來作為納米載體，但單一多糖或蛋白質納米載體的穩定性及生物相容性較低[5]。阿拉伯木聚糖（Arabinoxylan，AX）存在于多種糧食作物的種皮中，親水性強，黏度大，且具有抗氧化和抗炎等多種生物活性，是蛋白質和多肽等生物活性物質理想的載體[6-7]。玉米醇溶蛋白（Zein）存在于玉米胚乳細胞，疏水性強，并具有良好的生物相容性[8-10]，但因其水溶性差，且在高離子強度、高溫等極端條件下易變性，限制了其應用范圍[11-12]。AX 可與Zein 之間通過靜電、疏水與氫鍵作用形成的復合物，增強納米載體的穩定性。Dalmolin 等[4]通過將香草醛負載于聚乳酸納米粒子中，提高了香草醛的穩定性。Li 等[5]將香草醛與殼聚糖交聯制備可以遞送藥物的納米體系，研究發現，此種納米粒子可以精準遞送和釋放藥物，且未來可作為抗癌藥物載體使用。因此，負載香草醛的納米載體具有廣泛的應用前景。

本研究將純化后的玉米麩皮AX 組分（F80-1、F80-2、F90-1 及F90-2）與Zein 復合，制備負載香草醛的納米載體，研究其作為香草醛的運載體時的包埋效果及其對食品中常見的致病菌-單增李斯特菌和大腸桿菌的抑菌效果，為負載香草醛的復合納米載體的穩定性和抗菌性提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米麩皮粗多糖（20%～32%）實驗室自制；玉米醇溶蛋白 國藥集團化學試劑有限公司；香草醛麥克林公司；單糖標準品（木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、阿洛糖，均為色譜純）

德國Dr.Ehrenstorfer 公司；胰酪大豆胨液體培養基（Tryptic Soy Broth，TSB）、胰酪大豆胨瓊脂培養基（Tryptic Soy Agar，TSA）青島科技工業園海博生物技術有限公司；單增李斯特菌（BIO-52964）智立中特（武漢）生物科技有限公司；大腸桿菌O157:H7（CICC21530）吉林農業大學食品科學與工程學院贈與。

GC-14C 氣相色譜儀 日本島津公司；Spectra-Max M3 多功能酶標儀 美國Molecular Devices 公司；FDU-2100 冷凍干燥儀 日本日立公司；DSC Q2000 差示掃描量熱儀 美國TA 公司；HiTrap capto（5 mL×3）離子交換柱 美國GE 公司；AKTA Purifier 型蛋白質純化儀 美國GE 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 AX 的分離純化 將80%和90%醇沉后干燥的玉米麩皮粗多糖配成0.1 g/mL 的溶液，經陰離子交換柱HiTrap capto 分離純化，用20 mmol/L 的Tris-HCl 緩沖液和含有0.5 mmol/L NaCl 的20 mmol/L Tris-HCl 緩沖液梯度洗脫，分別各得到兩個組分多糖[11]。將不同組分的多糖分別收集，濃縮后冷凍干燥，得到四個組分，分別為F80-1、F80-2、F90-1 和F90-2。

1.2.2 單糖組成測定 參考閆光玲等[13]的方法，F80-1、F80-2、F90-1 及F90-2 組分的AX 水溶液（濃度為8 mg/mL），分別用4 mol/L 三氟乙酸（體積比1:1）在110 ℃下水解60 min，水解后樣品中加入50%，w/v 的阿洛糖內標，經NaBH4還原（濃度為200 mg/mL）、乙酸酐酯化后，采用氣相色譜法測定單糖組成。

進樣條件：色譜柱：30 m SupelcoSP-2380 柱（內徑0.25 mm，膜厚度0.2 μm）；載氣：氮氣（N2）；進樣量：4.0 μL；進樣溫度：280 ℃；檢測溫度：280 ℃；程序升溫：初始溫度100 ℃，2 min；10 ℃/min 升至280 ℃，維持10 min；20 ℃/min 降至100 ℃，維持2 min。以阿洛糖為內標，采用內標法結合峰面積歸一化法，采用N2000 色譜工作站對各單糖含量進行定量。

1.2.3 無菌納米載體的制備 根據Yuan 等[14]的方法，采用反溶劑沉淀法制備納米載體。稱取Zein 和香草醛（質量比為10:1）溶于乙醇溶液（80%，V/V）中，以500 r/min 的速度攪拌8 h，得到橙黃色澄清溶液，于4 ℃條件下保存備用。

稱取F80-1、F80-2、F90-1 及F90-2 溶于無菌水（濃度為5 mg/mL），500 r/min 常溫下攪拌過夜，在無菌環境下用注射器將制備好的Zein 復合香草醛溶液以4:3（m/V）、1:3（V/V）的比例緩慢滴入pH4.0 的多糖溶液中，得到負載香草醛的Zein-AX 分散液。在40 ℃，-1 MPa 條件下，蒸發掉乙醇，2800 r/min 離心10 min，去除未包封的香草醛。

1.2.4 納米載體包封率的測定 將新制備的納米復合載體2800 r/min 下離心10 min，以除去未包封的香草醛沉淀。將收集到的香草醛沉淀溶于2 mL無水乙醇中，經0.22 μm 有機膜過濾后，用酶標儀在320 nm 處測量吸光度。

參照相同條件下制備的香草醛標準曲線方程為y=0.0146x-0.0089（R2=0.9955），代入方程可得到香草醛濃度。包封率計算公式如下：

1.2.5 熒光光譜法測定分子間作用 參照Li 等[15]的方法，并進行適當改進。F80-1、F80-2、F90-1 和F90-2 與Zein 制備的復合納米載體經適當稀釋后，熒光光譜激發波長設置為280 nm，狹縫寬度為5 nm，掃描波長范圍為300～370 nm，以水為空白，Zein 包埋香草醛制成的納米載體作為對照，用去離子水將測量的樣品稀釋到適當的濃度，每個樣品重復測定三次，繪制熒光光譜圖。

對于SCV溫度串級控制系統，根據前述分析，其數學模型可以近似地以一階慣性環節來逼近，考慮SCV水浴系統的過程特性[10-11]，通過測量系統的階躍響應曲線，利用切線法，求得主控對象NG出口溫度和副控對象SCV水浴溫度的數學模型分別為:

1.2.6 差示掃描量熱法（DSC）測定 參照Hosseini等[16]的方法，并進行改進。準確稱取樣品4.0 mg，并將其放入密封的固體坩堝中，以空鋁盤作為對照，使用DSC Q2000 差示掃描量熱儀對F80-1、F80-2、F90-1 和F90-2 與Zein 制備的納米載體進行掃描，掃描溫度為20～120 ℃，掃描速度為10 ℃/min，氮氣流速20 mL/min，每個樣品重復掃描三次。

1.2.7 單增李斯特菌和大腸桿菌菌株的培養 單增李斯特菌于胰酪大豆胨液體培養基（Tryptic Soy Broth，TSB）中進行活化，傳代三次以獲得穩定菌落數，稀釋一定倍數使菌落數在（1～2.5）×105CFU/mL，涂布在胰酪大豆胨瓊脂培養基（Tryptic Soy Agar，TSA）平板上計數，將稀釋后的單增李斯特菌在37 ℃、150 r/min 的條件下培養18 h。大腸桿菌的培養方法同單增李斯特菌培養方法。

1.2.8 復合納米載體抑菌性能的測定

1.2.8.1 復合納米載體對單增李斯特菌的抑制作用

依據Cava-roda 等[17]的方法，并進行改進。香草醛對照組取150 μL TSB 培養基、100 μL 香草醛貯備溶液（2800 mg/L，pH6）和50 μL 單增李斯特菌于已滅菌的96 孔板中混勻，37 ℃、595 nm 下測定24 h的OD 值，每小時讀數一次。無菌對照組取150 μL培養基，陽性對照組取150 μL 培養基和50 μL 單增李斯特菌混勻；實驗組分別取150 μL 培養基、100 μL復合納米載體和50 μL 單增李斯特菌加入已滅菌的96 孔板中混勻，37 ℃、595 nm 下測定24 h 的OD值，每小時讀數一次，每個樣品重復測定三次，繪制生長曲線。

1.2.8.2 復合納米載體對大腸桿菌的抑制作用 方法同1.2.8.1。

1.3 數據處理

采用SPSS 23.0 和Origin 2021 軟件進行數據分析及繪圖，數據結果以平均值±標準差表示，統計差異通過單因素方差分析（ANOVA）確定，P<0.05 表示差異顯著，具有統計學意義，樣品重復測定三次。

2 結果與分析

2.1 單糖組成分析

通過氣相色譜法測定經上述陰離子交換色譜純化后的四個組分的單糖組成，結果如圖1 和表1 所示。

圖1 不同組分AX 氣相色譜圖Fig.1 Gas chromatogram of different components AX

AX 中主要為阿拉伯糖和木糖，由圖1 及表1 可知，四個組分中阿拉伯糖和木糖含量較高，兩種單糖組成之和分別為67.41%、76.12%、77.16%和84.89%，F90 的阿拉伯糖和木糖總含量顯著高于F80（P<0.05）。Li 等[18]的試驗表明AX 在乙醇中具有良好的溶解性，并且阿拉伯糖與木糖含量與乙醇濃度呈正相關。當使用90%乙醇進行沉淀時，AX 能夠沉淀出較高含量的阿拉伯糖和木糖。相比之下，使用80%乙醇進行沉淀時，乙醇濃度相對較低，導致沉淀出的阿拉伯糖和木糖也相對較少。

阿拉伯糖與木糖的含量比（A/X）可近似代表阿拉伯木聚糖的分支度，各組分的A/X 分別為0.69、0.65、0.75 和0.95，F90 組分的分支度顯著高于F80組分（P<0.05），且F90-2 最高。AX 的分支度指的是分子中側鏈的數量和結構，分支度高意味著分子中有更多的側鏈，這些側鏈可以增加分子的分支結構，增加空間位阻，孔隙結構增多，包裹性增強[19]。

2.2 包封率分析

玉米麩皮AX 復合納米載體對香草醛的包封率如圖2 所示。

由圖2 可知F80-1、F80-2、F90-1、F90-2 組分制備的復合納米載體包封率分別為81.18%、69.36%、86.80%和88.48%。Kwon 等[20]采用大豆蛋白分離物和麥芽糊精包裹香草醛制作的復合納米載體包封率為58.6%，由此可以看出采用玉米麩皮多糖和玉米醇溶蛋白復合后作為壁材包裹性更好，包封率更高。有研究表明，多糖的高分支度和鼠李糖含量，使其具有較高的乳化性能[21-23]。結合表1，F90-1 和F90-2 中的鼠李糖含量高，F90-1、F90-2 組分制備的復合納米載體的包封率高；F80-1 中的鼠李糖含量雖然低于F80-2，但其分支度較F80-2 高，因此F80-1 組分制備的復合納米載體包封率高于F80-2 復合納米載體。

2.3 熒光光譜分析

熒光光譜可以用來檢測多糖與蛋白結合的熒光強度變化，上述復合納米體系在300～370 nm 下的發射光譜如圖3 所示。由圖3 可知，AX 的加入，導致熒光光譜最大吸收峰明顯降低，F90-1、F80-1 和F80-2 與Zein 裝載香草醛制備的納米載體的最大吸收峰從330 nm 移至320 nm，表明AX 與Zein 和香草醛之間存在相互作用，香草醛的芳香環與AX 和Zein 結合，復合納米載體的疏水性降低，致使發生熒光猝滅現象[24-25]。此外，相比于對照組，F90-2 與Zein 裝載香草醛制備的納米載體熒光強度最低，其次為F90-1、F80-1 和F80-2 與Zein 裝載香草醛制備的納米載體，結合單糖組成分析，推測是由于F90-2組分阿拉伯糖和木糖總含量較高，分支度也相對較大，因此可能導致和Zein 的疏水相互作用增強，所以熒光強度顯著下降。

圖3 不同組分復合納米載體的熒光光譜圖Fig.3 Fluorescence spectra of composite nanocarriers with different components

2.4 DSC 分析

采用DSC 對F80-1、F80-2、F90-1 及F90-2 與Zein制成的復合納米載體包埋香草醛所得納米體系進行熱力學分析，結果如圖4 所示。由圖4A 可知，香草醛放熱效應的最大溫度點在83 ℃，與Hasanvand等[25]的研究相同，證明了香草醛在81～83 ℃會出現結晶現象。圖4C～F 可以看出，香草醛的特征峰消失，表明香草醛被包裹在納米載體中，并以無定形的形式存在[26]。這一觀點在Dalmolin 等[4]的研究中也得到了驗證，香草醛在81.64 ℃出現吸熱峰，包封后此吸熱峰消失，說明香草醛被封裝在納米載體中。圖4B 可以看出，Zein 的吸熱峰在104 ℃，說明蛋白質在此溫度下發生變性，在圖4C～F 中均未發現此峰值，這可能是因為AX 存在大量的親水基團，與Zein復合后降低了其疏水性，使其不易在高溫下變性，提高了其熱穩定性[27]。

圖4 不同組分復合納米載體DSC 掃描圖Fig.4 DSC scanning diagram of composite nanocarriers with different components

2.5 各組分復合納米載體抑菌性能分析

圖5 可以看出，F80-2 組分與Zein 裝載香草醛制備的復合納米載體抑制單增李斯特菌效果最好，其次為F90-1、F90-2、F80-1 與Zein 裝載香草醛制備的復合納米載體和游離的香草醛，復合納米載體的抑菌活性高于香草醛的抑菌活性，可能是因為復合納米載體提高了香草醛的穩定性。

圖5 不同組分復合納米載體抑制單增李斯特菌效果圖Fig.5 Effect diagram of composite nanocarriers with different components for inhibit Listeria

由圖6 可以看出，F90-2 組分與Zein 裝載香草醛復合納米載體對大腸桿菌的抑制作用最好，其次為游離香草醛、F80-2、F90-1 和F80-1 組分與Zein 裝載香草醛復合納米載體，這可能是由于復合納米載體可能在進入大腸桿菌細胞時面臨滲透性和內部釋放等問題，與游離的香草醛相比，復合納米載體可能在穿過細菌細胞膜或進入細胞質時遇到障礙，從而降低其抑制效果[17,28]。

圖6 不同組分復合納米載體抑制大腸桿菌效果圖Fig.6 Effect diagram of composite nanocarriers with different components for inhibit E.coli

復合納米載體對單增李斯特菌抑制效果更好的原因可能是由于單增李斯特菌屬于革蘭氏陽性菌，其結構與革蘭氏陰性菌的大腸桿菌不同，因此復合納米載體抑菌效果不同。Jay 等[29]研究表明，香草醛對革蘭氏陽性菌的抑菌效果比革蘭氏陰性菌更有效。Fitzgerald 等[30]的研究證實單增李斯特菌對香草醛的敏感性高于大腸桿菌，且驗證了香草醛的抗菌作用。可能是這些因素共同作用，使負載香草醛的復合納米載體對單增李斯特菌的抑制效果優于大腸桿菌。

3 結論

本研究采用純化后的玉米麩皮阿拉伯木聚糖（F80-1、F80-2、F90-1、F90-2）和Zein 復合制備負載香草醛的納米載體，通過氣相色譜法分析出不同組分AX 的單糖組成，其中阿拉伯糖和木糖總含量最高，通過測定包封率得出四個組分復合納米載體的包封率分別為81.18%、69.36%、86.80%和88.48%，熒光光譜法證明Zein 與AX 發生相互作用，差示掃描量熱法證明香草醛包封在復合納米載體中，提高了香草醛的熱穩定性。抑菌試驗可以證明，F80-2 組分復合納米載體抑制單增李斯特菌效果最好，F90-2 復合納米載體抑制大腸桿菌效果優于游離香草醛，因此AX 復合納米載體在抑制單增李斯特菌和大腸桿菌方面具有實用價值，擴大了食品工業中的應用范圍。